CN107779456B

CN107779456B - 蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其在提高种子脂肪酸含量中的应用

Info

Publication number: CN107779456B
Application number: CN201711276665.5A
Authority: CN
Inventors: 韩璐; 周传恩; 蒋洪娇; 周欣
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN107779456A

Abstract

本发明公开了一种蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHEL related homeobox11(MtWOX11)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述基因在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用。通过对遗传转化的方法获得的转基因株系分析证明，过表达该基因可显著提高豆科植物的种子的脂肪酸含量。预示本发明所述的基因具有广泛的应用前景，其实施将会用于豆类品质改良或创造新型豆科经济作物，对我国豆类经济作物生产具有重大意义。

Description

蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其在提高种子脂肪酸含量中的应用

技术领域

本发明涉及WUSCHEL relatedhomeobox(WOX)家族基因及其应用，尤其涉及一种蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHEL relatedhomeobox 11(MtWOX11)及其在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

近年来，随着我国经济水平以及人民生活质量的提高，对大豆的需求也与日俱增。大豆是重要的豆科经济作物之一，其不仅能够提供高蛋白，更主要的是可以提供油分。然而目前我国的大豆品质不高，缺乏市场竞争力，需要大量进口大豆。因此培育高油高蛋白的大豆新品种已成为当前十分迫切的任务。

目前，我国大豆产量和品质改良的研究工作主要集中在常规育种领域，而分子遗传改良还处于起步阶段。其原因主要在于：大豆为四倍体，基因组较大；大豆很难建立起遗传转化体系；大豆很难建立起突变体库，其构建过程比较复杂。因此发掘豆类模式植物并进行研究是解决这一问题的关键所在。

蒺藜苜蓿作为豆科模式植物具有基因组小、自花授粉、遗传转化容易等特点，因此对蒺藜苜蓿种子发育机制进行研究不仅能让我们更好地了解豆科植物种子的发育，还能对提高我国大豆的产量和品质起到指导性的作用。

WUSCHEL relatedhomeobox(WOX)家族基因是植物特有的一类转录因子。该家族基因在植物发育的关键时期起到很重要的调控作用，包括茎和根顶端干细胞的维持，胚胎发育基-顶轴极性模式的建立以及侧生器官的发育等(Schoof et al.,2000；van der Graaffet al.,2009；Ueda et al.,2011)。WOX11基因是WOX家族中的一个成员。经检索，在拟南芥中，WOX11参与到再生根器官的发生。在水稻中，WOX11调控不定根的生长和发育。但检索发现，有关蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHEL relatedhomeobox 11(MtWOX11)核苷酸序列和氨基酸序列还未见报道，其在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用也未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是一种蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHELrelatedhomeobox 11(MtWOX11)及其在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用。

本发明所述的蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHEL relatedhomeobox 11(MtWOX11)，其特征在于：所述基因命名为蒺藜苜蓿MtWOX11基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述蒺藜苜蓿MtWOX11基因在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用。

其中：所述豆科植物优选自苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、三叶草。

利用本发明所述的蒺藜苜蓿MtWOX11基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作导入植物细胞，获得转基因植物。检测表明获得转基因植物的种子中脂肪酸含量得到显著提高。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因MtWOX11的植物表达载体(pEARLYGATE103-MtWOX11)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

实际上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pEARLYGATE103。

本发明利用公开的蒺藜苜蓿突变体库，分离筛选得到了蒺藜苜蓿MtWOX11基因的敲除突变体株系，通过分离研究蒺藜苜蓿MtWOX11基因的敲除突变体株系，利用SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示的引物序列，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆到MtWOX11基因。

检索显示：本发明首次克隆出蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其编码的氨基酸序列，并且通过遗传转化的方法获得过表达MtWOX11的转基因植株。这是MtWOX11基因首次在蒺藜苜蓿中被克隆，并且在蒺藜苜蓿中过表达。转基因株系分析证明，过表达该基因可显著提高豆科植物的种子的脂肪酸含量(图4)。这证明，该基因参与了调控豆科植物苜蓿的种子的脂肪酸含量，对蒺藜苜蓿MtWOX11基因进行植物基因过表达遗传转化操作，可显著提高转基因植物种子的脂肪酸的含量。预示本发明所述的基因具有广泛的应用前景。其实施将会用于豆类品质改良或创造新型豆科经济作物，对我国豆类经济作物生产具有重大意义。

附图说明

图1：蒺藜苜蓿MtWOX11基因分析。

其中WT为蒺藜苜蓿野生型植物作对照，mtwox11为突变体。A：图示蒺藜苜蓿MtWOX11的基因结构及突变体中Tnt1转座子的***位置；B：蒺藜苜蓿MtWOX11基因的RT-PCR结果分析，Actin为基因内参做对照。分子生物学鉴定结果表明，Tnt1***到MtWOX11基因的第二个外显子(图1A)，蒺藜苜蓿MtWOX11基因的编码区CDS为819bp，RT-PCR结果显示Tnt1的***导致MtWOX11不能正常表达(图1B)。

图2：蒺藜苜蓿MtWOX11基因编码的氨基酸序列比对。

蒺藜苜蓿MtWOX11基因编码272个氨基酸的29.92kDa蛋白，具有典型的HOX超家族的“螺旋－环－螺旋－转角－螺旋(helix－loop－helix－turn－helix)”结构域(*号所示)。其中有蒺藜苜蓿中的MtWOX11、拟南芥中的AtWOX11、大豆中的GLYMA19G118400、水稻中的OsWOX11；MtWOX11与AtWOX11的氨基酸相似度为47％，MtWOX11与GLYMA19G118400的氨基酸相似度为60％，MtWOX11与OsWOX11的氨基酸相似度为47％。

图3：蒺藜苜蓿MtWOX11基因的表达模式分析。

qRT-PCR结果表明，MtWOX11基因虽然属于组成性表达，在各器官中均有表达，但在种子中的表达量最高，其次是在花、根、叶中的表达量较高，在茎、叶柄、顶芽中表达量较低。

图4：过表达MtWOX11转基因植株种子的脂肪酸含量分析。

灰色柱状图所示mtwox11突变体与野生型种子中脂肪酸含量的比值，黑色柱状图所示过表达MtWOX11转基因植株与野生型种子中脂肪酸含量的比值。*表示显著差异，AnovaSingle Factor p<0.05，**表示极显著差异，Anova Single Factor p<0.01。结果表明，过表达转基因植株种子中总脂肪酸含量与野生型相比增加了12.2168％，特别是C15.0(十五烷酸)、C15.1(顺-10-十五烯酸)、C16.0(棕榈酸)、C18.2N6C(亚油酸)、C20.2(顺-11，14-二十碳二烯酸)、C20.3N6(顺-8，11，14-二十碳三烯酸)、C20.4N6(花生四烯酸)、C20.5N3(顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、C24.0(二十四烷酸)等脂肪酸的含量在突变体中均有下降，而在过表达MtWOX11转基因株系中均有上升，其中，十五烷酸的含量显著提高。

具体实施方式

实施例1 蒺藜苜蓿MtWOX11基因的克隆和表达分析

1.1蒺藜苜蓿mtwox11突变体的获得和鉴定

通过公开网站https://medicago-mutant.noble.org/mutant/database.php筛选了蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，并利用Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)技术，在22,000个突变体株系中筛选出Tnt1***到MtWOX11基因中的突变体株系。

1.1.1提取蒺藜苜蓿mtwox11的总RNA

(1)将0.1g组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充***解，室温放置5分钟。

(3)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

(4)4℃，12000rpm离心15分钟；

(5)用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；

(6)4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

(7)RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤；4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

(8)重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

(9)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

(10)紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNA Marker作为对照。

1.1.2cDNA反转录

反转录酶：Transcriptor Reverse Transcriptase(Roche)。

(1)13μl反应体系

(2)65℃变性10min，迅速***冰中，然后加入:

(3)轻轻混匀，25℃反应10min；55℃反应30min；

(4)用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.1.3RT-PCR

(1)PCR反应体系(20μl)：

(2)PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。

1.2.蒺藜苜蓿MtWOX11基因的克隆

利用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物序列，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆到MtWOX11基因。蒺藜苜蓿MtWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

利用SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物，扩增MtWOX11基因的全长编码区(CDS)序列。利用Gateway技术将CDS序列连入pEARLEYGATE103载体，然后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。

1.2.1提取蒺藜苜蓿野生型植株种子的Total RNA，方法同上。

1.2.2反转录产生cDNA，方法同上。

1.2.3开放阅读框的克隆和序列测定

引物序列：见附图SEQ ID No.2和SEQ ID No.3

PCR反应体系(50μl)：

PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性30sec，63.5℃复性10sec，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。

扩增片段回收后与pENTR/D-TOPO载体连接并转化大肠杆菌DH5α，测序由铂尚生物技术(上海)有限公司完成。

pENTR/D-TOPO载体连接反应体系:

(1)体系：

DNA(ng):连接片段长度(bp)×0.007

Salt solution：1μl

ddH2O：加至终体积50μl

(2)取以上体系2.5μl加0.5μl的pENTR/D-TOPO载体。

(3)将以上体系22℃连接1小时。

(4)将以上体系转化大肠杆菌DH5α。

1.3.蒺藜苜蓿MtWOX11基因的序列信息

序列信息从http://www.medicagogenome.org/网站获得。蒺藜苜蓿MtWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.4.蒺藜苜蓿MtWOX11基因的表达分析

取蒺藜苜蓿的野生型(R108)的根、茎、叶、花、种子、叶柄、顶芽部位提取RNA进行组织表达分析。

1.4.1RNA的提取

蒺藜苜蓿种子萌发后，取生长16周的苗的根、茎、叶、花、种子、叶柄、顶芽部位，提取RNA，方法同上。

1.4.2反转录(RT)产生cDNA

1.反转录产生cDNA，方法同上。

2.PCR反应及数据处理方法

(1)以cDNA为模板，进行PCR反应。

(2)PCR体系：

(3)PCR程序：

95℃10min；95℃10S，59℃15S，72℃30S，41个循环；65℃-95℃，每隔0.5℃作熔解曲线；10℃保存。

(4)利用熔解曲线判断产物单一性以及溶解温度，利用给出的Ct值采用ΔΔCt算法计算得到目的基因在不同样品中的相对含量。

实施例2、植物表达载体的构建

将MtWOX11全长cDNA序列构建到pENTR/D-TOPO中间载体中，然后通过LR重组将MtWOX11全长CDS序列连接到pEarleyGate103过表达载体中。得到以CaMV35S启动子驱动MtWOX11基因过表达的植物表达载体。

2.1MtWOX11全长CDS序列构建到pENTR/D-TOPO载体中，方法同上。

2.2LR重组连接到pEarleyGate103过表达载体。

(1)反应体系：

pENTR/D-TOPO载体:1μl

pEarleyGate103过表达载体:1μl

2X Fuzyme MasterMix:0.5μl

(2)将反应混合液在25℃孵育2-3小时。

(3)将以上体系转化大肠杆菌DH5α。

2.3重组子的鉴定

(1)质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增。

PCR反应条件：预变性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(2)测序鉴定。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

3.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

1.从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于YEP液体培养基(含50μg/ml利福平)中，200rpm/min，28℃培养过夜。

2.取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

3.菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

4.将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

5.再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

3.2冻融法转化根癌农杆菌EHA105

1.在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

2.置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

3.加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3小时。

4.7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

3.3菌体PCR鉴定

挑取单菌落转移到如前所述2.3的PCR体系(不加DNA模板)中，用基因特异引物进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

实施例4、转基因功能验证－蒺藜苜蓿转化筛选

利用组织培养法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌EHA105浸染蒺藜苜蓿叶片。然后诱导愈伤形成、胚形成。待其长出幼苗后，提取DNA进行PCR筛选，即得到纯合转基因株系。

4.1蒺藜苜蓿叶片转化

农杆菌EHA105具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的MtWOX11基因编码区植物表达载体转入农杆菌，然后进行PCR验证。利用组织培养法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌EHA105浸染蒺藜苜蓿叶片。然后诱导愈伤形成、胚形成。待其长出幼苗后，提取DNA进行PCR筛选，即得到纯合转基因株系。

4.1.1组织培养法

(1)取健康较大的叶片去叶柄置于管中。用含有20％的NaClO和0.1％的Tween-20的灭菌水洗15分钟，再用灭菌水洗3-5次。

(2)将叶片切成小块，创造伤口。

(3)将农杆菌摇到OD值为0.6-0.8。离心收集菌体，然后用SH3a培养基重悬菌体至OD值0.1-0.2。

(4)将准备好的菌液倒入切好的叶片中。抽真空10-15分钟，慢摇10-15分钟。将叶片平铺于无抗性的SH3a培养基上，尽量铺密。避光室温培养。

(5)隔夜，去离子水洗三遍，直到澄清，再用加café的去离子水洗。

(6)转到加抗性的SH3a上，避光温室培养4-6周，然后将愈伤组织转移到SH9a的培养基中。待愈伤分化成芽再转到1/2MS培养基中。等到出苗后移至土中。

4.1.2转基因苗检测

提取DNA，PCR检测(方法同上)。

4.2转基因植株分子鉴定

对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。MtWOX11在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。

RT-PCR结果表明，MtWOX11基因虽然属于组成性表达，在各器官中均有表达，但在种子中的表达量最高，其次是在花、根、叶中的表达量较高，在茎、叶柄、顶芽中表达量较低。(见图3).

利用一个MtWOX11表达量最高的株系来进行后续的工作。

RNA提取、反转录、RT-PCR实时定量PCR(方法同上)。

实施例5、转基因功能验证—种子脂肪酸品质功能分析

对mtwox11突变体和过表达转基因植株种子品质的分析，由苏州科铭生物技术有限公司完成。

过表达MtWOX11转基因植株种子的脂肪酸含量分析结果见图4。

其中：灰色柱状图所示mtwox11突变体与野生型种子中脂肪酸含量的比值，黑色柱状图所示过表达MtWOX11转基因植株与野生型种子中脂肪酸含量的比值。*表示显著差异，Anova Single Factor p<0.05，**表示极显著差异，Anova Single Factor p<0.01。

结果表明，过表达转基因植株种子中总脂肪酸含量与野生型相比增加了12.2168％，特别是C15.0(十五烷酸)、C15.1(顺-10-十五烯酸)、C16.0(棕榈酸)、C18.2N6C(亚油酸)、C20.2(顺-11，14-二十碳二烯酸)、C20.3N6(顺-8，11，14-二十碳三烯酸)、C20.4N6(花生四烯酸)、C20.5N3(顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、C24.0(二十四烷酸)等脂肪酸的含量在突变体中均有下降，而在过表达MtWOX11转基因株系中均有上升，其中，十五烷酸的含量显著提高。

上述结果证明，MtWOX11基因参与了调控豆科植物的种子脂肪酸含量，过表达该基因，可明显提高种子中脂肪酸的含量。预示MtWOX11基因在提高豆科种子脂肪酸含量中具有重要作用。

序列表

<110>山东大学

<120>蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其在提高种子脂肪酸含量中的应用

<141>2017-11-20

<160>3

<210>1

<211>3627

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>蒺藜苜蓿WUSCHEL-related homeobox11基因组核苷酸序列

<400>1

aggtttcagt ttcatttcaa gtttcaacaa aacatatttt gttatttctt ctatctatag 60

tgcattggaa tggaagataa gatgcaacat gaccccccca acaacactcc aacccaacat 120

ggttccgaga aaactgaacc ggttaggtca aggtggacac caaaaccaga acaaattctc 180

atacttgagt ccatcttcaa cagtggcatg gtgaatcccc caaaagaaga aactatcaaa 240

ataagaaaac ttcttgagaa attcggcaac gtcggtgacg ccaacgtctt ctactggttc 300

caaaaccgcc ggtctagatc tcgccgccga caacgccaga tgcagcaggc cacacttgat 360

cagcaaagaa atcagatggc tatgatgcag cctcagcaag ttgttaacga tggtgcaagt 420

gcaattcctt gtgatatggt tcaaaccaac ccaaccatgg tttttggtgg ttcctcttct 480

tgtttaaatg attcttccgg ttcttcctct tcatcatgtg gtggtgttct tagtggtcaa 540

caaggcatgg atggtttgtt ttcagtttct tctcaaatgg gttttcttgg agttgatcaa 600

actttagctg caccatcact tttgtgccct tctctttctc ctaatttcaa ctatcactct 660

ggtaattggc tgcatgtctt ttatttattt attatttatt ttatcactaa aaaatttatt 720

ttaaaatcca tggagcactc caattcatac taaaatcaca aaagattatt tgttcaaaat 780

catttagaat ctccacaaat aattttgtat tattcaaaaa agctaactta aaattatttt 840

ttcaatattt ttttttataa atacacgaga tatactccaa catattacat caaagcctaa 900

tccgattttg ataaatttca aacccactag aaatttgttt attatatgca tggttgtgtt 960

tatcaatttt attttacttt ttatgagatt tatttgtaaa aatataaaaa ataagattag 1020

agaaagcata tacaaagata agagatcgta ataaaaagtt aaaagagttt cattttttaa 1080

taattttctt tttttggtat ccctaaccgt gcaccggtta gcgtcaccct taacattttc 1140

attggatatt tatggtgaaa tttacatata gcaaatcaat tgccgaattc tggctttgaa 1200

ccaaagttta aatatgtgat atgaaagatc caatcatatg tgtcaattac gatcgatcat 1260

tttttatgtg ctttgagctg gaatatttcc tcctattcaa tatatatttt cttgcataaa 1320

ttctaaatct gatgctacaa aatttatttt cttatcagtt gttattaatg catatttgaa 1380

ttcatagttg gttcttcaca aaaataaaat aattcatcca tgctcttagt ttaaaaaagt 1440

tcatgtttat ggaatgattg attaagtttg aggatgggta cagaataaag tgggtagctt 1500

ttccttgatt tgacagttcc gcgtttgaat tgttgcatga aagttgttct ttccggaaaa 1560

acatgaacgc tactttccgg ctgcagtttc tgttctttcc tttttattct ctcacttttt 1620

tcgactttct tcaatagtaa tactcctgct tctgcacaaa aaatttcaaa ccctagatta 1680

tgtttttatt tttatttttt tatatcatta tcatttcatc tgatggttac cctcttagta 1740

aatattcacc atacattact agtttttttc catcattttt ataaaattat tcaactttac 1800

cgttaaaaaa aagctcatta atctctcaat tgtttggtta actacgatgt taattactgg 1860

ttaaaagaaa tccataattt tcatatcttt tgttattttt tttaacaaac caaaatggaa 1920

tatattaaga aaaaaggagg cttctaataa gcagtgtgcc aaaaagacct caaaaatata 1980

caaggaaata aatcacaagg gaaccaaaac aaaaagaatt tatccgacgc ccaaacaaac 2040

aaatgggttc gaccactgca tatgaaagtt tagcctaatg tggtcatcaa agaaaacttg 2100

ctttgttcat tgcatgcgtt acatattgtt ttcttgcatt tttttcagtg attgagatat 2160

gaaattcagg agtaaattga gattcaaagt gtttgctgaa acattaatga gatcaacttc 2220

ttttatgctt taatttttgt atttgaccaa tatgtaaggt gatgttctat tttttatttt 2280

tttttggtca agttctaaca atattttggt attattaagg atttggaggt gctagtactg 2340

taacaggatt ggcaacagtg tttatcaatg ggattgcaac agaaattcaa gcagggccac 2400

tagacatcaa aacagtgttt ggagaagatg tgatgttagt tcattcctct ggtgtgccag 2460

ttcccacaaa tgaacatggc atcttgattc agagcttgca ccatggtgaa agctactttc 2520

tggtacttgc cacataccat catacatctt caaatcaatt gtttctattc taaatattgt 2580

gttgtcacat cttaatcatt gttctttatt ttcttttcaa tccttatgtc tactaatttg 2640

aaaattaatt cacacacatg tgcacatatg tgtaggtaca atcattttaa aatgtattca 2700

acgatttgtt gtcacatcaa taaatgaata tgaaaatcac atagattttc gtattcatta 2760

attgatgtga caatacatta tttgatgcat gtgtaaaata attgtatatt tagagcatcc 2820

ataatggaaa ccctaaattt agagttctta aactggtctc acgtgaacac gtcactcttt 2880

aataatattt taataacagt atctaataaa cactcaatca ctacaataga gatcctctaa 2940

caaaatgtct aaaccggtcc caccactaac tcttcatcat ttacatttca acaatacaac 3000

gattatttta ataaaaagta gtgtggagcc cacttaagaa tggggtttta aatgattcca 3060

acacccaaaa aaaaaatctc caataaagat acctattagg tgccggatct taaatgatga 3120

agacctcacc atatgagatg gtcttacaaa acatattaat taaactcttg aaaatatcga 3180

gcatatcata catacaataa atgtaaaaca attttacaca tatccaagaa aacaatttta 3240

cacatatatc taaattgttc aatatgttat tgtatagaaa tatatttttt agagttattg 3300

tatagaaaca tgttatatga aaacattcac ttcaaaatgt tttgggagtg atcacattga 3360

actaaagcta cttaggattt atctactcct atgttctaat cttgtcatat aaaaaatagt 3420

ctactcctat gttttaattc actaaacata atatttttca cttacattat tttgaattcc 3480

tactactcca gtaattaagg agtttttttg tgtatcatga ttattaaact ttggtttaca 3540

ggtatcaaag tcagcacaag tttgaactga ccatgctcta atgctggagt tggaaggtcc 3600

ctatgcgtgt gctcctctct ttttaac 3627

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>2

atggaagata agatgcaaca tg 22

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>3

aacttgtgct gactttgata ccaga 25

Claims

1.一种蒺藜苜蓿 MtWOX11基因在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用，其中所述蒺藜苜蓿 MtWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、大豆、三叶草。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述苜蓿选蒺藜苜蓿。