CN113203868B - 一种适用于amh检测试剂盒的缓冲液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗缪勒管激素(AMH)检测领域，具体涉及一种适用于AMH检测试剂盒的缓冲液，本发提供一种合适缓冲液体系，包括以下成分三羟甲基氨基甲烷4‑10份、NaCl 3‑7份、牛血清白蛋白10‑60份、海藻糖40‑120份和酪蛋白10‑45份。所述体系用于AMH检测时，抗干扰能力强，检测结果稳定，重复性好，对AMH的检测灵敏度达到了0.01ng/mL以下。

Description

一种适用于AMH检测试剂盒的缓冲液
技术领域
发明涉及抗缪勒管激素(AMH)检测领域，具体涉及一种适用于AMH检测试剂盒的缓冲液。
背景技术
抗缪勒管激素(AMH)是一种属于转化生长因子β家族的二聚体糖蛋白。这一超级家族的所有成员都参与调节组织生长和分化。在女性中，AMH在卵巢的卵泡发育中发挥重要作用。AMH的血清水平在女性出生时几乎检测不出，在***后达到最高水平，之后随着年龄增长逐步下降，在停经后无法检测出。
由于AMH含量低，检测难度大，提供一种灵敏且准确的AMH含量检测方法是有必要的。
中国专利申请CN109521003A公开了一种测定人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，试剂盒包括：抗缪勒氏管激素R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；抗缪勒氏管激素R1试剂是异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体稀释液，抗缪勒氏管激素R2试剂是碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒稀释液，抗缪勒氏管激素校准品液是由合成的抗缪勒氏管激素和缓冲液组成，发光底物液是碱性磷酸酶催化的含二氧杂环乙烷的Tris-HCl缓冲液。本发明极大地提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号，为抗缪勒氏管激素的检测提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
中国专利申请CN108051603A公开了一种采用磁微粒化学发光法测定人血清中抗缪勒氏管激素(AMH)含量的试剂盒。试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；其中抗试剂异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素包被抗体和碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素标记抗体；磁微粒试剂为磁微粒与羊抗FITC连接物。本发明将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测灵敏度、精密性大大提高、检测范围扩大，反应时间大大缩短，从开始加样到检测结果，时间少于25min,明显快于同类试剂盒；并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现抗缪勒氏管激素的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。
由于试剂盒使用场景大多为开放环境，因此合适的缓冲体系对检测的准确性和重复性至关重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中AMH检测困难以及准确性较低，提供一种AMH的标准品缓冲溶液。
本发明的目的用过以下技术方案实现。
一种适用于AMH检测试剂盒的缓冲液，包括以下成分，
三羟甲基氨基甲烷4-10份、NaCl 3-7份、牛血清白蛋白10-60份、海藻糖40-120份和酪蛋白10-45份。
进一步地，所述缓冲液，按体积1000mL计，包括以下成分，
三羟甲基氨基甲烷4-10g、NaCl 3-7g、牛血清白蛋白10-60g、海藻糖40-120g和酪蛋白10-45g和AMH，余量为水，其中AMH的浓度为0.1-10ng/mL。
进一步地，所述缓冲液pH＝7.2-8.7。
进一步地，所述缓冲液使用强氧化钠或盐酸进行pH调节。
一种所述缓冲液的应用，所述应用为在制备AMH的检测产品中的应用。
一种包含所述缓冲液的试剂盒，包括以下成分：
试剂A：碱性磷酸酶-AMH抗体；
试剂B：生物素-AMH抗体；
试剂C：链霉亲和素-磁微粒；
和三种不同浓度的所述缓冲液，其中三种不同浓度的所述缓冲液中，区别仅在于AMH的含量不同。
进一步地，所述述三种不同浓度的缓冲液中，所述AMH的浓度分别为标准品1 0.1-0.2ng/mL、标准品2 10-15ng/mL和质控品1-1.5ng/mL。
进一步地，所述试剂A的具体组成为碱性磷酸酶-AMH抗体和缓冲液8的混合物；
所述缓冲液8以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷3.5-7g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋30-50g、牛血清80-100mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL，余量为水，pH＝5.8-7.6，其中碱性磷酸酶-AMH抗体的含量为2-2.6μg/mL。
进一步地，所述缓冲液使用强氧化钠或盐酸进行pH调节。
进一步地，所述试剂B的具体组成为生物素-AMH抗体和缓冲液8的混合物；
所述缓冲液8以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷3.5-7g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋30-50g、牛血清80-100mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL，余量为水，pH＝5.8-7.6，其中生物素-AMH抗体的含量为1-1.5μg/mL。
进一步地，所述缓冲液使用强氧化钠或盐酸进行pH调节。
进一步地，所述试剂C的具体组成为链霉亲和素-磁微粒和缓冲液9的混合物；
所述缓冲液9以1000mL总量计，具体组成为，十二水合磷酸氢二钠5.6-5.9g、磷酸二氢钠0.55-0.60g、氯化钠7-9g、牛血清白蛋白30-50g、蔗糖80-100g、纤维素盐或纤维素衍生物3.0-5.0g和明胶20-30g，余量为水，pH＝6.2-8.0，其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4-0.8mg/mL，优选为0.4mg/mL。
进一步地，所述缓冲液使用强氧化钠或盐酸进行pH调节。
进一步地，所述试剂盒还包括清洗液和碱性磷酸酶特异性响应的发光底物；
进一步地，所述清洗液的具体组成为，以1000mL溶液计算，含有：0.5-5g三羟甲基氨基甲烷、2-20gNaCl、0.05-5g吐温20、0.005-5mL TritonX-100。
进一步地，所述清洗液，以1000mL溶液计算，含有：3g三羟甲基氨基甲烷、10gNaCl、3g吐温20、2mL TritonX-100。
进一步地，所述碱性磷酸酶特异性响应的发光底物为含二氧杂环乙烷类发光底物或二氢吖啶类发光底物的Tris溶液。
进一步地，所述二氢吖啶类发光底物9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶,二钠盐。
本发明是使用的术语“碱性磷酸酶-AMH抗体”即为本领域技术人员所知的碱性磷酸酶标记的AMH抗体。
本发明所述用的术语“生物素-AMH抗体”即为本领域技术人员所知的生物素标记的AMH抗体。
本发明所使用的术语“链霉亲和素-磁微粒”即为链霉亲和素标记的磁性微球。
本发明所使用的计量单位ng/mL等价于10-9g/mL。
本文所使用的属于“AMH”是指抗缪勒管激素或抗缪勒式管激素。
本发明的优势在于：
1.采用合适的缓冲体系，提高了AMH检测的灵敏度和准确性，使检测灵敏度达到了0.01ng/mL。
2.本发明的试剂盒可以搭配全自动仪器进行检测，只需加入该有样品的采血管，18分钟即可得到准确结果。远优于传统化学发光30分钟的反应时间或酶联免疫法1-2小时的反应时间。
具体实施方式
缓冲液实施例1
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白10g、海藻糖120g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为0.1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液S1-1。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白10g、海藻糖120g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液S1-2。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白10g、海藻糖120g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为10ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液S1-3。
缓冲液实施例2
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷10g、NaCl 3g、牛血清白蛋白60g、海藻糖40g和酪蛋白10g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为0.2ng/mL，使用4M HCl调节pH＝8.7，即得缓冲液S2-1。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷10g、NaCl 3g、牛血清白蛋白60g、海藻糖40g和酪蛋白10g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为1.5ng/mL，使用4M HCl调节pH＝8.7，即得缓冲液S2-2。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷10g、NaCl 3g、牛血清白蛋白60g、海藻糖40g和酪蛋白10g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为15ng/mL，使用4M HCl调节pH＝8.7，即得缓冲液S2-3。
缓冲液对比例1-和缓冲液实施例1相比，牛血清白蛋白和海藻糖用量不同
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白80g、海藻糖10g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为0.1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液D1-1。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl7 g、牛血清白蛋白80g、海藻糖10g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液D1-2。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白80g、海藻糖10g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为10ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液D1-3。
缓冲液对比例2-和缓冲液实施例1相比，增加了Triton 60
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白40g、海藻糖120g、Triton 60 30g、酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为0.1ng/mL，使用4MHCl调节pH＝7.2，即得缓冲液D2-1。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白40g、海藻糖120g、Triton 60 30g、酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝7.2，即得缓冲液D2-2。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白40g、海藻糖120g、Triton 60 30g、酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为10ng/mL，使用4MHCl调节pH＝7.2，即得缓冲液D2-3。
缓冲液对比例3-缓冲液pH不同
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白40g、海藻糖120g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为0.1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝6.5，即得缓冲液D3-1。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白40g、海藻糖120g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为1ng/mL，使用4M HCl调节pH＝6.5，即得缓冲液D3-2。
一种AMH缓冲液
三羟甲基氨基甲烷4g、NaCl 7g、牛血清白蛋白40g、海藻糖120g和酪蛋白45g和AMH，余量为水，总量为1000mL，其中AMH的浓度为10ng/mL，使用4M HCl调节pH＝6.5，即得缓冲液D3-3。
本发明还提供试剂盒制备所需物料的制备方法
缓冲液1：乙醇胺15g/L和NaCl 6g/L水溶液；
缓冲液2：甘氨酸水溶液75g/L；
缓冲液3：六水合氯化镁水溶液，203.3g/L；
缓冲液4：吗啉乙磺酸钠盐水溶液，30g/L；
缓冲液5：三羟甲基氨基甲烷5g/L，氯化钠9g/L，牛血清白蛋白20g/L；
缓冲液6：三羟甲基氨基甲烷6g/L，氯化钠9g/L。
碱性磷酸酶-AMH抗体的制备例
称取8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT),用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体摩尔比30:1的比例将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体加入20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的抗体。
称取4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比50:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP(碱性磷酸酶)加入30μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
按活化后抗体与活化后ALP质量比1:1的比例在抗体溶液中的加入ALP溶液(即：1.0mg抗体加入1.0mg ALP。震荡混匀后，将混合物在2℃～8℃环境中反应12-18小时。
称取10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体加入10μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体加入10～50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至1mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为碱性磷酸酶-AMH抗体溶液。
生物素-AMH抗体的制备例
用0.02M PBS配制10mM生物素溶液。按抗体与生物素摩尔比1:20的比例在抗体溶液中的加入10mM生物素溶液。震荡混匀后，将混合物在室温环境中反应1小时。
将反应后的溶液加入脱盐柱中。当溶液完全进入柱料前，使用0.02M PBS补足柱料体积。柱内液体完全进入柱料时，加入等体积的0.02M PBS缓冲液开始洗脱。收集等体积蛋白洗脱液并测试浓度。洗脱的溶液即为生物素-AMH抗体溶液。
链霉亲和素-磁微粒的制备例
将含有羧基的磁微粒用缓冲液4清洗后，重悬至10mg/mL。按磁微粒与链霉亲合素质量比10：1的比例在磁微粒溶液中加入链霉亲合素。充分混合后，在室温下混匀反应10分钟。按磁微粒与(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)质量比100:10的比例在磁微粒溶液中加入EDC。充分混合后，在室温下混匀反应2小时，再对连接物进行磁性分离，使用缓冲液6将分离后的磁微粒重悬至10mg/mL，保存于2℃～8℃环境下。
试剂盒实施例1-一种AMH检测试剂盒
试剂A：碱性磷酸酶-AMH抗体，具体组成为以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL，余量为水，使用4M HCl调节pH＝7.6，其中碱性磷酸酶-AMH抗体的含量为2.6μg/mL。
试剂B：生物素-AMH抗体，具体组成为以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL，余量为水，使用4M HCl调节pH＝7.6，其中生物素-AMH抗体的含量为1.1μg/mL。
试剂C：链霉亲和素-磁微粒，以1000mL总量计，具体组成为，十二水合磷酸氢二钠5.9g、磷酸二氢钠0.6g、氯化钠9g、牛血清白蛋白50g、蔗糖100g、纤维素5.0g和明胶30g，余量为水，使用4M HCl调节pH＝8.0，其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4mg/mL。
清洗液：以1000mL溶液计算，含有：3g三羟甲基氨基甲烷、10gNaCl、3g吐温20、2mLTritonX-100。
碱性磷酸酶特异性响应的发光底物：9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶,二钠盐的三羟甲基氨基甲烷溶液，浓度为0.3mg/mL。
缓冲液S1-1、缓冲液S1-2和缓冲液S1-3
试剂盒实施例2-一种AMH检测试剂盒
试剂A：碱性磷酸酶-AMH抗体，具体组成为以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL，余量为水，使用4M HCl调节pH＝7.6，其中碱性磷酸酶-AMH抗体的含量为2μg/mL。
试剂B：生物素-AMH-6抗体，具体组成为以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷5g、氯化钠9g、牛血清白蛋50g、牛血清100mL、羊血清15mL和马血清15mL，余量为水，使用4M HCl调节pH＝7.6，其中生物素-AMH抗体的含量为1.5μg/mL。
试剂C：链霉亲和素-磁微粒，以1000mL总量计，具体组成为，十二水合磷酸氢二钠5.9g、磷酸二氢钠0.6g、氯化钠9g、牛血清白蛋白50g、蔗糖100g、纤维素5.0g和明胶30g，余量为水，使用4M HCl调节pH＝8.0，其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4mg/mL。
清洗液：以1000mL溶液计算，含有：3g三羟甲基氨基甲烷、10gNaCl、3g吐温20、2mLTritonX-100。
碱性磷酸酶特异性响应的发光底物：9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶,二钠盐的三羟甲基氨基甲烷溶液，浓度为0.3mg/mL。
缓冲液S2-1、缓冲液S2-2和缓冲液S2-3
试剂盒对比例1
和试剂盒实施例1的区别在于，缓冲液体系为：
缓冲液D1-1、缓冲液D1-2和缓冲液D1-3。
试剂盒对比例2
和试剂盒实施例1的区别在于，缓冲液体系为：
缓冲液D2-1、缓冲液D2-2和缓冲液D2-3。
试剂盒对比例3
和试剂盒实施例1的区别在于，缓冲液体系为：
缓冲液D3-1、缓冲液D3-2和缓冲液D3-3。
试剂盒性能测试指标
测试方法：
免疫反应：将30μL样本、50μL试剂A、50μL试剂B、50μL试剂C在离心管1中依次混合，在37℃条件下反应20min。
磁分离及清洗：加入300μL清洗液，清洗2min后，将含磁微粒的混合物用磁力吸出离心管1，在离心管2中脱磁。重复3次。
读值：在清洗后的磁微粒中加入150μL发光底物，ALP催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)。
根据检测的校准品数值可获得一条AMH浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
准确度分析方法：
将浓度约为10ng/mL(允许偏差±10％)的康缪勒管激素(AMH)液(A)加入到浓度范围0-0.1ng/mL的样本B中，所加入AMH抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率R，其回收率应在85％～115％范围内。
Figure BDA0003043240480000091
式中：
R—回收率；
V—样品A液的体积；
V0—血清样品B液的体积；
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0—血清样品B液的3次测量平均值；
CS—样品A液的浓度。
空白限分析方法：
将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值
Figure BDA0003043240480000092
和标准差(SD)。平均值
Figure BDA0003043240480000093
即为空白限，结果应≤0.01ng/mL。
线性区间分析方法：
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，确定相关系数r≥0.990的线性区间。
Figure BDA0003043240480000094
式中：
r————相关系数；
xi————稀释比例；
yi————各个样本测定结果均值；
Figure BDA0003043240480000095
————稀释比例的均值；
Figure BDA0003043240480000096
————样本测定结果总均值。
重复性分析方法
同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值
Figure BDA0003043240480000097
和标准差SD。按公式(3)计算变异系数(CV)，结果CV≤8％。
Figure BDA0003043240480000101
式中：s——样本测试值的标准差；
Figure BDA0003043240480000102
——样本测试值的平均值。
批间差分析方法：
用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值
Figure BDA0003043240480000103
和标准差SD，根据公式(3)得出变异系数(CV)，结果CV≤12％。
使用上述方法对试剂盒实施例1-2以及试剂盒对比例1-3进行测试，结果见表1。
表1测试结果
空白限 准确度(R) 相关系数(r) 重复性(CV) 批间差
试剂盒实施例1 0.005 97.32％ 0.9962 5.82％ 9.21％
试剂盒实施例2 0.008 99.58％ 0.9917 6.93％ 10.54％
试剂盒对比例1 0.121 79.05％ 0.9835 11.66％ 15.93％
试剂盒对比例2 0.315 119.31％ 0.9319 14.29％ 23.57％
试剂盒对比例3 0.219 63.42％ 0.9622 12.58％ 14.32％
可以看出，使用本发明的缓冲液组成的试剂盒，在AMH检测中具有较好的较低的空白限，较大的线性区间及线性关系，而且重复性更好。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种试剂盒，包括以下成分：
试剂A：碱性磷酸酶-AMH抗体；
试剂B：生物素-AMH抗体；
试剂C：链霉亲和素-磁微粒；
和三种不同浓度的缓冲液，所述三种不同浓度的缓冲液区别仅在于AMH的含量不同；
所述的缓冲液，按体积1000mL计，由以下成分组成：
三羟甲基氨基甲烷 4-10 g、NaCl 3-7 g、牛血清白蛋白 10-60 g、海藻糖 40-120g和酪蛋白 10-45 g和AMH，余量为水；
所述三种不同浓度的缓冲液中，AMH的浓度分别为标准品1 0.1-0.2 ng/mL、标准品210-15 ng/mL和质控品 1-1.5 ng/mL；
所述缓冲液pH=7.2-8.7；
所述试剂A的具体组成为碱性磷酸酶-AMH抗体和缓冲液8的混合物；
所述缓冲液8以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷 3.5-7 g、氯化钠 7-9g、牛血清白蛋白30-50 g、牛血清 80-100 mL、羊血清 10-20 mL和马血清 10-20 mL，余量为水，pH=5.8-7.6，其中碱性磷酸酶-AMH抗体的含量为2-3 μg/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂B的具体组成为生物素-AMH抗体和缓冲液8的混合物；
所述缓冲液8以1000mL总量计，具体组成为，三羟甲基氨基甲烷 3.5-7 g、氯化钠 7-9g、牛血清白蛋30-50 g、牛血清 80-100 mL、羊血清 10-20 mL和马血清 10-20 mL，余量为水，pH=5.8-7.6，其中生物素-AMH抗体的含量为1-1.5 μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂C的具体组成为链霉亲和素-磁微粒和缓冲液9的混合物；
所述缓冲液9以1000mL总量计，具体组成为，十二水合磷酸氢二钠 5.6-5.9 g、磷酸二氢钠 0.55-0.60 g、氯化钠 7-9 g、牛血清白蛋白 30-50 g、蔗糖 80-100 g、纤维素盐或纤维素衍生物 3.0-5.0g、和明胶 20-30 g，余量为水，pH=6.2-8.0，其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.4-0.8 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括清洗液和碱性磷酸酶特异性响应的发光底物；所述清洗液的具体组成为，以1000mL溶液计算，含有：0.5-5g三羟甲基氨基甲烷、2-20gNaCl、0.05-5g吐温20和0.005-5mLTriton X-100。
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