CN111273033A - 一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法，涉及生物技术领域，具体而言，该测定试剂盒包括有磁微粒试剂、GP73结合抗体以及GP73标记抗体，其将磁微粒技术与吖啶酯标记技术相结合，有效缩短了高尔基体蛋白73的检测时间，且检测的灵敏度高，特异性强，稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法。
背景技术
GP73(Golgi Protein73)是存在于高尔基体的一种Ⅱ型跨膜蛋白，分子量73KD，已证实GP73是一种糖基化蛋白，其螺旋卷曲结构域上的N109和N144可以发生岩藻糖基化，糖基化可能与其功能密切相关。螺旋卷曲结构提示该蛋白可通过胞外区域与其它蛋白相互作用。
2000年Kladney研究表明，在正常的人体肝组织中，GP73主要由胆管上皮细胞表达，而肝细胞表达很少甚至不表达，肝细胞受到病毒感染后可引起GP73的表达上调。2005年Block等发现，在肝癌患者血清中GP73水平显著升高。在各种原因引发的肝脏疾病，包括病毒性和非病毒性肝炎、肝硬化及原发性肝癌的肝脏组织中GP73的表达均显著增高，GP73与肝脏炎症程度和肝纤维化的进程呈正相关，因此GP73是肝脏炎疾病辅助诊断的一个很好指标。
现有的高尔基体蛋白73(GP73)测定试剂盒主要采用的是酶联免疫分析技术或酶促化学发光免疫分析技术。
酶联免疫分析技术，即采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记GP73蛋白抗体，用另一配对的GP73蛋白抗体包被酶联反应微孔板，然后在反应板微孔中加入血清样本，经过双抗体夹心免疫反应后，样本中的GP73蛋白被抗体联结到酶联反应板微孔上，洗涤后加入底物显色液，若样本中含有GP73蛋白，则反应微孔板就会显色，反之则不显色。而显色的深浅，与样本中GP73蛋白的含量正相关，因此，可以根据反应孔颜色深浅，判断样本中GP73蛋白含量的水平。
酶联免疫分析技术是传统的经典免疫分析技术，其具有简单、方便、直观和成本低的优点，但同时也存在一些缺陷，如灵敏度低，反应时间长，重复性差，检测范围窄以及稳定性不好等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其包括：磁微粒试剂、GP73结合抗体以及GP73标记抗体；
所述磁微粒试剂包括由磁微粒与异硫氰酸荧光素抗体偶联制成的磁微粒；
所述GP73结合抗体包括由GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联制成的抗体；
所述GP73标记抗体包括由吖啶类化学发光标记物标记的GP73抗体。
第二方面，实施例提供一种高尔基体蛋白73的化学发光测定方法，其包括采用如前述实施例所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒对待测样品进行测定。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其包括有磁微粒试剂、GP73结合抗体以及GP73标记抗体；该测定试剂盒将磁微粒技术与吖啶标记技术相结合，有效缩短了高尔基体蛋白73的检测时间，且检测的灵敏度高，特异性强，稳定性好。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
具体地，本发明实施例提供了一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其包括有磁微粒试剂、GP73结合抗体以及GP73标记抗体。
所述磁微粒试剂包括由磁微粒与异硫氰酸荧光素抗体偶联制成的磁微粒；
所述GP73结合抗体包括由GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联制成的抗体。
所述GP73标记抗体包括由吖啶类化学发光标记物标记的GP73抗体。
在可选实施方式中，所述磁微粒试剂通过异硫氰酸荧光素抗体与GP73结合抗体上的异硫氰酸荧光素结合成复合物的状态。无论是分离状态还是复合物状态，只要包括有上述磁微粒试剂和GP73结合抗体均属于本发明的保护范围。
在可选实施方式中，所述GP73抗体为GP73单克隆抗体。
在可选实施方式中，所述吖啶类化学发光标记物包括吖啶酯和/或吖啶磺酰胺。
在可选实施方式中，所述吖啶类化学发光标记物为吖啶酯。
一方面，吖啶酯标记物发光为闪光型，其发光快速集中且强度大，能缩短检测时间，实现快速检测。另一方面，对于其发光体系来说，吖啶酯在碱性-过氧化氢溶液中就可直接发光，不需要依赖酶等催化剂，较少受到其它因素的影响，信噪比高，重复性好，且试剂成本低。
在可选实施方式中，所述由磁微粒与异硫氰酸荧光素抗体偶联时，所述磁微粒与异硫氰酸荧光素抗体的质量配比为(90～110)：1。
在可选实施方式中，所述磁微粒的直径为0.5～3μm。如果粒径过小，磁微粒的磁性较弱不易被快速吸附；但粒径过大，磁微粒较易沉降，不利于充分反应。在可选实施方式中，所述磁微粒的表面含有羧基、氨基和甲苯磺酰基中的任意一种或多种。
在可选实施方式中，当GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联时，所述GP73抗体与异硫氰酸荧光素的配比为1mg：(18～22)μg。
在可选实施方式中，当GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联时，GP73抗体为由每1mg抗体加入0.8～1.2ml的缓冲液A中混合而成的抗体溶液。
在可选实施方式中，当GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联时，反应温度为2～8℃，反应时间为18～24h。
在可选实施方式中，所述缓冲液A为浓度为0.45～0.55M、pH 8.8～9.2的CB缓冲液。
在可选实施方式中，当吖啶类化学发光标记物标记GP73抗体时，GP73抗体与吖啶类化学发光标记物的配比为1mg：(10～20)μg。
在可选实施方式中，当吖啶类化学发光标记物标记GP73抗体时，GP73抗体为由每1mg抗体加入0.8～1.2ml的缓冲液B中混合而成的抗体溶液。
在可选实施方式中，当吖啶类化学发光标记物标记的GP73抗体时，反应温度为2～8℃，反应时间为20～40min。
在可选实施方式中，所述缓冲液B为浓度为0.08～0.12M、pH 8.8～9.2的CB缓冲液。
在可选实施方式中，所述测定试剂盒还包括以下辅助试剂中的任意一种或多种：GP73校准品、预激发液、激发液以及清洗工作液。
具体地，所述GP73校准品为由校准品稀释液与不同标量的GP73蛋白混合而成的蛋白溶液，一般配制为5个不同浓度值的校准品。
在可选实施方式中，校准品稀释液为0.048～0.052MpH 7.3～7.7且含有1％BSA的PBS溶液。
在可选实施方式中，预激发液为吖啶酯预激发液，具体为由在0.02～0.04M的盐酸溶液中混合了0.15％～0.25％的过氧化氢的溶液。
在可选实施方式中，激发液为吖啶酯激发液，具体为由在0.058～0.062M的氢氧化钠溶液中混合了1.4％～1.6％的CTAC的溶液。
在可选实施方式中，所述清洗工作液为含吐温20的磷酸盐缓冲液。优选地，清洗工作液为含0.08～0.12％吐温20的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度为0.018～0.022M，pH为7.4～7.6。
此外，本发明实施例还提供了一种高尔基体蛋白73的化学发光测定方法，其包括采用前述任一实施方式所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒对待测样品进行测定。
采用该化学发光测定方法，结合吖啶标记和磁微粒技术，能够有效缩短高尔基体蛋白73的检测时间，且检测的灵敏度高，特异性好。
在可选实施方式中，所述化学发光测定方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
在可选实施方式中，所述化学发光测定方法包括以下步骤：
将待测样品或校准品，与所述测定试剂盒中的所述磁微粒试剂和GP73结合抗体在36～38℃的条件下混合；
将混合后得到的混合物与所述测定试剂盒的GP73标记抗体在36～38℃的条件下混合；
在可选实施方式中，待测样品或校准品与所述磁微粒试剂和GP73结合抗体的混合反应时间为10～20min；
在可选实施方式中，所述混合物与GP73标记抗体的混合反应时间为10～20min。
在可选实施方式中，所述测定方法包括将与所述测定试剂盒的GP73标记抗体反应后的混合物经清洗工作液洗涤后，加入吖啶酯预激发液和吖啶酯激发液，并检测其发光值。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其包括有磁微粒试剂、GP73结合抗体、GP73标记抗体、校准品、预激发液、激发液和清洗工作液。
测定试剂盒中试剂的制备方法如下。
(1)磁微粒试剂的制备方法：
将磁颗粒与异硫氰酸荧光素的抗体按照100：1的比例在0.5M的MES溶液中混合，加入等量的EDC和NHS，室温反应60min。
磁分离后，加入含有0.5％BSA的0.050M PBS室温封闭1h，然后用0.10M pH7.5含1％BSA的磷酸盐缓冲液稀释至适宜的工作浓度，制成结合磁微粒试剂，4℃保存(2～8℃均可)。
(2)GP73结合抗体的制备方法：
取2mg的GP73蛋白的单克隆抗体溶于1ml的0.50M pH9.0 CB缓冲液中，另取20μg的异硫氰酸荧光素，混匀，2-8℃反应过夜。将反应产物用凝胶柱分离纯化，用0.10M pH7.5含1％BSA的磷酸盐缓冲液稀释至适宜的工作浓度，得到GP73结合抗体，于4℃保存。
(3)GP73标记抗体的制备方法：
取1mg的GP73蛋白的单克隆抗体溶于1ml的0.10M pH9.6 CB缓冲液中，另取20μg吖啶酯，混匀，4℃反应30min。反应完成后将得到的产物用0.10M pH7.5含1％BSA的磷酸盐缓冲液稀释至适宜的工作浓度，制成GP73标记抗体，于4℃保存。
(4)校准品的制备方法：
用校准品稀释液(0.050M pH7.5含1％BSA的PBS)将GP73蛋白稀释配制成5个不同浓度值的校准品，5个浓度值可以为0ng/ml，2ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，200ng/ml以及500ng/ml浓度值的校准品。
(5)预激发液的制备方法：
在0.03M的盐酸溶液中加入0.2％的过氧化氢，于4℃保存。
(6)激发液的制备方法：
在0.06M的氢氧化钠溶液中加入1.5％的CTAC，4℃保存。
(7)清洗工作液的制备方法：
0.02M pH7.5含0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液，于4℃保存。
实施例2
本实施例提供一种高尔基体蛋白73的测定方法，其包括采用实施例1提供的测定试剂盒用于检测待测样本，具体包括以下步骤。
将50μL待测样品和校准品加入反应管中，再依次与磁微粒试剂和GP73结合抗体在37℃的条件下温育15min。
将温育后的混合物进行磁分离，吸除反应液，用清洗工作液洗磁微粒3次；然后将清洗后的混合物与GP73标记抗体在37℃的条件下温育15min；然后将反应管放到磁板进行磁分离，吸除反应液，用清洗工作液洗磁微粒3次。
清洗后，在反应管中加入100μL预激发液，混匀后再加入100μL和激发液，同时检测其发光值。
以校准品的浓度为横坐标，校准品测定的发光值为纵坐标，得到校准曲线，根据待测样本的发光值从校准曲线即可计算出待测样本的浓度值。
对比例1
与实施例1提供的测定试剂盒大致相同，区别在于，磁微粒试剂和GP73结合抗体的不同，区别如下。
对比例1中的磁微粒试剂为将磁颗粒与GP73蛋白的单克隆抗体直接偶联。
测定方法也与实施例2提供的测定方法有所不同，区别如下：
测定时，将待测样品与偶联有GP73蛋白的单克隆抗体的磁颗粒混合孵育，其他步骤同实施例2。
验证例1
验证本发明实施例1提供的高尔基体蛋白73的测定试剂盒的主要性能指标。
验证方法
采用实施例1和对比例1提供的测定试剂盒，实施例1采用实施例2提供的测定方法对待测样品进行测定，对比例1的测定方法采用对比例1中的所述的测定方法进行测定，对它们的重复性和灵敏度进行检测，检测结果参见表1。
表1检测结果
由表1可知，实施例1提供的测定试剂盒的重复性和分析灵敏度均比对比例1提供的测定试剂盒要好。
验证例2
验证本发明实施例2提供的高尔基体蛋白73测定方法的校准曲线、灵敏度和线性。
验证方法
采用实施例1和对比例1提供的测定试剂盒，实施例1采用实施例2提供的测定方法对待测样品进行测定，对比例1的测定方法采用对比例1中的所述的测定方法进行测定，对相同的校准品进行测定，测定结果请参照表2。
表2对比结果
由表2可知，实施例1提供的测定试剂盒的S0较低，但其S1/S0、S5/S0和线性r值均较高，说明实施例1提供的测定试剂盒的非特性结合较低，因而其灵敏度和线性r值提高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，其包括磁微粒试剂、GP73结合抗体以及GP73标记抗体；
所述磁微粒试剂包括由磁微粒与异硫氰酸荧光素抗体偶联制成的磁微粒；
所述GP73结合抗体包括由GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联制成的抗体；
所述GP73标记抗体包括由吖啶类化学发光标记物标记的GP73抗体。
2.根据权利要求1所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂通过异硫氰酸荧光素抗体与GP73结合抗体上的异硫氰酸荧光素结合成复合物的状态。
3.根据权利要求1所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，所述吖啶类化学发光标记物包括吖啶酯和/或吖啶磺酰胺；
优选地，所述吖啶类化学发光标记物为吖啶酯；
优选地，所述GP73抗体为抗GP73蛋白的单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，当磁微粒与异硫氰酸荧光素抗体偶联时，磁微粒与异硫氰酸荧光素的抗体的配比为(90～110)：1；
优选地，所述磁微粒的直径为0.5～3μm；
优选地，所述磁微粒的表面含有羧基、氨基和甲苯磺酰基中的任意一种或多种。
5.根据权利要求1所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，当GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联时，所述GP73抗体与异硫氰酸荧光素的配比为1mg：(18～22)μg；
优选地，当GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联时，GP73抗体为由每1mg抗体加入0.8～1.2ml的缓冲液A中混合而成的抗体溶液；
优选地，当GP73抗体与异硫氰酸荧光素偶联时，反应温度为2～8℃，反应时间为18～24h；
优选地，所述缓冲液A为浓度为0.45～0.55M、pH 8.8～9.2的CB缓冲液。
6.根据权利要求1所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，当吖啶类化学发光标记物标记GP73抗体时，GP73抗体与吖啶类化学发光标记物的配比为1mg：(10～20)μg；
优选地，当吖啶类化学发光标记物标记的GP73抗体时，GP73抗体为由每1mg抗体加入0.8～1.2ml的缓冲液B中混合而成的抗体溶液；
优选地，当吖啶类化学发光标记物标记的GP73抗体时，反应温度为2～8℃，反应时间为20～40min；
优选地，所述缓冲液B为浓度为0.08～0.12M、pH 8.8～9.2的CB缓冲液。
7.根据权利要求1～6任一项所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒还包括以下辅助试剂中的任意一种或多种：GP73校准品、预激发液、激发液以及清洗工作液；
优选地，所述预激发液为吖啶酯预激发液，所述激发液为吖啶酯激发液；
优选地，所述GP73校准品由校准品稀释液与不同标量的GP73蛋白混合组成；
优选地，所述清洗工作液为含吐温20的磷酸盐缓冲液。
8.一种高尔基体蛋白73的化学发光测定方法，其特征在于，其包括采用如权利要求1～7任一项所述的高尔基体蛋白73的测定试剂盒对待测样品进行测定。
9.根据权利要求8所述的高尔基体蛋白73的化学发光测定方法，其特征在于，所述测定方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
10.根据权利要求8或9所述的高尔基体蛋白73的化学发光测定方法，其特征在于，所述化学发光测定方法包括以下步骤：
将待测样品或校准品，与所述测定试剂盒中的所述磁微粒试剂和GP73结合抗体在36～38℃的条件下混合；
将混合后得到的混合物与所述测定试剂盒的GP73标记抗体在36～38℃的条件下混合；
优选地，待测样品或校准品与所述磁微粒试剂和GP73结合抗体的混合时间为10～20min；
优选地，混合物与GP73标记抗体的混合时间为10～20min；
优选地，所述化学发光测定方法包括将与所述测定试剂盒的GP73标记抗体反应后的混合物经清洗工作液洗涤后，加入吖啶酯预激发液和吖啶酯激发液，检测发光值。
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