CN105277717A - 一种甲状腺球蛋白的磁微粒分离化学发光免疫检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒。本发明提供了一种甲状腺球蛋白定量检测试剂盒，包括异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和磁分离试剂；本发明所采用的检测方法是磁微粒分离化学发光免疫检测，酶标记技术，磁分离技术和化学发光技术相结合，其操作方便、简单，反应条件温和，发光值稳定且受外界条件影响较小。相比于现有检测方法，本发明具有样本处理过程简单，检测成本低，检测快速，测试结果准确、重复性好等优点。

Description

一种甲状腺球蛋白的磁微粒分离化学发光免疫检测方法

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及到食品安全相关的免疫分析检测技术，尤其涉及一种甲状腺球蛋白的磁微粒分离化学发光免疫检测方法，适用于人血清和血浆中的甲状腺球蛋白的定量检测。

背景技术

甲状腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)，是甲状腺滤泡上皮分泌的660ku糖蛋白，每个Tg约有2个甲状腺素(T4)和0.5个三碘甲腺原氨酸(T3)分子，储存在滤泡腔中。溶酶体水解Tg表面T4、T3并使之释放入血，同时少量的Tg也释放入血，部分Tg经甲状腺***分泌入血。血循环中的Tg被肝脏的巨噬细胞清除。刺激Tg的分泌因素包括促甲状腺素(TSH)和***-1(IGF-1)；抑制因子是γ-干扰素、α-肿瘤坏死因子和维甲酸。

甲状腺球蛋白(TG)是分化型甲状腺癌(DTC)的标志物。定期随访血清TG有助于对DTC复发和转移的诊断、评价，以及监测病人预后的治疗效果。其它的良性甲状腺病,如甲亢、甲状腺囊肿、桥本氏病等由于甲状腺滤泡的破坏,致使其中胶质内的TG亦进入到血循环中,使血清TG水平增高。在先天性甲状腺功能低下患者中，检测甲状腺球蛋白可鉴别甲状腺完全缺失、甲状腺发育不全或其他病理状况。另一方面，甲状腺滤泡壁的损伤可导致大量的甲状腺球蛋白进入血液，因此，甲状腺球蛋白也被认为是甲状腺体形态完整性的特殊标志物。甲状腺球蛋白测定也可用于鉴别亚急性甲状腺炎和假的甲状腺毒症。

目前测量TG的方法主要有放射免疫分析法(RIA)和免疫量度分析法(IMA)两大类。IMA包括免疫放射量度分析法(IRMA)、荧光免疫分析法(FIA)、发光免疫分析法(CLIA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种甲状腺球蛋白定量检测试剂盒。

本发明提供的试剂盒，为1)或2)：

1)包括异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液；

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液的溶剂均为抗试剂缓冲液；

所述抗试剂缓冲液按照如下方法制备：将溶液A、牛血清、马血清、羊血清、防腐剂混匀得到抗试剂缓冲液；

所述溶液A由Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Trizmabase、动物血清白蛋白和水组成；

2)包括所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体、所述碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液。

上述试剂盒中，

所述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述防腐剂为ProcLin-300；

所述溶液A、所述牛血清、所述马血清、所述羊血清、所述ProcLin-300的配比为1000g：23-28ml：1.5-2.5ml：4.0-5.0ml：0.5-2.0ml；

所述溶液A中，所述Na⁺浓度为0.1-1mol/L，所述Mg²⁺的浓度为1mmol/L，所述Zn²⁺的浓度为0.1mmol/L,所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.2-1.0％，所述Trizmabase浓度为0.01-0.5mol/L。

上述试剂盒中，

所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、牛血清、马血清、羊血清、ProcLin-300和水的配比为1000g：25ml：2ml：4.5ml：1.0ml；

所述溶液A中，所述Na⁺源于NaCl，所述NaCl浓度为0.1mol/L；

所述Mg²⁺源于MgCl₂，所述MgCl₂浓度为1.0mmol/L；

所述Zn²⁺源于ZnCL₂，所述ZnCL₂浓度为0.1mmol/L；

所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5％；

所述Trizmabase的浓度为0.1mol/L。

上述试剂盒中，

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液由异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体的浓度为0.1-0.5μg/mL；

所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液由碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-1μg/mL；

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体中的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体中甲状腺球蛋白单克隆抗体不同。

上述试剂盒还包括磁分离试剂；

所述磁分离试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体共价连接在磁珠表面，得到磁分离试剂；

所述抗异硫氰酸荧光素抗体为多克隆抗体；

所述抗异硫氰酸荧光素抗体和所述磁微粒的配比为30μg-200μg：1mg；

所述磁微粒的直径为0.5-1.5μm。

上述试剂盒还包括校准品；

所述校准品由n个不同浓度的校准品溶液组成，所述校准品溶液由甲状腺球蛋白抗原和校准品缓冲液组成，且所述甲状腺球蛋白抗原在所述校准品中为不同浓度；

所述校准品缓冲液由Na⁺、蛋白类保护剂、防腐剂、Trizmabase、动物血清和水组成，所述Na⁺浓度为0.1-1mol/L,所述蛋白类保护剂的质量百分含量为0.2-1.0％，所述防腐剂体积百分含量为0.05-0.2％，所述Trizmabase浓度为0.01-0.5mol/L，所述动物血清的体积百分含量为0.05-1.0％。

上述试剂盒中，

所述Na⁺源于NaCl，所述NaCl浓度为0.10mol/L；

所述蛋白类保护剂为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白质量百分含量为0.5％；

所述防腐剂为Proclin-300，所述Proclin-300体积百分含量为0.1％；

所述Trizmabase的浓度为0.1mol/L；

所述动物血清为羊血清，所述羊血清体积百分含量为0.2％。

上述试剂盒中，

所述校准品由n个不同浓度的校准品溶液组成，n小于等于6；所述校准品为浓度为0、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、750ng/mL甲状腺球蛋白抗原溶液。

所述试剂盒还包括质控品、样本稀释液、清洗液和底物溶液；

所述质控品为2个不同浓度的校准品；所述质控品为浓度为10ng/mL和300ng/mL的校准品。

所述清洗液由吐温-20、氯化钠和浓度为0.15M、pH为8.0±0.05的Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述吐温-20的体积百分含量为0.04％，所述氯化钠的浓度为0.25mol/L；

所述底物溶液由二氢吖啶和浓度为0.25M、pH为8.0±0.05的Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述二氢吖啶终浓度为0.25mg/mL；

所述样本稀释液由牛血清白蛋白、trizmabase和水组成，其中，所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.2％-5％，所述trizmabase的浓度为0.1mol/L。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述的试剂盒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤:将上述试剂盒中8种组分均独立包装；再整体包装为试剂盒。

上述的试剂盒在甲状腺球蛋白定量检测中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒在制备甲状腺球蛋白定量检测产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒中8种组分在制备甲状腺球蛋白定量检测产品中的应用也是本发明保护的范围；

或一种待测样本中甲状腺球蛋白定量检测方法，包括如下步骤：

1)将上述的试剂盒中的校准品、质控品和待测样本分别与上述的试剂盒中的异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液混匀，反应，得到免疫反应产物；

2)将所述免疫反应产物与上述的试剂盒中的磁分离试剂混匀，反应，得到反应产物，将所述反应产物中的沉淀与磁珠清洗液混悬，收集沉淀，即为磁分离产物；

3)将所述磁分离产物和上述的试剂盒中的底物溶液混匀，得到混合产物，用化学发光仪检测所述混合产物的发光强度，通过发光强度计算待测样本中全量程甲状腺球蛋白定量；

所述磁珠清洗液为将上述的试剂盒中清洗液与水按1:7混匀，得到溶液；

或上述的试剂盒中磁分离试剂在甲状腺球蛋白定量检测中的应用。

所述抗试剂缓冲液的pH值为8.0±0.05。

所述校准品缓冲液的pH值为8.0±0.05。

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体为用异硫氰酸荧光素标记甲状腺球蛋白单克隆抗体A得到的产物；

所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体为用碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白的单克隆抗体B得到的产物。

本发明所采用的检测方法是磁微粒分离化学发光免疫检测，酶标记技术，磁分离技术和化学发光技术相结合，其操作方便、简单，反应条件温和，发光值稳定且受外界条件影响较小。相比于现有检测方法，本发明具有样本处理过程简单，检测成本低，检测快速，测试结果准确、重复性好等优点。

本发明具有以下优点：

1、使用磁微粒子为固相，使免疫反应更接近液相，反应更充分和迅速，而使结合的免疫复合物更易分离。；

2、本发明利用磁微粒子与化学发光技术相结合，提供了一种检测范围宽、灵敏度高、精密度好、测值稳定的定量检测方法，操作简单，检测快速，可满足快速、大量检测样本的需求。

本发明所采用的检测方法是磁微粒分离化学发光免疫检测，酶标记技术，磁分离技术和化学发光技术相结合，其操作方便、简单，反应条件温和，发光值稳定且受外界条件影响较小。相比于现有检测方法，本发明具有样本处理过程简单，检测成本低，检测快速，测试结果准确、重复性好等优点。

附图说明

图1为磁微粒分离化学发光免疫法检测甲状腺球蛋白示意图。

图2为贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司的检测试剂盒测定甲状腺球蛋白结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司购买得到。本发明中所用标记异硫氰酸荧光素单克隆抗体为Fitzgerald公司生产，货号为：10-7834；标记碱性磷酸酶抗体为Fitzgerald公司生产，货号为：10-7835；抗原为Fitzgerald公司生产，货号为：30-1219；碱性磷酸酶购自英国BBI公司，批号为：1693AA；羧基磁珠胶体溶液购自merk公司；羊抗异硫氰酸荧光素抗体血清血清购自解放军总医院第一附属医院实验动物科；异硫氰酸荧光素(FITC)购自SIGMA公司，CAT：3326-32-7，货号为：F7250；SMCC购自thermofisherscientific公司，货号为：22360；2-IT购自thermofisherscientific公司，CAS：4781-83-3；货号为:26101；NHS购自SIMGA公司，CAS：6066-82-6，货号：130672；EDC购自SIMGA公司，CAS：25952-53-8，货号：E7750。

实施例1、甲状腺球蛋白定量检测试剂盒组分及其方法

一、甲状腺球蛋白定量检测试剂盒的制备

将如下8种组分独立包装后再整体包装为试剂盒，即为甲状腺球蛋白定量检测试剂盒：1、校准品(含一系列浓度的TG，用于建立标准曲线)；2、质控品(含一定浓度的TG)；3、试剂A(含一定浓度的异硫氰酸荧光素标记的TG单克隆抗体溶液)；4、试剂B(含一定浓度的碱性磷酸酶标记的TG抗体)5、样本稀释液(含0.2-1.0％牛血清白蛋白(BSA)的trizmabase(tris)缓冲液)；6、磁分离试剂(结合有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁微粒混悬液)；7、清洗液(用于配制磁珠清洗液)；8、底物溶液。试剂盒中1、2、3、4、5、6、8为必备试剂，7可通过购买其他公司类似产品代替使用。上述试剂盒置于冰箱中4度保存。

具体如下：

1、校准品

1)校准品缓冲液的配制

校准品缓冲液由Na⁺、牛血清白蛋白、羊血清、Proclin-300、Trizmabase和水组成，各组分的终浓度如下：Na⁺源于NaCl，其浓度为0.1mol/L；牛血清白蛋白，其浓度为0.5％(质量百分含量)；Proclin-300，其浓度为0.1％(体积百分含量)；Trizmabase浓度为0.1mol/L；羊血清，其浓度为0.2％(体积百分含量)；校准品缓冲液的pH值为8.0±0.05。

校准品缓冲液的配置方法具体如下：

a)取Trizmabase12.06g，NaCl5.82g与1.0L试剂瓶中；

b)取600mL纯化水于1.0L试剂瓶中，充分搅拌直至完全溶解，调节PH至10.0±0.05；

c)加入羊血清2.0mL，牛血清白蛋白5.0g，充分搅拌混匀至完全溶解；

d)加入ProcLin-3001.0mL，纯化水定量至1000mL，充分混匀4h；

e)调节PH至为8.0±0.05；

f)使用0.22μm滤膜过滤并收集滤液，贴好标签，2～8℃保存。

2)校准品的制备

将TG抗原(抗原为Fitzgerald公司生产，货号为：30-1219)用上述1)中校准品缓冲液稀释成750ng/mL，300ng/mL，150ng/mL,50ng/mL，10ng/mL的校准品，等量分装成浓度为0、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、750ng/mL的校准品。

2、质控品(含一定浓度的TG)

以上述浓度为10ng/mL和300ng/mL的校准品作为质控品；

3、试剂A(异硫氰酸荧光素标记的TG单克隆抗体溶液)

1)、抗试剂缓冲液的配制

抗试剂缓冲液按照如下方法制备：将溶液A、牛血清、马血清、羊血清和ProcLin-300混匀得到抗试剂缓冲液；溶液A由Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Trizmabase、牛血清白蛋白和水组成。溶液A、牛血清、马血清、羊血清、ProcLin-300和水的配比为1000g：25ml：2ml：4.5ml：1.0ml；

溶液A中，Na⁺源于NaCl，其浓度为0.1mol/L；

Mg²⁺源于MgCl₂，其浓度为1.0mmol/L；

Zn²⁺源于ZnCL₂，其浓度为0.1mmol/L；

牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5％；

Trizmabase的浓度为0.1mol/L。

抗试剂缓冲液的配置方法具体如下：

a)取Trizmabase12.06g，NaCl5.82g于1L烧杯中；

b)取500g纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解；

c)加入MgCl₂95mg，ZnCL₂13.6mg，充分溶解混匀，调节PH至10.0±0.05；

d)加入牛血清白蛋白5.0g，充分搅拌混匀，放置1.0小时；

e)加入纯化水定重至1000g，充分搅拌混匀后，调节PH至8.0±0.05；得到溶液A；此时溶液体积为1L；

f)吸取牛血清25mL,马血清2.0mL，羊血清4.5mL，ProcLin-3001.0mL,充分混匀4小时；

g)调节pH值至8.0±0.05；

h)使用0.22μm滤膜过滤并收集滤液，贴好标签，2～8℃保存。

2)、异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体

异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体为用异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体得到的产物，具体方法如下：

取1mgTG单克隆抗体(抗体为Fitzgerald公司生产，货号为：10-7834)，用SephadexG25柱子更换缓冲液(脱去原抗体保存缓冲液，更换为0.2mol/L碳酸盐缓冲液PH9.5，16.8g碳酸氢钠溶于1000g纯化水中，PH9.5)，并通过离心浓缩至5mg/mL，加入浓度为0.5mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液(溶剂为浓度为0.2mol/L、pH值为9.5碳酸盐缓冲液)100μL(TG单克隆抗体与异硫氰酸荧光素的配比为1mg：0.05mg)，混合均匀。室温避光反应20小时，得到异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体。

再使用SephadexG25柱子除去未反应的异硫氰酸荧光素，用0.2mol/L碳酸盐缓冲液PH9.5洗脱，收集黄色液体，保存于-20℃，得到纯化后异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体。

3)、试剂A的配制

将上述2)的纯化后异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体与上述1)的抗试剂缓冲液混匀，得到试剂A，其中异硫氰酸荧光素标记抗TG的浓度为0.3ug/ml。

4、试剂B(含一定浓度的碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体)

1)碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体

碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体为用碱性磷酸酶标记TG另一种单克隆抗体得到的产物，具体方法如下：

取1mgTG另一种单克隆抗体(Fitzgerald公司生产，货号为：10-7835)，用SephadexG25柱子更换缓冲液(0.05mol/L三乙醇胺缓冲液，溶剂是水,PH8.6)，并通过离心浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为13.76mg/mL的活化剂2-Iminothiolanehydrochloride(2-IT)溶液(2-IT厂家：thermofisherscientific，货号：26101；溶剂为0.05mol/L三乙醇胺缓冲液PH10.5)5μL(是体积比80:1)，室温放置20分钟后加甘氨酸终止活化反应，室温下放置10分钟。再使用SephadexG25柱子除盐，收集活化后抗体。

取1.5mg碱性磷酸酶(厂家：BBI，批号：1693AA)，上SephadexG25柱子更换缓冲液(0.05mol/L三乙醇胺缓冲液PH8.6)，并通过离心浓缩至5mg/mL，加入浓度为6.69mg/mL的Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)溶液(SMCC厂家：thermofisherscientific，货号：22360，溶剂为DMF，厂家：sigma，货号：227056)12μL，室温放置20分钟，加入甘氨酸终止活化反应，室温放置10分钟。使用SephadexG25柱子除盐，得到活化后碱性磷酸酶。(说明：此处为较通用方法，不用详细描述)。

将活化后的TG抗体(以溶液的形式加入)与活化后碱性磷酸酶(以溶液的形式加入)按1mgTG抗体加入1mg碱性磷酸酶的比例混合，同时加入5μL1M氯化镁水溶液混匀，放置4℃反应20小时。

使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的TG抗体和碱性磷酸酶，用0.05mol/L三乙醇胺缓冲液PH7.0洗脱，洗脱流速为0.75ml/min，柱子直径/长度为1.6/60cm，观察出峰位置并比对标准分子图谱收集连接物，保存于4℃，得到纯化后碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体。

2)、试剂B的配制

将上述1)的纯化后碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体与上述3中1)的抗试剂缓冲液混匀，得到试剂B，其中碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体的浓度为0.5ug/ml。

5、样本稀释液

样本稀释液为将牛血清白蛋白(BSA)、trizmabase和水混匀，得到样本稀释液，牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5％，trizmabase的浓度为0.1mol/L。

6、磁分离试剂(结合有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁微粒混悬液)

磁分离试剂为将羊抗异硫氰酸荧光素抗体血清(多克隆抗体，厂家：解放军总医院第一附属医院实验动物科货号：Y11005)共价连接在磁微粒表面，得到磁分离试剂；其中，抗异硫氰酸荧光素抗体和磁微粒的配比为150μg：1mg。

磁微粒的直径在0.5-1.5μm之间(厂家：merck公司，货号：EM1-100/40)，具有超顺磁性，表面含有羧基(COOH-)活性基团。

磁分离试剂的具体制备方法：

(1)将磁珠与活化剂EDC(购自SIMGA公司，CAS：25952-53-8，货号：E7750)和NHS(购自SIMGA公司，CAS：6066-82-6，货号：130672)以一定比例混合，室温反应120分钟，得到活化磁珠；上述磁珠与活化剂混合比例为：1000mg磁珠中加入5mgEDC和5mgNHS；(2)将活化后磁珠与羊抗异硫氰酸荧光素抗体以一定比例混合，混合比例为：1000mg磁珠中加入150mg羊抗异硫氰酸荧光素抗体，4度振荡反应10小时，得到连接蛋白的磁珠；(3)将连接蛋白后的磁珠用封闭液进行处理，室温封闭1小时，得到磁珠溶液；封闭液为含有1g/100mLBSA的pH7.0、0.01M的MES缓冲液；(4)将(3)得到的磁珠溶液在磁场作用下沉降20分钟后弃上清；将磁珠悬浮于100mlpH7.0、0.01M的MES缓冲液后过1500目材质为304钢的不锈钢筛，过筛过程中，不断振荡并用pH7.0、0.01M的MES缓冲液反复冲洗，直至筛面上剩余不能过筛的团聚颗粒，过筛后的磁珠重新混悬后应颗粒均一，无凝集；(5)将过筛后的磁珠用保存液稀释至5mg/ml，室温混悬2小时后4℃保存，得到结合有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁珠；保存液为含1％牛血清白蛋白的trizmabase缓冲液；再将结合有抗异硫氰酸荧光素抗体的磁珠悬浮在含1％牛血清白蛋白的trizmabase缓冲液中，得到磁分离试剂；

含1％牛血清白蛋白的trizmabase缓冲液为将牛血清白蛋白、trizmabase和水混匀，得到含牛血清白蛋白的trizmabase缓冲液，其中，牛血清白蛋白的浓度为1％(为质量百分含量)、trizmabase的浓度为0.1mol/L。

7、清洗液

清洗液：将吐温-20、氯化钠和pH为8.0±0.05浓度为0.15M的Tris-HCl缓冲液混合，得到清洗液，其中吐温-20的浓度为0.04％(体积百分含量)，氯化钠的浓度为0.25mol/L。

8、底物溶液

底物溶液：将二氢吖啶与浓度为0.25M、pH为8.0±0.05的Tris-HCl缓冲液混匀，溶解，使二氢吖啶终浓度为0.25mg/mL，得到的溶液。

二、利用磁微粒子化学发光免疫试剂盒对样本中甲状腺球蛋白含量进行定量测定

1、原理

图1为磁微粒分离化学发光免疫法检测甲状腺球蛋白示意图。

本发明为夹心法。利用磁微粒子化学发光免疫分析方法对样本中甲状腺球蛋白含量进行定量测定。反应的技术原理为：碱性磷酸酶(AP)标记的甲状腺球蛋白抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的甲状腺球蛋白抗体同样本、校准品或质控品中的甲状腺球蛋白结合，形成“三明治”结构的抗原抗体复合物。随后加入连有抗荧光素抗体的磁性微粒，通过抗荧光素抗体与荧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。弃上清后清洗沉淀复合物，加入酶促化学底物溶液。底物在酶作用下便催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应。使用分析仪检测反应的发光强度。发光强度与样本中甲状腺球蛋白的含量呈正比。

2、甲状腺球蛋白磁微粒分离化学发光免疫检测方法

(1)免疫反应：分别将30μL上述一的试剂盒中的TG校准品、30μL质控品、30μL待测样本至不同反应管内，再分别向各个反应管中加入30μL试剂A和30μL试剂B，置于振荡器上混匀，37℃温育15min；

(2)磁分离：向经过(1)处理的各个反应管中再加入30μL磁分离试剂，置于振荡器上混匀，37℃温育15min，使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200μL磁珠清洗液(将上述一的试剂盒中的清洗液与纯化水按1:7稀释配制成磁珠清洗液)，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬30秒，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次；

(3)读值：向经过(2)处理的各个反应管每管加入200μL底物溶液，用化学发光仪检测发光强度。

具体如下：

将各试剂、样品杯及反应管置于仪器中，严格按照全自动化学发光免疫分析仪的操作程序进行实验操作并计算样本浓度。仪器已具备了实验所需要的反应温度37℃±1℃，该项目的反应时间及操作步骤已输入到全自动的操作程序中，选定该项目(CRP)后即可获得该此项目每一步试验所需的时间，仪器光谱测定范围300nm～650nm。

TG试剂盒在测定范围内，发光强度与待测样本中TG浓度成正比，使用改良的四参数Logistic方程拟合计算出样本中TG浓度。

y＝(A1-A0)/(1+(x/X0)^P)+A0

y：发光强度

x：浓度值

A1：曲线上渐近线估值

A0：曲线下渐近线估值

X0：曲线拐点对应的浓度值

P：曲线斜率相关的参数

实施例2、试剂盒性能评价

根据体外诊断试剂的特点，按惯例检测实施例1制备的试剂盒的线性范围、灵敏度、准确性、精密度。具体操作步骤如下：

一、试剂准备：

实验前，先取出试剂A(异硫氰酸荧光素标记TG单克隆抗体的浓度为0.3ug/ml)、试剂B(碱性磷酸酶标记TG单克隆抗体的浓度为0.5ug/ml)、校准品、磁分离试剂、发光底物、样品稀释液、清洗液浓缩液、质控品，平衡至室温。

二、仪器准备：

本试剂盒采用博奥生物集团有限公司的ChemLite^TM1200全自动化学发光免疫分析仪。

具体如下：

在样品杯中加入校准品、样本或质控品，样本单管反应加样量为30μL，根据重复管数计算样品杯中加入量，最少加样量不小于50μL，加入充足量的试剂。

将各试剂、样品杯及反应管置于仪器中，严格按照全自动化学发光免疫分析仪的操作程序进行实验操作并计算样本浓度。仪器已具备了实验所需要的反应温度37℃±1℃，该项目的反应时间及操作步骤已输入到全自动的操作程序中，选定该项目(TG)后即可获得该此项目每一步试验所需的时间，仪器光谱测定范围300nm～650nm。

四、性能指标检测结果：

1、线性范围：

待测样本为超出线性范围上限浓度的样本和超出或等于线性范围下段的样本，混合成至少5个稀释浓度(Xi)，具体如表1所示，其中稀释比例为1的待测样本为浓度为750ng/mL的TG溶液(溶质：TG抗原，溶剂：校准品缓冲液浓度750ng/mL)。

用实施例1中的一制备的试剂盒和二的检测方法对待测样本进行检测，测定线性范围。每个稀释浓度测试3次。

分别求出测定结果的均值(Yi)，以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(Yi)为因变量，求出线性回归方程，按公式(1)计算线性回归系数(r)。

$r=\frac{\mathrm{\Σ}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\sqrt{\mathrm{\Σ}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2\mathrm{\Σ}{(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}^2}}...\left(1\right)$

使用改良的四参数Logistic方程拟合，在1.0-750ng/mL检测范围内，剂量-反应曲线相关系数r＝0.9996。此检测范围远远优于有专利报道过的同类产品。

表1线性范围实验结果

2、准确度：

待测样本为稀释甲状腺球蛋白(TG)国际标准品(BCR-457)，使其最终浓度为(50±10)ng/mL和(300±60)ng/mL，将其作为样本按照说明书的步骤进行检测，重复测量3次后，其平均值结果记为Cm，根据公式(1)计算测量浓度的相对偏差Cb，偏差应在±10％范围内。

Cb＝(Cm-Cr)/Cr×100％……………………………(1)

式中：

Cb：浓度的相对偏差

Cm：测量浓度的均值

Cr：标定浓度

偏差均在±10％范围内，具体数据见表2。

表2准确度实验结果

3、最低检测限(灵敏度)：

用试剂盒中0μg/mL校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值。

按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，具体数据见表3。

表3最低检测限实验结果

	灵敏度(ng/mL)
		实验1	0.42
实验2	0.16
		实验3	0.36
实验4	0.27

实验5

0.13

4、精密度：

批内：使用TG(10±5)ng/mL和(300±60)ng/mL两个浓度范围内的样本作为待测样本。按说明书的操作方法，用化学发光测定仪器分别对待测样本进行10次重复测定。按公式(3)计算重复性(CV)。

$CV=SD/\stackrel{\‾}{X}\×100\%...\left(3\right)$

$SD=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}{n-1}},(n=10)$

10次测定浓度的平均值

X_i：每次测定浓度值

批间：使用TG浓度为(300±60)ng/mL作为待测样本。使用3个不同批次的试剂盒，按说明书的操作方法，用化学发光测定仪器对待测样本进行30次重复测定(每批次试剂盒测定10次)。按公式(4)计算批间差(CV)。

$CV=SD/\stackrel{\‾}{X}\×100\%...\left(4\right)$

式中：

30次测定浓度的平均值

SD：30次测定浓度的标准差

按检测方案中精密度检测方法检测精密度，具体数据见表4。

表4精密度实验结果

实施例3、本发明提供的试剂盒与国内、外试剂盒比较

1、本发明提供的试剂盒与国内、外试剂盒性能指标比对

表5本试剂盒与国外试剂盒性能指标比对

2、本发明提供的试剂盒与国外试剂盒进行临床样本测值比对

用本发明提供的试剂盒和贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司的检测试剂盒化学发光法)试剂盒分别对96份人血清样品(患者知情)同时进行检测其检测结果见附图2，采用本发明提供的试剂盒测得的血清TG浓度为横坐标，以贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司的TG检测试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y＝1.0598x+2.3965，相关系数r为：0.992。经统计学处理结果表明，本发明提供的试剂盒与国外试剂盒测得的临床样本测值相关性良好。

Claims (10)

1.一种甲状腺球蛋白定量检测试剂盒，为1)或2)：

1)包括异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液；

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液的溶剂均为抗试剂缓冲液；

所述抗试剂缓冲液按照如下方法制备：将溶液A、牛血清、马血清、羊血清、防腐剂混匀得到抗试剂缓冲液；

所述溶液A由Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Trizmabase、动物血清白蛋白和水组成；

2)包括所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体、所述碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：

所述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述防腐剂为ProcLin-300；

所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、所述牛血清、所述马血清、所述羊血清、所述ProcLin-300的配比为1000g：23-28ml：1.5-2.5ml：4.0-5.0ml：0.5-2.0ml；

所述溶液A中，所述Na⁺浓度为0.1-1mol/L，所述Mg²⁺的浓度为1mmol/L，Zn²⁺的浓度为0.1mmol/L,所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.2-1.0％，所述Trizmabase浓度为0.01-0.5mol/L。

3.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于：

所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、所述牛血清、所述马血清、所述羊血清、所述ProcLin-300的配比为1000g：25ml：2ml：4.5ml：1ml；

所述溶液A中，所述Na⁺源于NaCl，所述NaCl浓度为0.1mol/L；

所述Mg²⁺源于MgCl₂，所述MgCl₂浓度为1.0mmol/L；

所述Zn²⁺源于ZnCL₂，所述ZnCL₂浓度为0.1mmol/L；

所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5％；

所述Trizmabase的浓度为0.1mol/L。

4.根据权利要求1-3中任一所述试剂盒，其特征在于：

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液由异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体的浓度为0.1-0.5μg/mL；

所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液由碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-1μg/mL；

所述异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体中的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体中甲状腺球蛋白单克隆抗体不同。

5.根据权利要求1-4中任一所述试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒还包括磁分离试剂；

所述磁分离试剂为将抗异硫氰酸荧光素抗体共价连接在磁珠表面，得到磁分离试剂；

所述抗异硫氰酸荧光素抗体为多克隆抗体；

所述抗异硫氰酸荧光素抗体和所述磁微粒的配比为30μg-200μg：1mg；

所述磁微粒的直径为0.5-1.5μm。

6.根据权利要求1-5中任一所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括校准品；

所述校准品由n个不同浓度的校准品溶液组成，所述校准品溶液由甲状腺球蛋白抗原和校准品缓冲液组成，且所述甲状腺球蛋白抗原在所述校准品中为不同浓度；

所述校准品缓冲液由Na⁺、蛋白类保护剂、防腐剂、Trizmabase、动物血清和水组成，所述Na⁺浓度为0.1-1mol/L,所述蛋白类保护剂的质量百分含量为0.2-1.0％，所述防腐剂体积百分含量为0.05-0.2％，所述Trizmabase浓度为0.01-0.5mol/L，所述动物血清的体积百分含量为0.05-1.0％。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:

所述Na⁺源于NaCl，所述NaCl浓度为0.10mol/L；

所述蛋白类保护剂为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白质量百分含量为0.5％；

所述防腐剂为Proclin-300，所述Proclin-300体积百分含量为0.1％；

所述Trizmabase的浓度为0.1mol/L；

所述动物血清为羊血清，所述羊血清体积百分含量为0.2％。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于:

所述校准品由n个不同浓度的校准品溶液组成，n小于等于6；

所述试剂盒还包括质控品、样本稀释液、清洗液和底物溶液；

所述质控品为2个不同浓度的校准品；

所述清洗液由吐温-20、氯化钠和浓度为0.15M、pH为8.0±0.05的Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述吐温-20的体积百分含量为0.04％，所述氯化钠的浓度为0.25mol/L；

所述底物溶液由二氢吖啶和浓度为0.25M、pH为8.0±0.05的Tris-HCl缓冲液组成，其中，所述二氢吖啶终浓度为0.25mg/mL；

所述样本稀释液由牛血清白蛋白、trizmabase和水组成，其中，所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.2％-5％，所述trizmabase的浓度为0.1mol/L。

9.一种制备权利要求1-8中任一所述的试剂盒的方法，包括如下步骤:将权利要求1-8中任一所述试剂盒中8种组分均独立包装；再整体包装为试剂盒。

10.权利要求1-8中任一所述的试剂盒在甲状腺球蛋白定量检测中的应用；

或权利要求1-8中任一所述的试剂盒在制备甲状腺球蛋白定量检测产品中的应用；

或权利要求1-8中任一所述的试剂盒中8种组分在制备甲状腺球蛋白定量检测产品中的应用；

或一种待测样本中甲状腺球蛋白定量检测方法，包括如下步骤：

1)将权利要求1-8中任一所述的试剂盒中的校准品、质控品和待测样本分别与权利要求1-8中任一所述的试剂盒中的异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和碱性磷酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液混匀，反应，得到免疫反应产物；

2)将所述免疫反应产物与权利要求1-8中任一所述的试剂盒中的磁分离试剂混匀，反应，得到反应产物，将所述反应产物中的沉淀与磁珠清洗液混悬，收集沉淀，即为磁分离产物；

3)将所述磁分离产物和权利要求1-8中任一所述的试剂盒中的底物溶液混匀，得到混合产物，用化学发光仪检测所述混合产物的发光强度，通过发光强度计算待测样本中全量程甲状腺球蛋白定量；

所述磁珠清洗液为将权利要求1-8中任一所述的试剂盒中清洗液与水按1:7混匀，得到溶液；

或权利要求1-8中任一所述的试剂盒中磁分离试剂在甲状腺球蛋白定量检测中的应用。