CN113203863A - 一种适用于白介素-6检测的缓冲液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白介素‑6(IL‑6)的检测领域,具体涉及一种适用于白介素‑6检测的缓冲液,本发提供一种合适缓冲液体系,包括以下成分,三羟甲基氨基甲烷12‑18份、牛血清白蛋白30‑50份、甘氨酸20‑30份、海藻糖30‑50份和酪蛋白20‑30份。所述体系用于IL‑6检测时,抗干扰能力强,检测结果稳定,重复性好,对IL‑6的检测灵敏度达到了5×10‑12g/mL以下。
Description
技术领域
本发明涉及白介素-6(IL-6)的检测领域,具体涉及一种适用于白介素-6检测的缓冲液。
背景技术
IL-6是一种功能广泛的多效性细胞因子,属于白细胞介素的一种。它可由多种细胞所产生。白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板衍生因子(PDGF)、病毒感染、双链RNA及c AMP等,均可诱导正常细胞产生IL-6。IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。人类的IL-6基因位于第7号染色体上,分子量在21~30KD之间,其差异是由于肽链的糖基化和磷酸程度不同所致。
IL-6是急性感染早期诊断的灵敏指标。当感染和炎症发生后,IL-6率先生成且水平迅速升高,其升高水平与感染的严重程度相一致,并诱导降钙素原(PCT)和C反应蛋白(CRP)在感染后升高。IL-6可作为对患者感染早期的鉴别诊断指标并对预后具有重要的参考意义。IL-6在危重患者中可持续长时间高水平的表达,可作为评估脓毒症和多器官功能障碍综合征(MODS)患者严重程度和预后的敏感指标,并能更快反映抗生素治疗的效果。
通常在健康情况下,新生儿的血浆中IL-6浓度为18-26pg/mL,并且会随着年龄的增长浓度逐渐降低,当成长为正常成年人时血浆中IL-6浓度将低于10pg/mL,尽管在某些炎症性疾病中,IL-6的含量会有所增加,但是总体含量低造成其检测困难,提供一种灵敏且准确的IL-6含量检测方法是有必要的。
中国专利申请CN109030829A公开了一种均相化学发光法检测犬IL-6的定量试剂盒及其使用方法;所述试剂盒采用的检测溶液包含DNA1-IL-6抗体1偶联物、DNA2-IL-6抗体2偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3、限制性内切酶和氧化石墨烯,所述DNA1与DNA2有6个碱基互补,所述DNA3含2个酶切位点,且分别有9个碱基和DNA1、DNA2互补配对,DNA3通过π-π堆积作用吸附在氧化石墨烯表面,其末端标记的AE的化学发光因发生CRET而被淬灭;本方法为均相免疫分析方法,操作简单,同时大大缩短了分析时间,可在5-10分钟内完成单个样品的测定,结合邻位触击效应和化学发光分子信标,通过免疫反应诱发石墨烯淬灭机制的开关,从而释放化学发光信号,无需洗涤及分离纯化步骤。
中国专利申请CN106124769A公开了一种一步均相IL-6检测试剂盒,主要组成包括:抗IL-6抗体偶联的发光微球、抗IL-6抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔;本发明还公开了所述一步均相IL-6检测试剂盒的制备方法,该方法包括:抗IL-6抗体偶联发光微球的制备;抗IL-6抗体偶联感光微球的制备,以及分析缓冲液的制备;最后本发明公开了一步均相IL-6检测试剂盒的使用方法;本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、检测范围宽、重复性好,操作简单,免清洗等特点,将其应用于感染的监测,可以提高脓毒血症诊断的准确率,便于临床检测使用。
中国专利申请CN107402308A公开了一种IL-6定量检测试剂盒及其制备方法。其中,该IL-6定量检测试剂盒包括:偶联有IL-6抗体的磁微球试剂,反应稀释液试剂和IL-6校准品。应用本发明的检测试剂盒,可以在现有多种生化分析仪上进行血清样本检测,操作简便快速,出具检测结果只需约10~15分钟,便于炎症、脓毒症早期诊断,更适合在各级基层医疗机构普及和应用。
在IL-6的试剂盒使用过程中,标准品和质控品的检测稳定性对于结果的影响是非常验证的,因此使用合适缓冲溶液来构建IL-6试剂盒的标准曲线是必要的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中IL-6检测困难以及准确性较低,提供一种IL-6的标准品缓冲溶液。
本发明的目的用过以下技术方案实现。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷12-18份、牛血清白蛋白30-50份、甘氨酸20-30份、海藻糖30-50份和酪蛋白20-30份。
进一步地,所述缓冲液,按体积1000mL计,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷12-18g、牛血清白蛋白30-50g、甘氨酸20-30g、海藻糖30-50g、酪蛋白20-30g和IL-6重组蛋白,余量为水,其中IL-6重组蛋白的浓度为10-500pg/mL。
进一步地,所述缓冲液pH=7.2-8.8。
进一步地,所述缓冲液的pH使用氢氧化钠或盐酸进行调节。
一种所述缓冲液的应用,所述应用为在制备IL-6的检测产品中的应用。
一种包含所述缓冲液的试剂盒,包括以下成分:
试剂A:碱性磷酸酶-IL-6抗体;
试剂B:生物素-IL-6抗体;
试剂C:链霉亲和素-磁微粒;
和三种不同浓度的所述缓冲液,其中三种不同浓度的所述缓冲液中,区别仅在于IL-6重组蛋白的含量不同。
进一步地,所述述三种不同浓度的缓冲液中,所述IL-6的浓度分别为标准品1 10-15pg/mL、标准品2 290-310pg/mL和质控品40-50pg/mL.
进一步地,所述试剂A的具体组成为碱性磷酸酶-IL-6抗体和缓冲液8的混合物;
所述缓冲液8以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷3.5-7g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋30-50g、牛血清80-100mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL,余量为水,pH=5.8-7.6,其中碱性磷酸酶-IL-6抗体的含量为2-4μg/mL,优选为2μg/mL。
进一步地,所述缓冲液的pH使用氢氧化钠或盐酸进行调节。
进一步地,所述试剂B的具体组成为生物素-IL-6抗体和缓冲液8的混合物;
所述缓冲液8以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷3.5-7g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋30-50g、牛血清80-100mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL,余量为水,pH=5.8-7.6,其中生物素-IL-6抗体的含量为2-4μg/mL,优选为2μg/mL。
进一步地,所述缓冲液的pH使用氢氧化钠或盐酸进行调节。
进一步地,所述试剂C的具体组成为链霉亲和素-磁微粒和缓冲液9的混合物;
所述缓冲液9以1000mL总量计,具体组成为,十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g、磷酸二氢钠0.55-0.60g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋白30-50g、蔗糖80-100g、纤维素盐或纤维素衍生物3.0-5.0g和明胶20-30g,余量为水,pH=6.2-8.0,其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4-0.8mg/mL。
进一步地,所述缓冲液的pH使用氢氧化钠或盐酸进行调节。
进一步地,所述试剂盒还包括清洗液和碱性磷酸酶特异性响应的发光底物;
进一步地,所述清洗液的具体组成为,以1000mL溶液计算,含有:3-5g三羟甲基氨基甲烷、10-20gNaCl、3-5g吐温20、3-5mL TritonX100,余量为水。
进一步地,所述碱性磷酸酶特异性响应的发光底物。
进一步地,所述碱性磷酸酶特异性响应的发光底物为含二氧杂环乙烷类发光底物(AMPDD)或二氢吖啶类发光底物的三羟甲基氨基甲烷溶液。
进一步地,所述碱性磷酸酶特异性响应的发光底物为9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10-二氢吖啶二钠盐。
本发明是使用的术语“碱性磷酸酶-IL-6抗体”即为本领域技术人员所知的碱性磷酸酶标记的IL-6抗体。
本发明所述用的术语“生物素-IL-6抗体”即为本领域技术人员所知的生物素标记的IL-6抗体。
本发明所使用的术语“链霉亲和素-磁微粒”即为链霉亲和素标记的磁性微球。
本发明所使用的计量单位pg/mL等价于10-12g/mL。
本发明的优势在于:
1.采用合适的缓冲体系,提高了IL-6检测的灵敏度和准确性,使检测灵敏度达到了5×10-12g/mL以下。
2.本发明的试剂盒可以搭配全自动仪器进行检测,只需加入该有样品的采血管,18分钟即可得到准确结果。远优于传统化学发光30分钟的反应时间或酶联免疫法1-2小时的反应时间。
具体实施方式
缓冲液实施例1
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为15pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液S1-1。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为50pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液S1-2。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为300pg/mL,使用4MHCl调节pH=7.2,即得缓冲液S1-3。
缓冲液实施例2
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷18g、牛血清白蛋白30g、甘氨酸30g、海藻糖50g、酪蛋白30g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为10pg/mL,使用4M HCl调节pH=8.8,即得缓冲液S2-1。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷18g、牛血清白蛋白30g、甘氨酸30g、海藻糖50g、酪蛋白30g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为100pg/mL,使用4MHCl调节pH=8.8,即得缓冲液S2-2。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷18g、牛血清白蛋白30g、甘氨酸30g、海藻糖50g、酪蛋白30g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为500pg/mL,使用4MHCl调节pH=8.8,即得缓冲液S2-3。
缓冲液对比例1-和缓冲液实施例1相比,缓冲液中增加了Triton X-100
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g、Triton X-100 40g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为15pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液D1-1。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g、Triton X-100 40g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为50pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液D1-2。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g、Triton X-100 40g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为300pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液D1-3。
缓冲液对比例2-和缓冲液实施例1相比,将海藻糖和酪蛋白替换为蔗糖和明胶
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、蔗糖40g、明胶25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为15pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液D2-1。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、蔗糖40g、明胶25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为50pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液D2-2。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、蔗糖40g、明胶25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为300pg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2,即得缓冲液D3-3。
缓冲液对比例3-和缓冲液实施例1相比,pH较高
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为15pg/mL,使用4M HCl调节pH=9.5,即得缓冲液D3-1。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为50pg/mL,使用4M HCl调节pH=9.5,即得缓冲液D3-2。
一种适用于白介素-6检测的缓冲液
三羟甲基氨基甲烷12g、牛血清白蛋白50g、甘氨酸20g、海藻糖40g、酪蛋白25g和IL-6重组蛋白,余量为水,总量为1000mL,其中IL-6重组蛋白的浓度为300pg/mL,使用4MHCl调节pH=9.5,即得缓冲液D3-3。
本发明还提供试剂盒制备所需物料的制备方法
缓冲液1:乙醇胺15g/L和NaCl 6g/L水溶液;
缓冲液2:甘氨酸水溶液75g/L;
缓冲液3:六水合氯化镁水溶液,203.3g/L;
缓冲液4:吗啉乙磺酸钠盐水溶液,30g/L;
缓冲液5:三羟甲基氨基甲烷5g/L,氯化钠9g/L,牛血清白蛋白20g/L;
缓冲液6:三羟甲基氨基甲烷6g/L,氯化钠9g/L。
碱性磷酸酶-IL-6抗体的制备例
称取8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT),用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体摩尔比30:1的比例将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化,按1mg抗体加入5~20μl缓冲液2的比例,将缓冲液2加入抗体溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT,收集活化后的抗体。
称取4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC),用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比50:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后,室温下反应30分钟。终止活化,按1mg ALP(碱性磷酸酶)加入10~50μl缓冲液2的比例,将缓冲液2加入ALP溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC,收集活化后的ALP。
按活化后抗体与活化后ALP质量比1:1的比例在抗体溶液中的加入ALP溶液(即:1.0mg抗体加入1.0mg ALP。震荡混匀后,将混合物在2℃~8℃环境中反应12-18小时。
称取1-10mg马来酰亚胺,用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例,用缓冲液1稀释,得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体加入10μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液,在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺,用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体加入10~50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液,震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至0.5~2mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化,洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为碱性磷酸酶-IL-6抗体溶液。
生物素-IL-6抗体的制备例
用0.02M PBS配制10mM生物素溶液。按抗体与生物素摩尔比1:20的比例在抗体溶液中的加入10mM生物素溶液。震荡混匀后,将混合物在室温环境中反应1小时。
将反应后的溶液加入脱盐柱中。当溶液完全进入柱料前,使用0.02M PBS补足柱料体积。柱内液体完全进入柱料时,加入等体积的0.02M PBS缓冲液开始洗脱。收集等体积蛋白洗脱液并测试浓度。洗脱的溶液即为生物素-IL-6抗体溶液。
链霉亲和素-磁微粒的制备例
将含有羧基的磁微粒用缓冲液4清洗后,重悬至10mg/mL。按磁微粒与链霉亲合素质量比10:1的比例在磁微粒溶液中加入链霉亲合素。充分混合后,在室温下混匀反应10分钟。按磁微粒与(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)质量比100:10的比例在磁微粒溶液中加入EDC。充分混合后,在室温下混匀反应2小时。再对连接物进行磁性分离,使用缓冲液6将分离后的磁微粒重悬至10mg/mL,保存于2℃~8℃环境下。
试剂盒实施例1-一种IL-6检测试剂盒
试剂A:碱性磷酸酶-IL-6抗体,具体组成为以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL,余量为水,使用4M HCl调节pH=7.6,其中碱性磷酸酶-IL-6抗体的含量为2μg/mL。
试剂B:生物素-IL-6抗体,具体组成为以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL,余量为水,使用4M HCl调节pH=7.6,其中生物素-IL-6抗体的含量为2μg/mL。
试剂C:链霉亲和素-磁微粒,以1000mL总量计,具体组成为,十二水合磷酸氢二钠5.9g、磷酸二氢钠0.6g、氯化钠9g、牛血清白蛋白50g、蔗糖100g、纤维素5.0g和明胶30g,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4mg/mL。
清洗液,具体组成以1000mL计,3-5g三羟甲基氨基甲烷、10-20g NaCl、3-5g吐温20、3-5mL TritonX-100,余量为水。
碱性磷酸酶特异性响应的发光底物,9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶二钠盐的三羟甲基氨基甲烷溶液,浓度为0.3mg/mL。
缓冲液S1-1、缓冲液S1-2和缓冲液S1-3
试剂盒实施例2-一种IL-6检测试剂盒
试剂A:碱性磷酸酶-IL-6抗体,具体组成为以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL,余量为水,使用4M HCl调节pH=7.6,其中碱性磷酸酶-IL-6抗体的含量为2μg/mL。
试剂B:生物素-IL-6抗体,具体组成为以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL,余量为水,使用4M HCl调节pH=7.6,其中生物素-IL-6抗体的含量为2μg/mL。
试剂C:链霉亲和素-磁微粒,以1000mL总量计,具体组成为,十二水合磷酸氢二钠5.9g、磷酸二氢钠0.6g、氯化钠9g、牛血清白蛋白50g、蔗糖100g、纤维素5.0g和明胶30g,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4mg/mL。
清洗液;
清洗液,具体组成以1000mL计,3-5g三羟甲基氨基甲烷、10-20g NaCl、3-5g吐温20、3-5mL TritonX100,余量为水。
碱性磷酸酶特异性响应的发光底物;9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10-二氢吖啶二钠盐的三羟甲基氨基甲烷溶液,浓度为0.3mg/mL。
缓冲液S2-1、缓冲液S2-2和缓冲液S2-3
试剂盒对比例1
和试剂盒实施例1的区别在于,缓冲液体系为:
缓冲液D1-1、缓冲液D1-2和缓冲液D1-3。
试剂盒对比例2
和试剂盒实施例1的区别在于,缓冲液体系为:
缓冲液D2-1、缓冲液D2-2和缓冲液D2-3。
试剂盒对比例3
和试剂盒实施例1的区别在于,缓冲液体系为:
缓冲液D3-1、缓冲液D3-2和缓冲液D3-3。
试剂盒性能测试指标
测试方法:
免疫反应:将30μL样本、50μL试剂A、50μL试剂B、50μL试剂C在离心管1中依次混合,在37℃条件下反应20min。
磁分离及清洗:加入300μL清洗液,清洗2min后,将含磁微粒的混合物用磁力吸出离心管1,在离心管2中脱磁。重复3次。
读值:在清洗后的磁微粒中加入150μL发光底物,ALP催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)。
根据检测的校准品数值可获得一条IL-6浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应,从而实现对未知样本的浓度检测。
准确度分析方法:
将浓度约为300pg/mL(允许偏差±10%)的白介素6(IL-6)液(A)加入到浓度范围5pg/mL的样本B中,所加入IL-6抗原与样本B之间的体积比例为1:9,根据公式(1)计算回收率R,其回收率应在85%~115%范围内。
式中:
R—回收率;
V—样品A液的体积;
V0—血清样品B液的体积;
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值;
C0—血清样品B液的3次测量平均值;
CS—样品A液的浓度。
空白限分析方法:
线性区间分析方法:
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值,记录各样品的测量结果,并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量,以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r),确定相关系数r≥0.990的线性区间。
式中:
r————相关系数;
xi————稀释比例;
yi————各个样本测定结果均值;
重复性分析方法
式中:s——样本测试值的标准差;
批间差分析方法:
使用上述方法对试剂盒实施例1-2以及试剂盒对比例1-3进行测试,结果见表1。
表1测试结果
准确度 | 空白限 | 批间差 | 相关系数(r) | 重复性(CV) | |
试剂盒实施例1 | 102.51% | 3.305 | 8.63% | 0.9987 | 6.15% |
试剂盒实施例2 | 97.26% | 4.231 | 10.27% | 0.9992 | 6.33% |
试剂盒对比例1 | 82.33% | 7.328 | 16.92% | 0.9885 | 9.47% |
试剂盒对比例2 | 131.46% | 6.929 | 29.69% | 0.8612 | 12.42% |
试剂盒对比例3 | 76.37% | 5.326 | 19.36% | 0.8818 | 10.58% |
可以看出,使用本发明的缓冲液组成的试剂盒,在IL-6检测中具有较好的较低的空白限,较大的线性区间及线性关系,而且重复性更好。
最后应当说明的是,以上内容仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换,均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种适用于白介素-6检测的缓冲液,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷12-18份、牛血清白蛋白30-50份、甘氨酸20-30份、海藻糖30-50份和酪蛋白20-30份。
2.根据权利要求1所述的所述缓冲液,其特征在于,按体积1000mL计,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷12-18g、牛血清白蛋白30-50g、甘氨酸20-30g、海藻糖30-50g、酪蛋白20-30g和IL-6重组蛋白,余量为水,其中IL-6重组蛋白的浓度为10-500pg/mL。
3.根据权利要求1或2所述缓冲液,其特征在于,pH=7.2-8.8。
4.一种如权利要求1-3任一项所述缓冲液的应用,所述应用为在制备IL-6的检测产品中的应用。
5.一种包含权利要求2-3任一项所述缓冲液的试剂盒,包括以下成分:
试剂A:碱性磷酸酶-IL-6抗体;
试剂B:生物素-IL-6抗体;
试剂C:链霉亲和素-磁微粒;
和三种不同浓度的权利要求2-3任一项所述的缓冲液,三种不同浓度的权利要求2-3任一项所述的缓冲液的区别仅在于所述IL-6重组蛋白的浓度不同。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述三种不同浓度的缓冲液中,所述IL-6的浓度分别为标准品1 10-15pg/mL、标准品2 290-310pg/mL和质控品40-50pg/mL。
7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂A的具体组成为碱性磷酸酶-IL-6抗体和缓冲液8的混合物;
所述缓冲液8以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷3.5-7g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋30-50g、牛血清80-100mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL,余量为水,pH=5.8-7.6,其中碱性磷酸酶-IL-6抗体的含量为2-4μg/mL,优选为2μg/mL。
8.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂B的具体组成为生物素-IL-6抗体和缓冲液8的混合物;
所述缓冲液8以1000mL总量计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷3.5-7g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋30-50g、牛血清80-100mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL,余量为水,pH=5.8-7.6,其中生物素-IL-6抗体的含量为2-4μg/mL,优选为2μg/mL。
9.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂C的具体组成为链霉亲和素-磁微粒和缓冲液9的混合物;
所述缓冲液9以1000mL总量计,具体组成为,十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g、磷酸二氢钠0.55-0.60g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋白30-50g、蔗糖80-100g、纤维素盐或纤维素衍生物3.0-5.0g和明胶20-30g,余量为水,pH=6.2-8.0,其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4-0.8mg/mL。
10.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括清洗液和碱性磷酸酶特异性响应的发光底物;
所述清洗液的具体组成为,以1000mL溶液计算,含有:3-5g三羟甲基氨基甲烷、10-20gNaCl、3-5g吐温20、3-5mL TritonX100,余量为水。
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