CN113164769A - 脑功能调节剂以及含有其的食品或饮料产品 - Google Patents

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Abstract

一种含有肽、其盐或其化学修饰产物的脑功能调节剂，所述肽包含由Glu‑Hyp‑Gly表示的氨基酸序列。

Description

脑功能调节剂以及含有其的食品或饮料产品
技术领域
本发明涉及一种脑功能调节剂，以及含有其的食品或饮料产品。
背景技术
已知胶原蛋白水解物(以下也称为“胶原蛋白肽混合物”)对活生物体表现出多种生理活性。近来，已经报道胶原蛋白肽混合物对于脑神经细胞等表现出生理活性，并且对脑功能(如记忆)具有改善的作用(在下文中，也称为“脑功能改善作用”)。例如，日本专利特开号2010-105996(PTL1)公开了一种神经发生促进剂，其包含总共九种胶原蛋白来源的肽，所述肽包括由Gly-Pro-Arg表示的肽。日本专利特开号2011-111440(PTL2)公开了源自胶原蛋白并由Gly-Pro-Ala表示的肽具有促进神经发生的作用。NPL1报道了，将鱼来源的胶原蛋白肽混合物施用于年老的模型小鼠会增加海马中BDNF(脑源性神经营养因子)的表达水平，从而增强空间学习记忆能力和被动回避能力。NPL2报道了，在使用大鼠的实验中，由Pro-Hyp表示的胶原蛋白来源的二肽当转移到脑脊液中时表现出抗抑郁作用。NPL3报道了胶原蛋白水解物促进海马中的神经发生。
引文列表
专利文献
PTL 1:Japanese Patent Laying-Open No.2010-105996
PTL 2:Japanese Patent Laying-Open No.2011-111440
非专利文献
NPL1：Pei Xinrong等人,"Preventive Effect of Marine Collagen Peptide onLearning and Memory Impairment in SAMP8 Mice",Food and FermentationIndustries,2009,Vol 135(07),p.1-5
NPL2：Nagai等人,"Identification of Antidepressant Collagen Peptide andthe Penetration into Cerebrospinal Fluid",Proceedings of 2017Annual Meetingof Japan Society for Bioscience,Biotechnology,and Agrochemistry,5March,2017,p.997NPL3：C.Kakoi等人,"Collagen peptides enhance hippocampal neurogenesis andreduce anxiety related behavior in mice",Biomedical Research 33(5),2012,p.273-279
发明内容
技术问题
NPL1和NPL3没有具体说明哪些胶原蛋白来源的肽产生所公开的脑功能改善作用或神经发生作用。PTL1没有具体说明所述九种胶原蛋白来源的肽中的哪些具有所公开的促进神经发生的作用。在PTL2中公开的促进神经发生的作用是从使用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤来源的PC12细胞的实验中获得的发现，而不是从靶向脑神经细胞的实验中获得的发现。此外，NPL2中公开的Pro-Hyp表明在海马齿状回中具有神经发生作用，但是尚未证实Pro-Hyp是否能使脑神经细胞分化和成长从而改善脑功能。因此，尚不知道胶原蛋白来源的肽可通过直接作用于脑神经细胞而无需体内的信号转导物(如激素)而产生改善脑功能的作用，因此期望开发这种肽。
鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种包含肽等的脑功能调节剂以及含有所述脑功能调节剂的食品或饮料产品，所述脑功能调节剂通过直接作用于脑神经细胞产生改善脑功能的作用和预防脑功能下降的作用中的至少一种。
所述问题的解决方案
在开发通过直接作用于脑神经细胞产生改善脑功能的作用和预防脑功能下降的作用中的至少一种的、包含肽等的脑功能调节剂时，本发明人关注于胶原蛋白肽混合物中所含的肽的氨基酸序列中的Glu-Hyp-Gly(谷氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸，以下可简称为“EOG”，其中每种氨基酸由一个字符表示)。本发明人发现，当作用于脑神经细胞时，所述胶原蛋白肽混合物促进脑神经细胞的分化，从而产生改善脑功能的作用和预防脑功能下降的作用，并从而完成了本发明，所述胶原蛋白肽混合物含有包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的肽，特别是由Glu-Hyp-Gly表示的三肽等。具体地，本发明如下所述。
根据本发明的脑功能调节剂包含肽、其盐或其化学修饰产物，所述肽包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列。
优选地，所述肽、其盐或其化学修饰产物是由Glu-Hyp-Gly表示的三肽、其盐或其化学修饰产物。
优选地，所述肽来源于胶原蛋白。
优选地，所述肽的重均分子量为315以上且10000以下。
优选地，所述脑功能调节剂是脑功能改善剂或脑功能下降预防剂。
优选地，所述脑功能调节剂具有促进脑神经细胞分化的作用。
优选地，所述脑功能调节剂具有脑神经细胞死亡抑制作用。
优选地，所述脑功能调节剂具有记忆或认知功能改善作用。
根据本发明的食品或饮料产品包含所述脑功能调节剂。
本发明的有益效果
根据本发明，可以提供一种包含肽等的脑功能调节剂以及包含所述脑功能调节剂的食品或饮料产品，所述脑功能调节剂通过直接作用于脑神经细胞产生改善脑功能的作用和预防脑功能下降的作用中的至少一种。
附图说明
图1是显示在对雄性小鼠强饲施用EOG后，经过预定时间后，雄性小鼠的血浆(样品a)中的EOG量的图。
图2是显示在对雄性小鼠强饲施用EOG后，经过预定时间后，雄性小鼠的脑脊液(样品b)中的EOG量的图。
图3是显示在对雄性小鼠强饲施用EOG后，经过预定时间后，雄性小鼠的大脑(样品c)中的EOG量的图。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明的实施方案。如本文所用，“A到B”形式的描述表示范围的上限和下限(即A以上且B以下)，并且当没有为A描述单位，只为B描述单位时，A的单位与B的单位相同。
[脑功能调节剂]
根据本发明的脑功能调节剂包含肽、其盐或其化学修饰产物，所述肽包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列。具有这种特征的脑功能调节剂可以通过直接作用于脑神经细胞来促进脑神经细胞的分化，从而产生改善脑功能的作用和预防脑功能下降的作用。
<包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的肽、其盐或其化学修饰产物>
如上所述，所述脑功能调节剂包含肽、其盐或化学修饰产物，所述肽包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列。除非另有说明，否则本文所用的术语“氨基酸”是指“L-氨基酸”。术语“包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的肽”是指构成这种肽的氨基酸序列包含一个或多个由“Glu-Hyp-Gly(谷氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸)”表示的氨基酸序列。
在所述脑功能调节剂中，所述肽、其盐或其化学修饰产物优选地是由Glu-Hyp-Gly表示的三肽、其盐或其化学修饰产物。优选地，所述脑功能调节剂能更显著地发挥促进脑神经细胞分化的作用。
术语所述肽的“盐”可以例如是，诸如盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐的无机酸盐；诸如甲磺酸盐、苯磺酸盐、琥珀酸盐或草酸盐的有机酸盐；诸如钠盐、钾盐或钙盐的无机碱盐；诸如三乙铵盐的有机碱盐。
术语所述肽的“化学修饰产物”是其中作为结构单元的氨基酸残基的游离官能团被化学修饰的肽。化学修饰可以在例如羟脯氨酸的羟基上、N末端(氨基末端)侧上的氨基酸的氨基上以及C末端(羧基末端)侧上的氨基酸的羧基上进行。用于化学修饰的具体方法和处理条件遵循已知的用于肽的化学修饰的常规技术。通过这种化学修饰获得的所述肽的化学修饰产物可以在弱酸性至中性条件下对溶解度产生增强作用，对与其他活性成分的相容性产生增强作用等。
例如，可以对Glu-Hyp-Gly的三肽进行O-乙酰化，为羟脯氨酸中羟基的化学修饰。所述O-乙酰化可以通过在水性溶剂或非水性溶剂中将乙酸酐施加于所述肽来进行。可以进行酯化、酰胺化等，为甘氨酸中的羧基的化学修饰。所述酯化可以通过将所述肽悬浮在甲醇中，然后使干燥的氯化氢气体通过所得的悬浮液来进行。所述酰胺化可以通过将碳化二亚胺等施加于所述肽来进行。
可以进行甲基化，为所述三肽中游离氨基的化学修饰。可以进行磷酸化和硫酸化中的至少一种，为所述三肽中羟基的化学修饰。
优选地，所述肽来源于胶原蛋白。在本文中，作为原料的胶原蛋白可以通过以下方式获取：对例如动物(代表性地，为牛、猪、绵羊、鸡或鸵鸟)的皮肤、真皮、骨、软骨、腱等或鱼的骨、皮肤、鳞片等进行已知的常规脱脂或脱钙处理、提取处理等。此外，明胶可用作所述肽的原料。所述明胶可以通过已知的常规方法(例如用热水提取)来处理由此获得的胶原蛋白来获得。对于所述胶原蛋白和明胶，可以将市售产品用作原料。
所述肽可以通过用组合的两种或更多种内切型蛋白酶和外切型蛋白酶将所述胶原蛋白和/或所述明胶水解来获得。该肽可以作为胶原蛋白肽混合物获得，所述胶原蛋白肽混合物由于水解而与其他胶原蛋白肽一起存在，但是，所述胶原蛋白肽混合物本身和通过将所述胶原蛋白肽混合物部分纯化而获得的混合物中的任何一种都可以被用作根据本发明的脑功能调节剂。通过进一步纯化所述胶原蛋白肽混合物，可以以高纯度获得包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的肽。当所述肽来源于胶原蛋白时，优选通过使用如下所述的其中对胶原蛋白或明胶进行两阶段酶处理的方法来获得所述肽。
此外，所述肽的重均分子量优选地为315以上且10000以下。所述肽的重均分子量更优选为315以上且5000以下，更优选为315以上且2000以下。当所述肽的重均分子量在上述范围内时，所述脑功能调节剂能更显著地发挥促进脑神经细胞分化的作用，从而产生更充分的改善脑功能的作用和预防脑功能下降的作用。当所述肽的重均分子量大于10000时，所述脑功能调节剂可能具有不足的脑功能改善作用和脑功能下降预防作用。
可以通过在以下测量条件下进行尺寸排阻色谱法(SEC)，来确定肽的重均分子量。
仪器：高效液相色谱(HPLC)(由TOSOH CORPORATION制造)
柱：TSKGel(注册商标)G2000SWXL
柱温：40℃
洗脱液：45质量％乙腈(含0.1质量％TFA)
流速：1.0mL/min
注射量：10μL
检测：UV 214nm
分子量标记：使用以下五种类型
Figure BDA0003082592530000061
具体地，将含有约0.2g肽(胶原蛋白肽混合物)的样品添加到约100ml蒸馏水中，搅拌该混合物，然后用0.2μm滤器过滤以制备测量重均分子量的样品(测量样本)。通过对所述测量样本进行尺寸排阻色谱分析，可以确定所述肽的重均分子量。当所述肽是由Glu-Hyp-Gly表示的三肽时，其分子量可以是重均分子量。
<脑功能调节剂的制备方法>
所述脑功能调节剂中所含的且包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的肽，可以通过使用已知的常规液相或固相肽合成方法或包括水解胶原蛋白或明胶在内的方法来获得。例如，从效率的观点出发，优选地，通过使用如下所述的使用氨基酸的化学合成方法，或如下所述包括对胶原蛋白或明胶进行两阶段酶处理的方法，来制备所述肽。此外，所述肽可以通过使用包括仅用次级酶而省略初级酶来进行酶处理的方法，或包括同时用初级酶和次级酶进行酶处理的方法来生产，而不是使用包括对胶原蛋白或明胶进行两阶段酶处理的方法。
(化学合成方法)
所述肽可以通过使用常规的肽合成方法获得。作为肽合成方法，已知固相合成方法和液相合成方法。作为固相合成法，已知有Fmoc法和Boc法。所述肽可以通过使用Fmoc方法和Boc方法中的任一种来获得。在下文中，将描述用于合成由例如Glu-Hyp-Gly表示的三肽的方法，为固相肽合成方法。
首先，提供直径为约0.1mm并且具有用氨基修饰的表面的聚苯乙烯聚合物凝胶的珠粒作为固相。另外，提供二异丙基碳二亚胺作为缩合剂。接着，用Fmoc(芴基-甲氧基-羰基)来保护甘氨酸的氨基，其是氨基酸序列的C-末端(羧基末端)侧上的氨基，通过使用缩合剂的脱水反应将上述甘氨酸的羧基与上述固相上的氨基进行肽键键合。此外，将所述固相用溶剂洗涤以除去残留的缩合剂和氨基酸，然后除去与固相以肽键键合的甘氨酸的氨基的保护基(脱保护)。
随后，提供其中氨基被Fmoc基团保护的羟脯氨酸，并且通过使用缩合剂使所述羟脯氨酸的羧基以肽键键合至甘氨酸的脱保护的氨基。之后，以与上述相同的方式，对所述羟脯氨酸的氨基进行脱保护，提供用Fmoc基保护的谷氨酸，并进行使谷氨酸与羟脯氨酸肽结合的反应，从而在固相上合成由Glu-Hyp-Gly表示的三肽。最后，将所述谷氨酸的氨基脱保护，在室温下加入含有三氟乙酸的溶液，并将所述混合物摇动固定的时间以将所述三肽与固相分离。这样就可以产生所述三肽。
(使用胶原蛋白和明胶的生产方法)
下文中，将描述通过对胶原蛋白或明胶进行两阶段酶处理来制备由Glu-Hyp-Gly表示的三肽(下文中也称为“特定肽”)的方法，作为用于制备所述肽的方法的实例。
术语“两阶段酶处理(胶原蛋白或明胶)”是指以下内容。即，初级酶处理通过已知的破坏胶原蛋白或明胶的肽键的常规方法进行，然后用具有氨肽酶N活性的酶、同时具有氨肽酶N活性和脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶、或具有氨肽酶N活性的酶和具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶的组合进行次级酶处理。通过进行初级酶处理，可以获得胶原蛋白肽混合物前体。通过进一步进行次级酶处理，可以从胶原蛋白肽混合物前体获得含有特定肽的胶原蛋白肽混合物。以下将更详细地描述用于两阶段酶处理胶原蛋白或明胶的方法。
-初级酶处理-
初级酶处理中使用的酶只要是能够破坏胶原蛋白或明胶的肽键的酶即可，没有特别限制，可以使用任何蛋白水解酶。具体地，其实例包括胶原酶、硫醇蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和金属蛋白酶。选自由这些酶所组成的组中的一种可以被单独使用，或者可以将其两种或更多种组合使用。作为硫醇蛋白酶，可以使用来源于植物的木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶，来源于动物的组织蛋白酶和钙依赖性蛋白酶等。作为丝氨酸蛋白酶，可以使用胰蛋白酶、组织蛋白酶D等。作为酸性蛋白酶，可以使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。考虑到脑功能调节剂用于药物、特定的保健食品等，优选地，使用除源自病原微生物的酶以外的那些酶，作为初级酶处理中使用的酶。
基于100质量份的胶原蛋白或明胶，初级酶处理中的酶的量例如优选为上述酶的0.1至5质量份。优选地，初级酶处理中的处理温度和处理时间分别为30至65℃和10分钟至72小时。通过初级酶处理获得的胶原蛋白肽混合物前体的重均分子量优选为500至10000，更优选为500至5000，还更优选为500至2000。可以说，当重均分子量在上述范围内时，可以适当地产生具有适当分子量的肽。如果需要，可以在初级酶处理后使酶失活。在这种情况下，失活温度例如优选为70至100℃。胶原蛋白肽混合物前体的重均分子量可以通过使用SEC的方法来确定。
-次级酶处理-
在所述次级酶处理中使用的酶的实例包括具有氨肽酶N活性的酶、同时具有氨肽酶N活性和脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶、或者具有氨肽酶N活性的酶和具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶的组合。如本文所用，术语“具有氨肽酶N活性的酶”是具有从肽链的N末端侧释放氨基酸的功能的肽酶，其中当脯氨酸或羟脯氨酸以外的氨基酸存在于N末端侧的第二个位置时，所述酶起作用。如本文所用，术语“具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶”是这样一种肽酶，其从肽的N末端侧仅释放三个氨基酸残基，所述肽在所述N末端侧的第三位置具有脯氨酸或羟脯氨酸。考虑到脑功能调节剂用于药物、特定的保健食品等，优选地，使用除源自病原微生物的酶以外的酶，作为次级酶处理中使用的酶。
具有氨肽酶N活性的酶的实例包括氨肽酶N(EC 3.4.11.2.；T.Yoshimoto等人,Agric.Biol.Chem.,52:217-225(1988))，以及来源于曲霉属的具有氨肽酶N活性的酶。具有脯氨酰三肽氨肽酶活性的酶的实例包括脯氨酰三肽基氨肽酶(EC 3.4.14.；A.Banbula等人,J.Biol.Chem.,274:9246-9252(1999))。
通过进行次级酶处理，可以获得含有胶原蛋白肽混合物前体中未包含的肽的胶原蛋白肽混合物。具体地，可以获得包含特定肽的胶原蛋白肽混合物。
基于100质量份的胶原蛋白肽混合物前体，所述次级酶处理中的酶的量例如优选为上述酶的0.01至5质量份。优选地，所述次级酶处理中的处理温度和处理时间分别为30至65℃和1至72小时。通过所述次级酶处理获得的胶原蛋白肽混合物的重均分子量优选为315至10000，更优选为315至5000，还更优选为315至2000。所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量可以通过使用SEC的方法来确定。
所述次级酶处理主要是为了产生特定肽而进行的。因此，优选在次级酶处理中调节酶的量、处理温度、处理时间和pH，以使胶原蛋白肽混合物前体中所含的肽不会被过度水解。因此，所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量优选在上述范围内。在所述次级酶处理后有必要使所述酶失活。在这种情况下，失活温度例如优选为70至100℃。另外，优选在120℃下进行数秒或更久的灭菌处理。另外，所述胶原蛋白肽混合物可以通过在200℃或更高的温度加热来进行喷雾干燥。
在所述次级酶处理中，不仅可以使用具有氨肽酶N活性的酶和具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶，而且可以使用具有不同活性的酶，并且可以组合使用各自具有不同活性的两种或更多种酶。因此，副产物可以被消化和去除。优选地，根据用作原料的胶原蛋白的类型和在所述初级酶处理中使用的酶的类型，适当地选择在这种情况下使用的酶。不同活性的实例包括二肽酶活性，例如脯氨酸肽酶(prolidase)活性和羟脯氨酸肽酶(hydroxyprolidase)活性。因此，副产物(如二肽)可以被消化和去除。
此外，氨肽酶N活性基本上是引起在N末端侧的氨基酸逐个释放的活性。因此，在通过初级酶处理获得的胶原蛋白肽混合物前体包含分子量非常大的肽的情况下，当仅用具有氨肽酶N活性的酶进行次级酶处理时，所述次级酶处理的持续时间明显增加。为了应对这种情况，例如，可以在所述次级酶处理中使用脯氨酰寡肽酶，所述脯氨酸寡肽酶是具有引起羧基侧脯氨酸水解的活性(脯氨酸肽酶活性)的肽链内切酶。因此，可以有效地进行所述次级酶处理。
在包括两阶段酶处理胶原蛋白或明胶的方法中，所述初级酶处理能够产生具有相对大分子量的肽。该肽可以具有例如由[X1-Gly-X2-Glu-Hyp-Gly](X1和X2≠Hyp)表示的氨基酸序列。在随后的次级酶处理中，具有氨肽酶N活性的酶作用于由[X1-Gly-X2-Glu-Hyp-Gly]表示的肽，从而释放N末端的X1以获得具有由[Gly-X2-Glu-Hyp-Gly]表示的氨基酸序列的肽。接下来，具有氨肽酶N活性的酶两度作用于由[Gly-X2-Glu-Hyp-Gly]表示的肽，从而释放甘氨酸和X2以获得由[Glu-Hyp-Gly]表示的肽。以这种方式，可以产生特定肽。
-胶原蛋白肽混合物的纯化-
通过如上所述进行两阶段酶处理，可以制备含有特定肽的胶原蛋白肽混合物。由于所述胶原蛋白肽混合物包含除特定肽之外的肽，即，除由Glu-Hyp-Gly表示的三肽以外的肽，因此如果需要，优选纯化所述胶原蛋白肽混合物。作为这种情况下的纯化方法，可以使用已知的常规方法，其实例包括超滤和多种类型的液相色谱法，例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和亲和色谱法。
具体地，可以按照以下步骤纯化所述胶原蛋白肽混合物。即，将约2g/10ml的胶原蛋白肽混合物加载到离子交换柱(例如，由TOSOH CORPORATION制造的“TOYOPEARL”(注册商标)DEAE-650”(商品名))中，然后收集用蒸馏水洗脱的第一孔隙体积级分。随后，将所述第一孔隙体积级分装载到具有与上述离子交换柱的离子交换基团相反的离子交换基团的柱(例如，由TOSOH CORPORATION制造的“TOYOPEARL”(注册商标)SP-650)中，然后收集用蒸馏水洗脱的第二孔隙体积级分。
接下来，将所述第二孔隙体积级分加载到凝胶过滤柱(例如，GE HealthcareJapan Corporation生产的“SEPHADEX LH-20”(商品名))中，并用30质量％的甲醇水溶液洗脱以收集含有特定肽的级分。最后，使用具有反相柱(例如，Waters Corporation制造的“μBondasphere 5μC18
Figure BDA0003082592530000111
Column”(商品名))的高效液相色谱(HPLC)，根据包含0.1质量％的三氟乙酸的32质量％或更低的乙腈水溶液的线性浓度梯度，将所述级分进行分级分离。以此方式，可以以高纯度获得所述特定肽。
<脑功能改善剂或脑功能下降预防剂>
本发明的脑功能调节剂优选为脑功能改善剂或脑功能下降预防剂。所述脑功能调节剂含有肽、其盐或其化学修饰产物，所述肽包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列，并且，如以下的[评估测试1]和[评估测试2]所述，可以通过直接作用于脑神经细胞而发挥促进脑神经细胞分化的作用。以此方式，所述脑功能调节剂可以产生脑功能改善作用和脑功能下降预防作用。因此，所述脑功能调节剂可被用作脑功能改善剂用于治疗脑功能下降的患者。所述脑功能调节剂还可以被用作脑功能下降预防剂，以预防由于衰老等引起的脑功能下降。
优选地，所述脑功能调节剂具有促进脑神经细胞分化的作用。此外，优选地，所述脑功能调节剂具有脑神经细胞死亡抑制作用。所述脑功能调节剂还优选具有记忆或认知功能改善作用。如以下[评估测试1]和[评估测试2]中所述，所述脑功能调节剂可通过直接作用于脑神经细胞而表现出促进脑神经细胞分化的作用。根据下述的[评估测试1]和[评估测试2]，可以认为所述脑功能调节剂具有脑神经细胞死亡抑制作用。通过这些作用，所述脑功能调节剂可以表现出记忆或认知功能改善作用。
所述脑功能调节剂可以以多种形式口服或肠胃外施用。对于这些形式，所述脑功能调节剂当口服施用时可以采取以下剂型，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、液体剂、混悬剂和乳剂。此外，可以将任意上述剂型的脑功能调节剂与食品或饮料产品混合。
当肠胃外施用时，所述脑功能调节剂可以采取以下剂型，例如注射到脑中的制剂、注射剂、透皮制剂、栓剂、鼻腔制剂和吸入剂。所述脑功能调节剂的优选剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂和直接注射到脑中的液体剂。所述脑功能调节剂含有例如由Glu-Hyp-Gly表示的三肽，并且所述三肽在肠道中被迅速吸收，因此可以口服。
所述脑功能调节剂的剂量根据受试者的年龄、性别、体重和敏感性差异、施用方法、施用间隔、制剂类型等而变化。当口服施用所述脑功能调节剂时，其每位成人的剂量例如优选为0.0001至2500mg/kg，更优选为0.0001至500mg/kg。当所述脑功能调节剂的剂型是例如片剂时，所述片剂含有的所述脑功能调节剂的量可以为每片0.001至80质量％，而当所述脑功能调节剂的剂型是例如散剂时，所述散剂含有的所述脑功能调节剂的量可以为0.001至100质量％。当将所述脑功能调节剂肠胃外施用或通过另一种形式的制剂施用时，可以参考口服施用的剂量适当地确定剂量。所述脑功能调节剂可以每日一次或分几次施用，或每日一次或每几日一次施用。
所述脑功能调节剂可以适当地包含其他活性成分、制剂载体等，只要不对本发明的效果产生不利影响即可。其他活性成分的实例包括二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、虾青素、银杏叶提取物和花生四烯酸。此外，用于配制成药物制剂的药学上可接受的载体的实例包括稀释剂、粘合剂(糖浆、***胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶和聚乙烯烷酮)、赋形剂(乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钾、山梨糖醇和甘氨酸)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅)、崩解剂(马铃薯淀粉)和润湿剂(月桂基硫酸钠)。
<用途发明>
根据本发明的脑功能调节剂包含肽、其盐或其化学修饰产物，所述肽包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列。所述脑功能调节剂具有促进脑神经细胞分化的作用，为包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的肽(例如由Glu-Hyp-Gly表示的三肽)的未知属性，因此，可以获得脑功能改善效应和脑功能下降预防效应中的至少一种。换句话说，本发明是一种用于调节脑功能的肽(其包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列)，其盐或其化学修饰产物。
[食品或饮料产品]
根据本发明的食品或饮料产品含有所述脑功能调节剂。例如，优选包含在所述脑功能调节剂中的由Glu-Hyp-Gly表示的三肽在肠道中被迅速吸收，因此可以口服施用。因此，本发明的脑功能调节剂可以作为食品或饮料产品来施用，其中所述脑功能调节剂与食品或饮料混合。此外，根据本发明的食品或饮料产品可以被用作用于特定健康用途的食品或具有功能要求的食品。所述食品或饮料产品中所含的所述脑功能调节剂的浓度优选为0.001至100质量％。
实施例
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明，所述实施例不应被解释为限制本发明。
[评估测试1：临床测试]
<测试食品(含有脑功能调节剂的食品或饮料产品)
作为测试食品，使用包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列的胶原蛋白肽混合物(由Nitta Gelatin Inc.制造的“胶原蛋白肽CP-B”(商品名))。在下述测试期间，每天一次将5g添加到饮料中的测试食品施用于受试者。没有指定所述饮料的施用时间。
<测试设计>
测试时间为从2016年10月20日至11月21日选择的连续四周。在京都大学Kokoro研究中心进行了开放标签干预前后的对比测试。在该测试中，按照世界医学会的《赫尔辛基宣言》的精神对所有受试者进行了知情同意程序，并获得了所有受试者的书面同意。2015年9月18日，京都大学心理高级研究单元伦理审查委员会批准了此测试(批准号27-P-13)。
在此测试中，获得了灰质体积-脑保健商数(GM-BHQ)得分、部分各向异性-脑保健商数(FA-BHQ)得分、轻度认知障碍(MCI)得分和标准言语配对联想学习(S-PA)得分，以评估测试食品对脑功能的影响。
<受试者>
在该测试中，受试者是30名年龄在49至63岁之间的健康人(平均年龄：56.1±3.6岁)。受试者的资格的主要标准如下：“在测试开始前一个月内未服用胶原蛋白水解物的人”，“没有包括明胶过敏在内的主要食物过敏史的人”，以及“没有神经***疾病(例如脑梗塞和痴呆)以及心理疾病史的人”。此外，属于“https://www.acrin.org/Portals/0/Protocols/6684/ACRIN6684_Amend7_012412_master_ForOnline.pdf”第6节所述项目的人被排除在受试者之外。在测试期间，一名受试者因个人原因退出。此外，由于个人原因，五名受试者未接受获得S-PA得分的测试。因此，根据测试方案对24名进行获得S-PA得分的测试的受试者以及29名进行其他测试的受试者进行统计学分析。
<评估方法和评估结果>
(MRI扫描)
在开始施用测试食品的前一天(以下，也称为“干预前”)和结束施用测试食品的后一天(开始施用后第29天；以下也称为“干预后”)，进行磁共振成像(MRI)扫描。干预前的MRI成像在2016年10月20日至10月24日之间进行，而干预后的MRI成像在2016年11月18日至11月21日之间进行。所述MRI成像在京都大学Kokoro研究中心进行。具体的MRI扫描方法遵循“Nemoto K等人,"MRI-based Brain Healthcare Quotients:A bridge between neuraland behavioral analyses for keeping the brain healthy",PLoS ONE,2017,12(10):e0187137(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187137)”中描述的方法。
作为MRI设备，使用德国西门子公司(Siemens AG)的3T扫描仪“Verio”，并用32通道磁头阵列线圈进行MRI成像。对于三维T1加权图像，使用了MP-RAGE脉冲序列。参数如下。重复时间(TR)：1900毫秒；回波时间(TE)：2.52毫秒；反转时间(TI)：900毫秒；翻转角：9°；矩阵尺寸：256×256；视场(FOV)：256毫米；层厚：1毫米。使用GRAPPA通过自旋回波-回波平面成像(SE-EPI)采集弥散张量成像(DTI)。弥散张量成像的层与OM线平行。
参数如下。重复时间(TR)：14100毫秒；回波时间(TE)：81毫秒；翻转角：90°；矩阵尺寸：114×114；视场(FOV)：224毫米；层厚：2毫米。获得了基线图像(b＝0s/mm2)和30个弥散方向的图像，其中b＝1000s/mm2。
使用作为脑功能映射工具的SPM 12，从T1加权图像中提取灰质，然后根据灰质容量和颅容量来计算整个大脑的GM-BHQ分数。使用软件FSL 5.0.11从弥散张量成像生成部分各向异性(FA)图像，并根据FA图像计算整个大脑的FA-BHQ分数。
在此，用于在计算GM-BHQ得分和FA-BHQ得分的过程中进行的统计分析的工具是医学统计程序“STAT Mate III”。为了评价显著性，根据Wilcoxon秩和检验进行干预前后的组内比较，并确定当显著性水平(P值)为0.05或更低时，存在显著性。下表1示出了对于GM-BHQ得分和FA-BHQ得分的每一个的干预前与干预后的值、这些值之间的差异以及Pvalue(P值)。在表1中，字符“N”表示受试者的数量，术语“基线”表示干预前的值，术语“后”表示干预后的值，符号“Δ”表示干预前后的差异。
[表1]
Figure BDA0003082592530000161
*基于Wilcoxon秩和检验
如表1所示，与干预前的FA-BHQ得分相比，干预后的FA-BHQ得分显著改善。GM-BHQ得分没有显著改善。因此，测试食品(含有由Glu-Hyp-Gly表示的三肽作为脑功能调节剂的胶原蛋白肽混合物)显示出具有脑功能调节作用。
(MCI得分)
轻度认知障碍(MCI)得分是通过使用“About MCI Screen(MillenniaCorporation制造)”作为认知功能检查量表来计算的。具体地，受试者学习了10个单词，并且确定了在听了与测试无关的评论之后受试者能够以口头报告的单词(在所述10个单词中)的数量。根据诸如性别、年龄、学习年限和种族等信息，将每个受试者的测试结果与同一年龄组的测试结果进行比较，并以客观的方式进行人口统计学评估，以校正每个受试者的MCI得分。在对每个受试者进行MRI扫描的同一天进行该测试。
(S-PA)得分
日本高级脑功能障碍协会制定了标准的言语配对联想学习(S-PA)得分，用于了解人类的言语记忆。S-PA得分的测试的具体步骤如下。首先，提供具有10对相关配对单词(语义上相关的单词)和10对不相关配对单词(语义上几乎不相关的单词)的纸片。接下来，考查者口头朗读纸上所述的10对相关的配对单词，并由受试者学习。此后，考查者展示了每对成对单词中的一个单词，并且受试者报告与所展示的单词成对的单词。接下来，考查者口头朗读纸上所述的10对不相关的配对单词，并由受试者学习。此后，考查者展示了每对成对单词中的一个单词，并且受试者报告与所展示的单词成对的单词。最后，根据受试者正确报告的单词数计算出每个受试者的S-PA得分。干预前所提供的在纸片上描述的10对相关配对单词和10对不相关的配对单词与干预后提供的在纸片上描述的那些不同。在对每个受试者进行MRI扫描的同一天进行该测试。
这里，“STAT Mate III”还用作在计算MCI得分和S-PA得分的过程中进行统计分析的工具。为了评价显著性，根据Wilcoxon秩和检验进行干预前后的组内比较，并确定当显著性水平(P值)为0.05或更低时，存在显著性。下表2示出了对于MCI得分和S-PA得分的每一个的干预前与干预后的值、这些值之间的差异以及Pvalue(P值)。在表2中，字符“N”表示受试者的数量，术语“基线”表示干预前的值，术语“后”表示干预后的值，符号“Δ”表示干预前后的差异。
[表2]
Figure BDA0003082592530000171
*基于Wilcoxon秩和检验
如表2所示，与本发明之前的得分相比，干预后的MCI得分和S-PA得分均有显著改善。当根据表1中的结果进行评论时，表2中的结果表明，测试食品通过其脑功能调节作用而具有记忆或认知功能的改善作用，从而产生脑功能的改善作用。此外，上述结果表明，测试食品还具有防止脑功能下降的作用。因此，所述脑功能调节剂可被用作脑功能改善剂或脑功能下降预防剂。
(脑功能调节剂对个体受试者脑功能的作用)
在个体受试者中检查了GM-BHQ得分的升高或降低和FA-BHQ得分的升高或降低与MCI得分的升高或降低和S-PA得分的升高或降低是否相关，以研究所述脑功能调节剂对所述个体受试者脑功能的作用。对于相关性，根据所测量的值计算Spearman秩相关系数(r)，并对干预前后获得的值进行统计处理。为了进行统计处理，使用了“STAT Mate III”。已经确定，当r为0.2或更小时，“没有相关性”；当r大于0.2且小于等于0.4时，“相关性较低”；当r大于0.4且小于等于0.7时，“存在相关性”；当r大于0.7且小于1时，“有很强的相关性”；以及当r为1时，“存在完全相关性”。表3示出了作为评估结果的r的值。
[表3]
N ΔGM-BHQ ΔFA-BHQ
ΔMCI 29 0.4448# -0.0502
ΔS-PA 24 0.2438 0.4645#
#：P<0.05，基于Spearman秩相关系数(r)
如表3所示，GM-BHQ得分的升高或降低与MCI得分的升高或降低之间存在相关性，并且FA-BHQ得分的升高或降低与S-PA得分的升高或降低之间存在相关性。
<讨论>
根据上述结果，可以推测，包含特定肽的脑功能调节剂对个体受试者的脑功能有作用，使得所述脑功能调节剂可改善FA-BHQ得分从而改善S-PA得分，还可改善GM-BHQ得分从而改善MCI得分。因此，所述脑功能调节剂可被用作脑功能改善剂或脑功能下降预防剂。
[评估测试2：细胞生物学测试(体外测试)
<样品的制备>
所有的动物实验均符合内阁行政总局的“实验动物饲养和照护标准”和Josai大学生命科学研究中心的“动物实验指南”。通过从CREA Japan，Inc.购买，提供15至25周龄的雄性和雌性Wistar大鼠。此后，在以下条件下饲养所述大鼠：温度为23±2℃，相对湿度为55±10％，照明周期为12小时，所述照明周期从7:00开始到19:00结束，并且给所述大鼠饲喂固体饲料(CREA Japan，Inc制造的“CE-2”(商品名))并允许自由获取饮用水。在与上述相同的条件下，使所述大鼠交配以获得7日龄的大鼠。此外，通过从CREA Japan，Inc.购买，提供3至8日龄的Wistar大鼠。
(原代培养的小脑颗粒细胞(CGC)的制备和培养)
将Wistar大鼠在上述条件下饲养至7至9日的年龄，然后从这些大鼠切下小脑，并使用表4所示的分散溶液(液体I至V)通过下述方法将其分散。以此方式，分散体含有来自小脑的颗粒细胞和其他脑神经细胞(下文中，这些细胞也统称为“小脑颗粒细胞(CGC)”)。所述小脑颗粒细胞(CGC)是脑神经细胞。之后，培养分散体中所含的CGC。表4示出了分散溶液的“溶液名称”、“包含的试剂”及其“量”。用于制备所述小脑颗粒细胞(CGC)的方法如下。
[表4]
Figure BDA0003082592530000191
Figure BDA0003082592530000201
首先，将所述7至9日龄的大鼠中的十只断头，并在干净的工作台上切下小脑，然后在去除不必要的组织、血管、绒毛膜等之后用剃刀将其形成碎糊。将液体I添加到所述糊中以得到悬浮液，并将该悬浮液以1000rpm离心30秒以获得包含上清液和细胞团的第一分离液体。从所述第一分离液体中去除上清液，然后将在恒温浴中预热至37℃的液体II一点一点地添加到剩余的细胞团中，并搅拌所述混合物，将其移至50mL的中型瓶中，并在37℃下进一步搅拌15分钟以用胰蛋白酶进行组织消化。
接下来，将液体IV添加至所述中型瓶以使胰蛋白酶失活，并且将所述混合物以1000rpm离心30秒以获得包含上清液和细胞团的第二分离液体。从所述第二分离液体中去除上清液，然后用巴斯德移液器将少量液体III添加到剩余的细胞团中，以将所述细胞团分散。此后，将所述混合物静置15分钟以获得包含上清液和细胞团的第三分离液体，并将所述上清液取出至液体V中。向留在第三分离液体中的细胞团中添加少量的液体III以使所述细胞团重新分散。此后，将所述混合物静置5至10分钟以获得含有上清液和细胞团的第四分离液体，并将所述上清液取出至含有第三分离液体的上清液的液体V中。
将含有第三分离液体的上清液和第四分离液体的上清液的液体V以1000rpm离心5分钟，得到含有上清液和细胞团的第五分离液体。从所述第五分离液体中去除上清液，然后将基础培养基(BME：Sigma-Aldrich Co.LLC制造的基础培养基Eagle)添加到剩余的细胞团中，并将所述混合物搅拌以得到含有小脑颗粒细胞(CGC)和BME的混合液。之后，将所述混合液用浓度为0.4质量％的台盼蓝溶液染色，并测定染色的细胞数及其生存力。
接下来，将K+5mM血清(+)BME以活细胞的细胞密度为1.2×105个细胞/mL的方式添加到所述混合液中，并将所述混合物悬浮以获得培养物样品。将培养物样品以0.766mL/孔接种在预先涂有聚L-赖氨酸(PLL)的12孔板中，样品浓度为50μg/mL，并在37℃、CO2浓度为5体积％的环境下在培养器中培养(“在培养开始后的第0天”)。
在培养开始后的第1天，向每个孔中加入胞嘧啶β-D-***呋喃糖苷(AraC)至终浓度为10μM，用于抑制非神经元细胞的生长，而仅保持CGC的生长。此外，在下述对照样品中，加入KCl至终浓度为25mM。在其他样品(含有下表5至表7所示的肽或氨基酸的样品)中，添加KCl并将最终浓度调整为15mM。
此外，在培养开始后的第1天和第4天，将表5至7所示的肽或氨基酸分别添加至表5至7所示的最终浓度，以制备样品。
在开始培养后的第7天，通过MTT试验测量CGC的生存力，以检验每个样品是否对CGC具有促进分化的作用。具体地，确定每个样品中的活细胞数与KCl浓度为25mM的对照样品中的活细胞数的百分比比率，并进行统计学处理，以评价对CGC的分化促进作用的显著性。使用软件(“Social Survey Research Information Co.，Ltd.制造的“BellCurve forExcel(版本2.1)”(商品名))进行显著性评估、统计学处理，进行了Smirnov-Grubbs(双侧检验)，并且将拒绝(refusal)的显著性水平(P值)设置为0.05。此后，进行了学生t检验(t检验)以评估显著性。表5至表7示出了结果。表5至表7中带有“*(星号)”的样品被确定为对CGC具有分化促进作用(具有显著性)。
这里，在表5中，“对照(K+)”是指对照样品。“NMDA”(Sigma-Aldrich Co.LLC制造的“M3262”(商品名))是指含有N-甲基-D-天冬氨酸的样品，而“BDNF”(Sigma-Aldrich Co.LLC制造的“SRP3014”(商品名))是指含有脑源性神经营养因子的样品。已知“NMDA”和“BDNF”涉及脑神经细胞的分化，并在本测试中分别被用作参考例。
此外，对于表5至表7中所示的肽，使用缩写，其中氨基酸由一个字符表示。C代表环状结构、H代表组氨酸、P代表脯氨酸、G代表甘氨酸、O代表羟脯氨酸、E代表谷氨酸、A代表丙氨酸。即，在表5中，“C-HP”是指含有由组氨酸-脯氨酸组成的环状二肽的样品(由PH JapanCo.,Ltd.制造)，“C-GP”是指含有由甘氨酸-脯氨酸组成的环状二肽的样品(由PH JapanCo.,Ltd.制造)，以及“TRH”是指含有促甲状腺激素释放激素的样品(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。已知这些样品可以通过血脑屏障，并且各自被用作对比例。在表5中，“谷氨酸”是指含有已知具有抗氧化作用的谷氨酸的样品(由Sigma-Aldrich Co.LLC制造的“G1251”(商品名))。“谷胱甘肽”是指含有化学结构与Glu-Hyp-Gly(EOG)相似的谷胱甘肽的样品(由Sigma-Aldrich Co.LLC制造的“G6013”(商品名))。“GPO”是指含有由甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸组成的三肽的样品(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。“谷氨酸”、“谷胱甘肽”和“GPO”各自被用作对比例。
在表6中，“C-PO”是指含有由脯氨酸-羟脯氨酸组成的环状二肽的样品(由PHJapan Co.,Ltd.制造)，“C-OG”是指含有由羟脯氨酸-甘氨酸组成的环状二肽的样品(由PHJapan Co.,Ltd.制造)，以及“C-EO”是指含有由谷氨酸-羟脯氨酸组成的环状二肽的样品(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。在表6中，“PO”是指含有由脯氨酸-羟脯氨酸组成的二肽的样品(由BACHEM Co.制造的“G-3025”(商品名))，“OG”是指含有由羟脯氨酸-甘氨酸组成的二肽的样品(由BACHEM Co.制造的“G-2365”(商品名))，以及“AO”是指含有由丙氨酸-羟脯氨酸组成的二肽的样品(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。已知“PO”可以穿过血脑屏障。“C-PO”、“C-OG”、“C-EO”、“PO”、“OG”和“AO”分别被用作对比例。
在表7中，“GP”是指含有由甘氨酸-脯氨酸组成的二肽的样品(由BACHEM Co.制造的“G-3015”(商品名))，而“EO”是指含有由谷氨酸-羟脯氨酸组成的二肽的样品(由PHJapan Co.,Ltd.制造)。“GP”和“EO”分别被用作对比例。“EOG”是指含有由Glu-Hyp-Gly表示的三肽的样品(由PH Japan Co.,Ltd.制造)，并且在该测试中被用作实施例。
[表5]
Figure BDA0003082592530000231
Figure BDA0003082592530000241
[表6]
Figure BDA0003082592530000242
Figure BDA0003082592530000251
[表7]
Figure BDA0003082592530000252
Figure BDA0003082592530000261
<讨论>
根据表5至7，显然，与添加NMDA和BDNF的参考例的情况一样，EOG具有通过直接作用于CGC而促进CGC分化的作用。表5至表7表明，EOG具有CGC死亡抑制作用。
<从评估测试1和2进行的讨论>
评估测试1和2表明，根据本发明的脑功能调节剂和包含所述脑功能调节剂的食品或饮料可以通过直接作用于脑神经细胞而促进脑神经细胞的分化。通过这种作用，所述脑功能调节剂和含有所述脑功能调节剂的食品或饮料可以表现出记忆或脑功能改善作用。因此，所述脑功能调节剂可被用作脑功能改善剂或脑功能下降预防剂。
[评估测试3：用于分析EOG有效浓度的体外测试]
可以表现出对CGC的分化促进作用的EOG的有效浓度通过使用与评估测试2中相同的方法(除了在培养开始后的第1天和第4天，将EOG添加至表8中所示的最终浓度)来检测。表8示出了结果。
[表8]
Figure BDA0003082592530000271
<讨论>
如表8所示，当EOG的浓度为7μM或更高时，EOG可对CGC表现出显著的分化促进作用。
[评估测试4：用于分析口服EOG至脑实质的可递送性的评估测试]
<样品的制备>
所有实验动物均按照内阁行政总局的“实验动物繁殖和照护标准”进行处理。从Sankyo Labo Service Corporation，Inc.购买了两只8周龄的ddy雄性小鼠。之后，使所述雄性小鼠适应1周以成长为9周龄的雄性小鼠，然后禁食12小时。随后，将250μL含有20mgEOG(由PH Japan Co.，Ltd.制造的Glu-Hyp-Gly，纯度：95％或更高)的水溶液强制口服施用于所述雄性小鼠，以制备用于分析EOG至脑实质的递送能力的两只雄性小鼠。
在口服施用前(0小时)以及在口服施用后1小时、2小时和4小时的每一个之前10分钟，将麻醉剂皮下注射到所述雄性小鼠中。所述麻醉剂称为三联麻醉剂，含有盐酸美托咪啶0.3mg/kg、咪达***4mg/kg和酒石酸布托啡诺4mg/kg。注射麻醉剂后10分钟，从每只雄性小鼠中抽取0.5至7μL的脑脊液，从尾静脉中抽取20至80μL的血液，并激发0.28至0.33mg的部分脑实质(以下也简称为“大脑”)。
首先在4℃以20400G的离心加速度将所述血液离心10分钟以获得血浆，并将所述血浆暂时储存在-80℃。随后，将所述血浆与三倍于其体积的乙醇混合，然后将所述混合物以1000G的离心加速度在4℃下离心10分钟以获得上清液。之后，将制备为50mM的碳酸氢铵以上清液体积的四倍的量加入到所述上清液中，然后混合。此外，用0.2μm滤器(由Sartorius AG制造)过滤含有碳酸氢铵的所述上清液，以获得用于测量所述雄性小鼠血浆中EOG量的样品(口服施用前(0小时)以及在口服施用后1小时后、2小时后和4小时后的样品；在下文中，这些样品也统称为“样品a”)。
将所述脑脊液与三倍于其体积的乙醇混合，然后将所述混合物以1000G的离心加速度在4℃下离心10分钟。之后，将制备为50mM的碳酸氢铵以50μL的量添加至经离心的脑脊液中，并将所述混合物搅拌。此外，用0.2μm滤器(由Sartorius AG制造)过滤含有碳酸氢铵的所述脑脊液，以获得用于测量所述雄性小鼠脑脊液中EOG量的样品(口服施用前(0小时)以及在口服施用后1小时后、2小时后和4小时后的样品；在下文中，这些样品也统称为“样品b”)。
用PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水)洗涤所述大脑，然后将其包裹在铝箔中，然后在液氮中冷冻，然后以冷冻状态储存在冰箱(-80℃)中。此后，将所述大脑解冻，用与所述大脑等量的PBS均质化，然后与其量为所述大脑重量三倍的乙腈混合，然后将所述混合物在4℃以1000G的离心加速度离心10分钟以获得悬浮液。之后，将制备为50mM的碳酸氢铵以所述悬浮液体积的两倍的量加入到所述悬浮液中，然后混合。此外，用0.2μm滤器(由Sartorius AG制造)过滤含有碳酸氢铵的所述悬浮液，以获得用于测量所述大脑中EOG量的样品(口服施用前(0小时)以及在口服施用后1小时后、2小时后和4小时后的样品；在下文中，这些样品也统称为“样品c”)。
在下述条件下，通过LC-MS/MS定量分析样品a、b和c中的EOG的量。由于所述样品已被适当稀释，因此可通过以下计算公式进行校正，以确定EOG的实际量。
EOG的实际量(μM)＝分析值(nM)×稀释转换系数/1000(单位转换)
结果如图1、2和3所示。图1是显示在对雄性小鼠强制口服施用EOG后经过预定时间后，雄性小鼠的血浆(样品a)中的EOG量的图。图2是显示在对雄性小鼠强制口服施用EOG后经过预定时间后，雄性小鼠的脑脊液(样品b)中的EOG量的图。图3是显示在对雄性小鼠强制口服施用EOG后经过预定时间后，雄性小鼠的大脑(样品c)中的EOG量的图。图1至图3的每一个中示出的EOG的量是两只雄性小鼠的平均值。
通过LC-MS/MS的定量分析在以下条件下进行。
HPLC仪器：ACQUITY UPLC H-Class Bio(Waters Corporation制造)
柱：Hypersil GOLD PFP 2.1×150mm,5μm(Thermo Fisher Scientific.Inc.制造)
柱温：40℃(线性梯度)
流动相：(A)含0.2％甲酸和2mM醋酸铵的水溶液
(B)100％甲醇
(梯度设定)
Figure BDA0003082592530000291
Figure BDA0003082592530000301
注射量：0.5μL
MS/MS仪器："Xevo TQ-XS"，Waters Corporation制造
电离方法：正ESI
毛细管电压(kV)：1
脱溶剂温度(℃)：500
源温度(℃)：150
MRM条件：
Figure BDA0003082592530000302
<讨论>
根据图1-3，可以理解的是，强制口服施用于雄性小鼠的EOG被转移到血液中，然后转移到脑脊液中。应当理解，口服施用后约1小时的短时间内，转移到脑脊液中的EOG也转移到脑组织中。这表明，口服施用的EOG是通过血液转移的，因此一部分EOG通过脑脊液递送到脑组织。
尽管上面已经描述了本发明的实施方案和实施例，但是可以如最初设想的那样适当地组合上述实施方案和实施例的配置。
本文公开的实施方案和实施例应被认为是说明性的，而不是以任何方式进行限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是前述说明书给出，并且落入所附权利要求书及其等同物范围内的所有改变均包含在其中。

Claims (9)

1.一种包含肽、其盐或其化学修饰产物的脑功能调节剂，所述肽包含由Glu-Hyp-Gly表示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的脑功能调节剂，其中所述肽、其盐或其化学修饰产物是由Glu-Hyp-Gly表示的三肽、其盐或其化学修饰产物。
3.根据权利要求1或2所述的脑功能调节剂，其中所述肽来源于胶原蛋白。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的脑功能调节剂，其中所述肽的重均分子量为315以上且10000以下。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的脑功能调节剂，其中所述脑功能调节剂为脑功能改善剂或脑功能下降预防剂。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的脑功能调节剂，其中所述脑功能调节剂具有脑神经细胞分化促进作用。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的脑功能调节剂，其中所述脑功能调节剂具有脑神经细胞死亡抑制作用。
8.根据权利要求1-7的任一项所述的脑功能调节剂，其中所述脑功能调节剂具有记忆或认知功能改善作用。
9.一种食品或饮料产品，其包含根据权利要求1-8的任一项所述的脑功能调节剂。
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