CN113999850A

CN113999850A - 马铃薯u6 rna聚合酶iii型启动子及其克隆与应用

Info

Publication number: CN113999850A
Application number: CN202111390729.0A
Authority: CN
Inventors: 李有涵; 郭华春; 王琼; 马艳颖
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2021-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-11-23
Also published as: CN113999850B; CN117402874A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及马铃薯U6 RNA聚合酶III型启动子，更具体涉及StU6 4‑1和StU6 8‑1基因启动子,并进一步公开其克隆方法与应用。本发明在马铃薯中克隆获得两种马铃薯RNA聚合酶III型启动子StU6 4‑1和StU6 8‑1，它们具有高效转录活性，可驱动下游sgRNA表达，并通过本氏烟草叶片瞬时转化和马铃薯稳定转化体系，分别验证了这两种启动子的活性及其应用于马铃薯CRISPR/Cas9基因编辑的可行性，实现了CRISPR/Cas9引导的马铃薯基因组编辑。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于马铃薯，还可应用于烟草等其它茄科作物。

Description

马铃薯U6 RNA聚合酶III型启动子及其克隆与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及植物转基因技术领域，更具体涉及马铃薯U6启动子的克隆和应用。

背景技术

马铃薯（Solanum tuberosum）是全球第四大粮食作物，仅次于水稻、玉米和小麦。马铃薯栽培种主要是四倍体（2n=4x=48），通过块茎进行营养繁殖，是自交作物，但又具有自交衰退和自交不亲和的特性。马铃薯主要以传统的杂交育种来进行品种选育，即利用配合力较好的亲本配制杂交组合，对所获得的实生种子后代进行性状鉴定，进而选育新品种。故此，马铃薯新品种的选育周期较长，选育性状有较强的随机性，较难兼顾产量、品质和抗逆性等重要性状。迫切需要高效的技术来对马铃薯进行遗传改良。

在2013年初，CRISPR/Cas9技术（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeat -associated protein 9）被开发并成功应用于动物细胞的基因编辑（Cong et al., 2013; Ran et al., 2013）。由于其具有编辑效率高、操作简便和脱靶率低等优点，在2013年就已有多个用于植物基因编辑的CRISPR/Cas9***得到开发和应用（Miaoet al., 2013; Jiang et al., 2013; Shan et al., 2013），随后植物CRISPR/Cas9***得到了快速发展和运用。虽然CRISPR/Cas9技术已广泛用于作物功能基因和遗传改良研究，但大多数相关研究主要集中于二倍体作物。一些重要的粮食作物和经济作物的基因组为多倍体，这对CRISPR/Cas9***的效率提出了更高的要求。目前，CRISPR/Cas9技术已可用于小麦、柳枝稷、大豆和草莓等多倍体作物性状的遗传改良（Wang et al., 2014；Cai et al.,2018；Liu et al., 2018；Martín-Pizarro et al., 2019）。因此，开发高效的四倍体马铃薯栽培种的CRISPR/Cas9技术，不仅有助于马铃薯基因功能的研究，也为将来马铃薯基因工程遗传改良提供新工具。

在CRISPR/Cas9***中，U6 snRNA（Small nuclear RNA）启动子是一类细胞核内的RNA聚合酶III型启动子，常被用于驱动sgRNA在细胞核内表达。U6启动子具有一定的物种特异性，在基因编辑过程中，使用植物物种本身的内源U6启动子能够有更高的编辑效率。目前，能够用于马铃薯基因编辑的内源U6启动子研究较少，仍缺少适用的马铃薯U6启动子，这限制了马铃薯基因编辑技术的应用。因此，筛选和研究马铃薯中高活性的U6启动子对马铃薯的基因工程遗传改良有重要的推进作用。

发明内容：

为此，本发明的目的在于提供两种马铃薯U6启动子StU6 4-1和StU6 8-1，并进一步公开其克隆方法和应用。

本发明提供的马铃薯U6启动子包括StU6 4-1和/或StU6 8-1；StU6 4-1启动子含有SEQ ID No:1所示的DNA核苷酸序列；StU6 8-1启动子含有SEQ ID No:2所示的DNA核苷酸序列。

StU6 4-1启动子来源于马铃薯第4染色体；StU6 8-1启动子来源于马铃薯第8染色体。

本发明还公开了两种用于构建马铃薯基因编辑载体的sgRNA表达盒载体，即含有马铃薯U6启动子StU6 4-1或/和StU6 8-1。

具体的，该马铃薯sgRNA表达盒载体为重组质粒StU6 4-1-sgRNA和/或StU6 8-1-sgRNA。

本发明还提供了一种克隆上述马铃薯StU6 4-1启动子或StU6 8-1启动子的特异性引物：

针对启动子StU6 4-1的特异性引物如下：

StU6 4-1pF：GGGCTTCACTGTGAATTTAG，

StU6 4-1pR：CAAACACATATGTTGTTGTTGA；

针对述启动子StU6 8-1的特异性引物如下：

StU6 8-1pF：AATTGACGGGTAGACATCA，

StU6 8-1pR：CAGACATATAGGTTAATGTTTTG。

克隆方法，包括以下步骤：

（1）以马铃薯栽培品种‘青薯9号’叶片基因组DNA为模板，采用StU6 4-1或StU6 8-1的特应性引物进行PCR扩增，使用高保真酶PhantaR Max在25 μL反应体系PCR扩增，PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环，然后72℃5min；将所得PCR产物经过琼脂糖切胶纯化；

（2）将纯化后的PCR产物克隆到pEASYR-Blunt克隆载体上，转入大肠杆菌DH5α中，并挑取单克隆提取质粒进行测序分析，获得466 bp StU6 4-1基因启动子片段（如SEQ IDNo:1所示）和511 bp StU6 8-1基因启动子片段（如SEQ ID No:2所示）。

本发明还提供了一种用于马铃薯基因编辑载体的sgRNA表达盒载体的构建方法，包括如下步骤：

（1）以SEQ ID No:1所示的StU6 4-1基因启动子序列或SEQ ID No:2所示的StU68-1基因启动子序列为模板，利用以下含同源臂的引物对StU6 4-1基因启动子或StU6 8-1基因启动子进行PCR扩增：

StU6 4-1gF：GTGGAATCGGCAGCAAAGGAGGGCTTCACTGTGAATTTAG；

StU6 4-1gR：TGTTATCTTCAGAGGTCTCTCAAACACATATGTTGTTGTTGA；

StU6 8-1gF：GTGGAATCGGCAGCAAAGGAAATTGACGGGTAGACATCA；

StU6 8-1gR：TGTTATCTTCAGAGGTCTCTCAGACATATAGGTTAATGTTTTG；

对PCR产物进行纯化，获得含同源臂的StU6 4-1基因启动子片段和含同源臂的StU6 8-1基因启动子片段；

（2）以pYLsgRNA-AtU6-1质粒为模板，以引物sgRNA-F和sgRNA-R进行PCR，对pYLsgRNA-AtU6-1质粒中的AtU6-1基因启动子进行删除和质粒线性化处理，引物序列如下：

sgRNA-F：AGAGACCTCTGAAGATAACA；

sgRNA-R：TCCTTTGCTGCCGATTCCAC；

使用高保真酶PhantaR Max在25 μL反应体系中进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃3：30s，30个循环，然后72℃5min；将所得PCR产物经过琼脂糖切胶纯化，获得线性化的pYLsgRNA质粒；

（3）用ExnaseRII重组酶将步骤（1）所述含同源臂的StU6 4-1基因启动子片段或含同源臂的StU6 8-1基因启动子片段重组到步骤（2）所述线性化的pYLsgRNA质粒中，得到马铃薯基因编辑载体所用的sgRNA表达盒载体StU6 4-1-sgRNA或StU6 8-1-sgRNA。

上述马铃薯U6启动子StU6 4-1和/或StU6 8-1在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。茄科植物包括烟草、马铃薯。马铃薯StU6 4-1启动子和StU68-1启动子具有转录活性，可驱动下游sgRNA表达，并实现了马铃薯内源U6启动子驱动的本氏烟草和马铃薯基因的定向编辑，并且可对靶向基因进行单位点或多位点的基因编辑。

上述sgRNA表达盒载体在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。茄科植物包括烟草、马铃薯。

有益效果：

本发明克隆了两个新的马铃薯U6启动子，并构建了马铃薯基因编辑所用的StU64-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA表达盒载体，通过上述两个载体构建了本氏烟草NbPDS和马铃薯StPDS基因编辑载体。本氏烟草叶片瞬时转化和马铃薯茎段胚性愈伤稳定转化，验证了两个U6启动子的活性及其应用于烟草和马铃薯CRISPR/Cas9技术的可行性，实现了对马铃薯和烟草目标基因的单靶位点和多靶位点CRISPR/Cas9基因编辑，进而实现对马铃薯或其它茄科作物高效且有目的性的进行遗传改良和种质创新。在基因编辑操作中，StU6 4-1和StU6 8-1启动子可分别用于单靶点-sgRNA的驱动表达（如实例3），也可用于多个靶点-sgRNA的驱动表达（如实例4），即可实现基因单靶位点编辑或多基因（多靶位点）基因编辑。

附图说明：

图1：从马铃薯叶片基因组中克隆出的StU6 4-1启动子和StU6 8-1启动子。

图2：通过同源重组方法构建的StU6 4-1-sgRNA载体和StU6 8-1-sgRNA载体示意图。

图3：StU6 4-1-sgRNA载体和StU6 8-1-sgRNA载体的Bsa I酶切鉴定。

图4：用于本氏烟草NbPDS基因编辑的载体示意图，图中核酸序列为NbPDS的基因编辑靶点。

图5：本氏烟草NbPDS基因编辑序列突变的测序峰图和测序结果；测序结果显示StU6 4-1/NbPDS-Cas9和StU6 8-1/NbPDS-Cas9载体的转化能够引起NbPDS基因序列发生碱基缺失突变。

图6：用于马铃薯StPDS基因编辑的载体示意图，图中T1和T2分别代表由两个马铃薯U6启动子驱动的基因编辑靶标序列。

图7：马铃薯StPDS基因编辑序列突变的测序峰图和测序结果。测序结果显示StPDS-Cas9载体转入马铃薯茎段胚性愈伤后，使马铃薯StPDS基因序列发生改变，两个基因编辑靶标位点都发生了碱基的缺失或***突变。

具体实施方式：

为了进一步理解本发明，下面结合实施实例对本发明提供的两种马铃薯U6启动子及其克隆与应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施实例的限制。

实施例1：

马铃薯两种U6基因启动子StU6 4-1和StU6 8-1的获得，其具体步骤如下：

1、利用拟南芥AtU6-1基因序列在马铃薯基因组数据库（http://spuddb.uga.edu/dm_v6_1_download.sht-ml）中进行BlastN比对，找出马铃薯中典型的U6基因序列。典型马铃薯U6 基因序列与拟南芥AtU6-1基因序列相比仅有3个SNP的差异，说明U6基因序列在马铃薯和拟南芥之间是较为保守的。马铃薯U6基因启动子序列和拟南芥AtU6-1基因启动子序列均具有典型的TATA box和USE motif这两种典型的顺式作用元件。最终选择了StU6 4-1和StU6 8-1启动子进行克隆。

2、在StU6 4-1和StU6 8-1启动子参考序列中设计引物进行序列克隆。

针对StU6 4-1启动子克隆设计以下引物：

StU6 4-1pF：GGGCTTCACTGTGAATTTAG；

StU6 4-1pR：CAAACACATATGTTGTTGTTGA；

针对启动子StU6 8-1设计如下特异性引物：

StU6 8-1pF：AATTGACGGGTAGACATCA；

StU6 8-1pR：CAGACATATAGGTTAATGTTTTG；

3、利用上述引物，以马铃薯栽培品种‘青薯9号’叶片基因组DNA为模板，用高保真酶PhantaR Max进行PCR扩增。PCR反应体积为25 μL。PCR反应程序为95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环，然后72℃5min；将所得PCR产物经过琼脂糖切胶纯化（如图1所示）。将纯化过的PCR片段连入pEASYR-Blunt克隆载体，转入大肠杆菌DH5α中，并挑取单克隆菌落，提取阳性克隆菌液中的质粒进行测序分析。获得如序列SEQ ID No:1所示的466 bpStU6 4-1基因启动子片段和SEQ ID No:2所示的511 bp StU6 8-1基因启动子片段。

实施例2：

马铃薯StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA表达盒载体的构建，其具体步骤如下：

1、以SEQ ID No:1所示的466 bp StU6 4-1基因启动子片段和SEQ ID No:2所示的511 bp StU6 8-1基因启动子片段为模板，设计以下含同源臂的引物分别对StU6 4-1基因启动子和StU6 8-1基因启动子进行PCR扩增：

StU6 4-1gF：GTGGAATCGGCAGCAAAGGAGGGCTTCACTGTGAATTTAG；

StU6 4-1gR：TGTTATCTTCAGAGGTCTCTCAAACACATATGTTGTTGTTGA；

StU6 8-1gF：GTGGAATCGGCAGCAAAGGAAATTGACGGGTAGACATCA；

StU6 8-1gR：TGTTATCTTCAGAGGTCTCTCAGACATATAGGTTAATGTTTTG；

2、用高保真酶PhantaR Max进行PCR扩增。PCR反应体积为25 μL。PCR反应程序为95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环，然后72℃5min；将所得PCR产物经过琼脂糖切胶纯化。

3、以pYLsgRNA-AtU6-1质粒为模板，设计引物sgRNA-F和sgRNA-R进行PCR，对pYLsgRNA-AtU6-1质粒中的AtU6-1基因启动子进行删除和质粒线性化处理，引物序列如下：

sgRNA-F：AGAGACCTCTGAAGATAACA；

sgRNA-R：TCCTTTGCTGCCGATTCCAC；

用高保真酶PhantaR Max进行PCR扩增。PCR反应体积为50 μL。PCR反应程序为95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃3：30min，30个循环，然后72℃5min；将所得PCR产物经过琼脂糖切胶纯化，获得线性化的pYLsgRNA质粒片段。

4、将步骤2所获的含同源臂序列的StU6 4-1启动子片段和StU6 8-1启动子片段，通过同源重组反应分别连入步骤3所获得的线性化的pYLsgRNA质粒。同源重组反应利用ExnaseRII重组酶进行，反应体积为20 μL，反应体系为ExnaseRII重组酶 2 μL，5×CEbuffer 4 μL，线性化的pYLsgRNA质粒2 μL，含同源臂U6启动子片段1 μL，ddH₂O 11 μL。同源重组反应在37℃下进行40min，冰上2min。然后将10 μL同源重组产物转入大肠杆菌DH5α中，并挑取单克隆菌落，提取阳性克隆菌液中的质粒进行测序分析。获得马铃薯StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA表达盒载体。

5、通过同源重组构建好的StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA表达盒载体应该分别含有3个Bsa I酶切位点（如图2所示），因此通过对StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA表达盒载体进行Bsa I酶切来鉴定载体准确性。经过Bsa I单酶切反应，StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA表达盒载体均可被消化为3个条带，与理论预期相符（如图3所示），更进一步说明两种马铃薯U6启动子表达盒载体构建的准确性。

实施例3：

本氏烟草NbPDS基因编辑载体构建和NbPDS基因序列突变，其具体步骤如下：

1、NbPDS基因编辑靶位点设计和靶点接头制备

根据本氏烟草NbPDS基因序列，选择TACGAGAACTGCAGTCCACG为靶标位点序列，根据该序列设计靶点接头引物对：

针对与StU6 4-1启动子相连的靶点设计以下引物对：

NbPDS-4-F：TTTGTACGAGAACTGCAGTCCACG；

NbPDS-4-R：AAACCGTGGACTGCAGTTCTCGTA；

针对与StU6 8-1启动子相连的靶点设计以下引物对：

NbPDS-8-F：TCTGTACGAGAACTGCAGTCCACG；

NbPDS-8-R：AAACCGTGGACTGCAGTTCTCGTA；

将上述接头引物溶解成100 μM母液，按照配对引物各取1 μL加入到98 μL 0.5×TE混合稀释到1 μM。90℃ 30 s，室温冷却完成退火。

2、取StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA质粒各1 μg，在25 μL反应用10 U Bsa I酶切20min，-20℃冷冻保存酶切产物。

3、本氏烟草NbPDS单靶点基因编辑载体构建

用T4 DNA连接酶将步骤1获得的靶点接头和步骤2所获得的StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA质粒酶切产物分别进行连接，分别获得StU6 4-1启动子-靶点-sgRNA和StU6 8-1启动子-靶点-sgRNA的片段。利用‘边切边连’的方法（Ma et al.,2015），将StU64-1启动子-靶点-sgRNA和StU6 8-1启动子-靶点-sgRNA的片段分别连入35S-Cas9-Kana载体中，最终获得StU6 4-1/NbPDS-Cas9和StU6 8-1/NbPDS-Cas9两种单靶点NbPDS基因编辑载体。

4、本氏烟草叶片瞬时转化NbPDS基因编辑载体

将StU6 4-1/NbPDS-Cas9和StU6 8-1/NbPDS-Cas9基因编辑载体通过冻融法分别转入农杆菌LBA4404中。对含StU6 4-1/NbPDS-Cas9和StU6 8-1/NbPDS-Cas9基因编辑载体的LBA4404菌液进行摇菌，用菌液注射缓冲液调整菌液浓度为OD₆₀₀=1.0，用注射器吸取适量农杆菌菌液，从本氏烟草叶片下表皮注射入叶片内部。在注射本氏烟草叶片5天后，对叶片注射部位的NbPDS基因靶标序列进行测序分析。

5、NbPDS基因靶位点序列的测序分析

利用CTAB法提取本氏烟草叶片DNA，用以下引物：

NbPDS-F：GGAAGTGGCTGAACGATAT；

NbPDS-R：TCACCATGCTAAACTACGC；

对瞬时转化后的本氏烟草叶片中的NbPDS基因片段进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化。以引物NbPDS-F对PCR产物进行Sanger测序，若测序结果在靶位点附近显示嵌套峰，则认为NbPDS基因靶位点发生了基因编辑（如图5所示）。将已发生基因编辑的NbPDS基因片段连入pEASYR-Blunt克隆载体，再转入大肠杆菌DH5α中，并挑取单克隆菌落，提取阳性克隆菌液中的质粒进行测序分析。通过与野生型NbPDS基因序列比对，分析转化StU6 4-1/NbPDS-Cas9和StU6 8-1/NbPDS-Cas9基因编辑载体的叶片中NbPDS靶位点具体的突变方式。如图5所示，StU6 4-1/NbPDS-Cas9和StU6 8-1/NbPDS-Cas9基因编辑载体的转化均能导致NbPDS基因靶位点发生基因编辑，基因编辑类型为碱基缺失。

实施例4：

马铃薯StPDS双靶点基因编辑载体构建和StPDS序列突变，其具体步骤如下：

1、StPDS基因序列的克隆

通过CTAB法提取马铃薯品种‘青薯9号’叶片基因组DNA。根据马铃薯StPDS基因参考序列设计以下引物：

StPDS-F：ATGCCTCAAATTGGACTTGT；

StPDS-R：TATGAAACAGACCCTACCCC；

利用上述引物，应用高保真酶PhantaR Max，以马铃薯叶片DNA为模板，在25 μL体系中进行PCR扩增。PCR反应程序为95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃1：30min，30个循环，然后72℃5min；PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测和切胶纯化。利用引物StPDS-seqF和StPDS-seqR对PCR产物进行Sanger测序，引物序列如下：

StPDS-seqF：GGCTTGCAAAATACTGTACT；

StPDS-seqR：GCTTCCTTCGAAATAAAGCA；

最终获得StPDS基因序列信息。

2、StPDS基因编辑靶位点设计和靶点接头制备

根据步骤1所获得的StPDS基因序列，选择了两个基因编辑靶位点，分别是位于第一外显子的序列T1：CCATGCCACGACCAGAAGAT，位于第三外显子的序列T2：AACCGATACTACTGGAGGCA。根据T1和T2序列设计靶点接头引物：

针对与StU6 4-1启动子相连的T1靶点设计以下引物对：

StPDS-4-F：TTTGCCATGCCACGACCAGAAGAT；

StPDS-4-R：AAACATCTTCTGGTCGTGGCATGG；

针对与StU6 8-1启动子相连的T2靶点设计以下引物对：

StPDS-8-F：TCTGAACCGATACTACTGGAGGCA；

StPDS-8-R：AAACTGCCTCCAGTAGTATCGGTT；

3、取StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA质粒各1 μg，在25 μL反应用10 U Bsa I酶切20min，-20℃冷冻保存酶切产物。

4、马铃薯StPDS双靶点基因编辑载体构建

用T4 DNA连接酶将步骤2获得的靶点接头和步骤3所获得的StU6 4-1-sgRNA和StU6 8-1-sgRNA质粒酶切产物分别进行连接，分别获得StU6 4-1启动子-靶点T1-sgRNA和StU6 8-1启动子-靶点T2-sgRNA的片段。利用‘边切边连’的方法（Ma et al.,2015），将StU64-1启动子-靶点T1-sgRNA和StU6 8-1启动子-靶点T2-sgRNA的片段依次连入35S-Cas9-Kana载体中，最终获得StPDS-Cas9双靶点基因编辑载体，其中T1靶位点-sgRNA由StU6 4-1启动子驱动，T2-靶点位点-sgRNA由StU6 8-1启动子驱动（如图6所示）。

5、马铃薯茎段愈伤稳定转化

将StPDS-Cas9双靶点基因编辑载体通过冻融法转入农杆菌LBA4404中。对含StPDS-Cas9载体的LBA4404菌液进行摇菌，用MS液体培养基悬浮菌体至菌液浓度OD₆₀₀=0.5。以马铃薯品种D187组培苗茎段为外植体，进行农杆菌侵染。茎段外植体经过2d共培养，在含Kana的抗性愈伤诱导培养基上培养约30d，再在含Kana的丛生芽诱导培养基上培养约30d。最终获得处于分化时期的胚性抗性愈伤组织。

6、StPDS基因靶位点序列的测序分析

利用CTAB法提取马铃薯茎段胚性抗性愈伤DNA，用StPDS-F和StPDS-R引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化。以引物StPDS-seqF和StPDS-seqR分别对StPDS靶位点T1和T2进行Sanger测序，若测序结果在靶位点附近显示嵌套峰，则认为StPDS基因靶位点发生了基因编辑（如图7所示）。将已发生基因编辑的StPDS基因片段连入pEASYR-Blunt克隆载体，再转入大肠杆菌DH5α中，并挑取单克隆菌落，提取阳性克隆菌液中的质粒进行Sanger测序分析。通过与野生型StPDS基因序列比对，分析转化StPDS-Cas9基因编辑载体的抗性愈伤中StPDS靶位点具体的突变方式。如图7所示，StPDS-Cas9基因编辑载体的转化均能导致马铃薯抗性愈伤中StPDS基因T1和T2两个靶位点发生基因编辑，基因编辑类型为碱基缺失或碱基***。

可见，本发明获得的马铃薯StU6 4-1启动子和StU6 8-1启动子具有转录活性，可驱动下游sgRNA表达，并实现了马铃薯内源U6启动子驱动的本氏烟草和马铃薯基因的定向编辑，并且可对靶向基因进行单位点或多位点的基因编辑；基因编辑后对靶位点克隆序列测序结果发现突变类型包括了碱基***和碱基缺失。因此本发明所述两个马铃薯内源U6启动子不仅可应用于马铃薯，还可应用于烟草的CRISPR/Cas9基因编辑体系，从而实现对烟草和马铃薯等茄科作物高效精准的性状遗传改良。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此作为本发明专利范围的限制。应当指出，在本发明技术领域的技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可做出若干改进，这些改进也应当视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南农业大学

<120> 马铃薯U6 RNA聚合酶III型启动子及其克隆与应用

<130> 2021-09-24

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 466

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<400> 1

agttgcaggt agcatggcca atttgaaaaa acgagaaatg aacagtagat ataactcatc 60

aatagcagta ctctactcct attataaatt gcttttatta tgactgacta aattactcat 120

tttcgtgcta ccatataggc atatcaatta atttctgctc atccttaata aaaataagtg 180

acggccagta ggtaacttct taaaacctcc ttatgataat gattatttta gttgtgggca 240

taaggatatt agtttcgaaa taaaatgtaa aattattatt ttcggtttga ttatgaaaat 300

caatgcatag gatatgccta acttttcaaa ttgcaaaaat caaaccaaat aagaaggccc 360

ggcccattat gtttataagt ccaggcccat acgttatttc tccctcatcg tctgcagaga 420

gaagctttgc tgtgtttata taactcaaca acaacatatg tgtttg 466

<210> 2

<211> 511

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<400> 2

cgaaagagaa aaaatacact atggacgaat atttttatag aattcaatat gtaaaactaa 60

taaacaagaa cttttattca aagtaatgaa gaagaagaat tgaagaaata tttacataat 120

caataaaaaa aaatcattca aaagaatcgt gtgtatgaga aagaagagaa aaaaactact 180

tcccaataaa aaaggacatc atgctgccac ctcctaaaat tatgtaattt aatttttaaa 240

aaaacttccc aatacgtggg ctactatttg caaaatttaa tttttaaaaa cctttttttg 300

tcaagaaaat aaaagatggc tatttgttgc caattagtaa aatgagatgt catgctgtgc 360

cattttttca aaatataaat accagcccat tacagttaat gggctttgct caggcccata 420

ccagcgaaaa cacccaagct agttctccct catcgtctgc agaaagcttc tttgttgtgt 480

ttataaagca aaacattaac ctatatgtct g 511

Claims

1.马铃薯U6启动子序列，其特征在于：所述的马铃薯U6启动子序列为StU6 4-1或StU68-1；StU6 4-1启动子含有SEQ ID No:1所示的DNA核苷酸序列；StU6 8-1启动子含有SEQ IDNo:2所示的DNA核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的马铃薯U6启动子序列，其特征在于：StU6 4-1启动子序列来源于马铃薯第4染色体，StU6 8-1启动子序列来源于马铃薯第8染色体。

3.用于构建马铃薯基因编辑载体的sgRNA表达盒载体，其特征在于：含有权利要求1或2所述的马铃薯U6启动子StU6 4-1或/和StU6 8-1。

4.如权利要求3所述的sgRNA表达盒载体，其特征在于：该sgRNA表达盒载体为重组质粒StU6 4-1-sgRNA和/或StU6 8-1-sgRNA。

5.一种克隆权利要求1或2所述的马铃薯U6启动子的特异性引物，其特征在于：

所述启动子StU6 4-1的特异性引物如下：

StU6 4-1pF：GGGCTTCACTGTGAATTTAG；

StU6 4-1pR：CAAACACATATGTTGTTGTTGA；

所述启动子StU6 8-1的特异性引物如下：

StU6 8-1pF：AATTGACGGGTAGACATCA；

StU6 8-1pR：CAGACATATAGGTTAATGTTTTG；

一种如权利要求3或4所述用于马铃薯基因编辑载体的sgRNA表达盒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以SEQ ID No:1所示的StU6 4-1基因启动子序列或SEQ ID No:2所示的StU6 8-1基因启动子序列为模板，利用以下含同源臂的引物对StU6 4-1基因启动子或StU6 8-1基因启动子进行PCR扩增：

StU6 4-1gF：GTGGAATCGGCAGCAAAGGAGGGCTTCACTGTGAATTTAG；

StU6 4-1gR：TGTTATCTTCAGAGGTCTCTCAAACACATATGTTGTTGTTGA；

StU6 8-1gF：GTGGAATCGGCAGCAAAGGAAATTGACGGGTAGACATCA；

StU6 8-1gR：TGTTATCTTCAGAGGTCTCTCAGACATATAGGTTAATGTTTTG；

sgRNA-F：AGAGACCTCTGAAGATAACA；

sgRNA-R：TCCTTTGCTGCCGATTCCAC；

（3）用ExnaseRII重组酶将步骤（1）所述含同源臂的StU6 4-1基因启动子片段和/或含同源臂的StU6 8-1基因启动子片段重组到步骤（2）所述线性化的pYLsgRNA质粒中，得到马铃薯基因编辑载体所用的sgRNA表达盒载体StU6 4-1-sgRNA和/或StU6 8-1-sgRNA。

6.如权利要求1或2所述的马铃薯U6启动子StU6 4-1和/或StU6 8-1在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。

7.如权利要求3或4所述的sgRNA表达盒载体在茄科植物转基因技术或构建茄科植物基因编辑载体中的应用。

8.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于：茄科植物包括烟草、马铃薯。