CN103347530A - 糖尿病的治疗或预防剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、其化学修饰体及其药学上容许的盐的3种以上的胶原肽混合物、以及选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐，由于有DPPIV抑制活性及/或GLP-1分泌促进活性，作为糖尿病的治疗或预防剂等有效。

Description

糖尿病的治疗或预防剂
【技术领域】
本发明涉及糖尿病的治疗或预防剂。更具体而言，涉及通过将胶原以2阶段酶处理来得到的含有肽的糖尿病的治疗或预防剂。
【背景技术】
糖尿病是血糖值处于病态地高的状态下的疾病，被分为胰腺的β细胞以任何理由被破坏而胰岛素枯渴而发生的1型糖尿病，和虽然血中存在胰岛素、但无法调节血糖值的2型糖尿病。胰岛素在骨骼肌中促进葡萄糖摄入，在肝脏中抑制糖异生，另外促进糖原的合成来调节血糖值。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）从存在于下部小肠及大肠的L细胞分泌到血管内，与胰腺β细胞上的GLP-1受体结合，从而促进胰岛素分泌。二肽基肽酶IV（DPPIV）通过识别作为目标的蛋白质的N末端第2位的丙氨酸或脯氨酸，切断2个氨基酸来使同蛋白质失活。分泌的GLP-1被DPPIV失活，经由门静脉从肝脏回到体循环不过10～15%（非专利文献1）。从而，由于通过抑制DPPIV，或者通过促进GLP-1分泌，促进胰岛素分泌，血糖值变得降低，最近、作为糖尿病的治疗或预防剂，DPPIV抑制剂及GLP-1分泌促进剂受到关注。
作为DPPIV抑制剂，已知西格列汀等的各种的合成药品。但是，这些，由于首要考虑糖尿病的治疗，追求高的药效，从而有低血糖症等的副作用。从而，检查了分解饮食用原料而得到的肽。这些肽在DPPIV抑制活性上不如合成药品优良，但对人体的安全性有担保，日常服用也不发生副作用，从而极其有用。
对于有DPPIV抑制活性的，含有饮食用原料的分解物的混合物，例如，在以下的专利文献中有记载。
在专利文献1记载了以含胶原的饮食用原料作为来源的制备物。但是，未记载实施例记载的胶原肽混合物以何种酶或水解条件下分解胶原而制备出，另外，对于所述胶原肽混合物中含何种肽无任何记载。
在专利文献2记载将胶原或明胶用胶原酶等处理，再用蛋白酶处理而得到的分解物的混合物有DPPIV抑制活性。但是，所述蛋白酶不具有本发明的2阶段目的酶处理中使用的酶所具有的氨基肽酶N活性或脯氨酰三肽基氨基肽酶活性。另外，未记载在上述蛋白酶分解物的混合物中含何种肽。
另一方面，以下的文献记载有DPPIV抑制活性的肽。
在专利文献3中记载干酪的水溶性级分中含的24种肽有DPPIV抑制活性。但是，所述肽，除1种之外，是含5个以上氨基酸的长的肽。在专利文献4中记载，作为将胶原或明胶用胶原酶等处理而得到的肽的，Gly-X-Y-（Gly-Z-W）n（n是0～4的整数、X是Pro或Leu、Y、Z及W各自独立地是相同或不同的任意的氨基酸（除Gly之外））等有DPPIV抑制活性。但是，所述肽，除1种之外，是含5个以上氨基酸的长的肽。在非专利文献2中记载含有脯氨酸的二肽、三肽有DPPIV抑制活性，特别是报告N末端侧含有疏水性氨基酸的二肽有高的活性。
上述的肽有肠道吸收性差的问题。
对于有GLP-1分泌促进活性的，含有饮食用原料的分解物的混合物，例如，在以下的文献中有记载。
在专利文献5中记载了大豆蛋白质的木瓜蛋白酶分解物的混合物。在非专利文献3中记载了，卵蛋白质的水解物的混合物有GLP-1分泌促进活性，但其他蛋白质的水解物的混合物不示GLP-1分泌促进活性。在非专利文献4中记载了乳清及酪蛋白的水解物的混合物。在非专利文献5及6中记载，玉米来源的玉米醇溶蛋白的水解物的混合物有GLP-1分泌促进活性和DPPIV抑制活性，在所述混合物中预计包含具有GLP-1分泌促进活性的肽和具有DPPIV抑制活性的肽。
但是，对于这些的混合物中含何种肽无任何记载。另外，在这些文献中未记载将胶原作为饮食用原料使用。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特开2010-13423号公报
专利文献2：特开2009-284798号公报
专利文献3：特开2007-39424号公报
专利文献4：WO2008/066070号公报
专利文献5：特开2010-138143号公报
【非专利文献】
非专利文献1：实验医学，Vol.29，No.5，（增刊），p.820-835,2011
非专利文献2：太田彻他，“Ｄ Ｐ Ｐ Ｉ Ｖ阻害プロリン含有ペプチドの检索および合成の检讨”，第57次日本食品科学工学会要旨，2010年9月2日，2Ea6
非专利文献3：Mol.Nutr.Food Res.，2011,55,476-484
非专利文献4：Eur.J.Nutr.，（2004）43：127-139
非专利文献5：化学と生物，Vol.49，No.1，p.11-13,2011
非专利文献6：Endocrinology，July2010，151（7）：3095-3104
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明要解决的课题是提供副作用少，安全性高，在肠道的吸收或向细胞内的移行容易的，含有肽的糖尿病的治疗或预防剂。另外，提供大量地含有所涉及的肽的胶原肽混合物、及其胶原肽混合物的制造方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人为解决上述课题进行锐意检查，意外发现将胶原或明胶以2阶段酶处理而得到的胶原肽混合物及其中含的肽有DPPIV抑制活性及/或GLP-1分泌促进活性。发现所涉及的肽与以往知道的肽不同，由于几乎都含Hyp，且是二肽或三肽之类的低分子，在肠道的吸收或向细胞内的移行是容易。还发现，通过使用由特殊的酶的组合的2阶段的酶处理的上述制造方法，可制造大量地含有所涉及的肽的胶原肽混合物。基于以上的见解，本发明人完成了本发明。
即，本发明如下。
〔1〕  含有选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、其化学修饰体及其药学上容许的盐的3种以上的胶原肽混合物。
〔2〕  〔1〕所述的胶原肽混合物，其含有Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp及Leu-Hyp-Gly。
〔3〕  糖尿病的治疗或预防剂，其含有〔1〕或〔2〕所述的胶原肽混合物。
〔4〕  DPPIV抑制剂，其含有〔1〕或〔2〕所述的胶原肽混合物。
〔5〕  GLP-1分泌促进剂，其含有〔1〕或〔2〕所述的胶原肽混合物。
〔6〕  糖尿病的治疗或预防剂，其含有选自下列的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐：Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp。
〔7〕  DPPIV抑制剂，其含有选自下列的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐：Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp及Ser-Hyp-Gly。
〔8〕  GLP-1分泌促进剂，其含有选自下列的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐：Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp。
〔9〕  选自Glu-Hyp及Glu-Hyp-Gly的肽或其化学修饰体、或者它们的药学上容许的盐。
〔10〕  通过将胶原或明胶以2阶段进行酶处理来制造含有选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种的肽的胶原肽混合物的制造方法，其中
第1次酶处理中使用的酶选自：胶原酶、巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶及金属蛋白酶，
第2次酶处理中使用的酶是有氨基肽酶N活性的酶、或者兼有氨基肽酶N活性及脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶，或者是有氨基肽酶N活性的酶及有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶的组合。
〔11〕  〔1〕或〔2〕所述的胶原肽混合物，其用于治疗或预防糖尿病。
〔12〕  选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐，其用于治疗或预防糖尿病。
〔11〕  选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp及Ser-Hyp-Gly的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐，其用于抑制DPPIV。
〔12〕  选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种肽或其化学修饰体、或者它们的药学上容许的盐，其用于促进GLP-1的分泌。
〔13〕  治疗或预防糖尿病的方法，包括给有需求的对象（优选为患者）施用〔1〕或〔2〕所述的胶原肽混合物。
〔14〕  治疗或预防糖尿病的方法，包括给有需求的对象（优选为患者）施用选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐。
〔15〕  DPPIV的抑制方法，包括给有需求的对象（优选为患者）施用选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp及Ser-Hyp-Gly的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐。
〔16〕  促进GLP-1的分泌的方法，包括给有需求的对象（优选为患者）施用选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐。
将本发明中使用的上述的肽有时简称为“特定的肽”。另外，有时将表示构成上述肽分子的各氨基酸单位的3字母表示用单字母表示来表示。具体而言，有时如下简写Leu=L、Hyp=O、Gly=G、Pro=P、Ala=A、Glu=E、Ile=I、Ser=S、F=Phe。
【发明效果】
本发明的糖尿病的治疗或预防剂、DPPIV抑制剂及GLP-1分泌促进剂由于无副作用，安全性高，还有，对消化酶的抗性、在肠道的向体内的吸收及向细胞内的移行容易，也适宜于经口施用。另外，根据本发明的胶原肽混合物的制造方法，可有效并且确实地得到大量地含有上述特定的肽的胶原肽混合物。
【实施方式】
以下，对于本发明中涉及的糖尿病的治疗或预防剂、DPPIV抑制剂、GLP-1分泌促进剂及胶原肽混合物的制造方法等详细地说明，本发明的范围不限于这些说明，除了以下的例示的以外，可在不损害本发明的宗旨的范围内实施适宜变更。
【1.胶原肽混合物及特定的肽】
本发明的胶原肽混合物是含有选自EOG、EO、LOG、PA、SO、AOG、其化学修饰体及其药学上容许的盐的3种以上的胶原肽混合物。在本胶原肽混合物中含的肽3种以上中，优选含EOG、EO、LOG之任何，再优选含EOG、LOG之任何，特别优选含LOG。选自EOG、EO、LOG、PA、SO、AOG、其化学修饰体及其药学上容许的盐的3种以上的重量的合计，优选为，相对于胶原肽混合物是2重量%以上，更优选为3重量%以上，再优选为4重量%以上。
本发明中使用的特定的肽选自EOG、EO、LOG、PA、SO、AOG、POG、LO、IO、SOG、GPO、（POG）5、PO、OG、PG、PP及AO。EOG、EO、LOG、PA、SO、AOG、POG、LO、IO及SOG有DPPIV抑制活性，EOG、EO、LOG、PA、SO、AOG、GPO、（POG）5、PO、OG、PG、PP及AO有GLP-1分泌促进活性。EOG、EO、LOG、PA、SO及AOG兼有DPPIV抑制活性及GLP-1分泌促进活性，所以是优选的肽。作为更优选的肽，可举出EOG、EO、LOG，作为更优选的肽，可举出EOG、LOG，作为特别优选的肽，可举出LOG。
特定的肽可通过例如，后述的，从氨基酸开始的合成方法、及将胶原或明胶以2阶段酶处理的方法制备。但是，用这些方法以外的方法制备也可，例如，作为下述2阶段酶处理法的替代法，省略第1次酶处理的方法或，同时进行第1次酶处理及第2次酶处理的方法也可。
<从氨基酸开始的合成方法>
可从氨基酸合成特定的肽。作为从氨基酸开始的合成方法，一般而言，有（1）固相合成法和（2）液相合成法（参照例如，特开2003-183298号公报），前者的情况是，还知道（A）Fmoc法和（B）Boc法，特定的肽用任何方法合成均可。
将固相法作为一例，接下来详细地说明。可通过将脯氨酸固定于载体聚苯乙烯，作为氨基的保护使用Fmoc基或Boc基的公知的固相合成法合成。即，将表面经氨基修饰的直径0.1mm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠作为固相使用，通过作为缩合剂使用二异丙基碳二亚胺（DIC）的脱水反应将Fmoc（芴基-甲氧基-羰基）基经氨基保护的脯氨酸与羟基脯氨酸键合（肽键）之后，将固相用溶剂充分洗涤，除去残留的羟基脯氨酸等。此后，通过除去结合到固相的脯氨酸的保护基（脱保护），可合成PO。接下来，通过用同样的方法将此PO的羟基脯氨酸的氨基与甘氨酸键合（肽键），可得到POG。如此，通过依次键合氨基酸，可合成目的的肽。
<化学修饰>
特定的肽，其构成氨基酸的氨基或羧基被化学修饰也可，对于羟基脯氨酸而言，羟基被化学修饰也可。通过其化学修饰，从弱酸性至中性使溶解性升高，从而可预期与其他DPPIV抑制剂的相溶性升高等。具体而言，对于羟基脯氨酸的羟基，可举出O-乙酰化等的化学修饰、对于甘氨酸的α-羧基，可举出酯化、酰胺化等的化学修饰、对于脯氨酸的α-氨基，可举出多肽基化、琥珀酰化、马来酰化、乙酰化、脱氨基化、苯甲酰化、烷基磺酰化、烯丙基磺酰化、二硝基苯基化、三硝基苯基化、氨甲酰化、苯基氨甲酰化、巯基化等的化学修饰。根据其他DPPIV抑制剂的种类等，选择适宜的化学修饰即可。另外，通过进行乙二胺化、精胺化等，可使特定的肽成为碱性。
特定的肽的化学修饰的具体手段或处理条件适用通常的肽的化学修饰技术。对于羟基脯氨酸的羟基的化学修饰，例如，O-乙酰化可通过在水溶剂中或非水溶剂中使与醋酸酐作用等来进行。对于甘氨酸的α-羧基的化学修饰，例如，酯化可通过悬浮于甲醇后，通气干燥氯化氢气体等来进行，酰胺化可通过使与碳二亚胺等作用来进行。作为化学修饰的其他具体例，可适用特公昭62-44522号公报或特公平5-79046号公报等中记载的化学修饰技术。
<药学上容许的盐>
作为药学上容许的盐，可举出例如，盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐等的无机酸盐、醋酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、富马酸盐、马来酸盐等的有机酸盐、钠盐、钾盐、钙盐等的无机碱基盐、三乙基铵盐等的有机碱盐等。根据常规方法，可使特定的肽成为药学上容许的盐。
【2.胶原肽混合物的制造方法】
通过将胶原或明胶以2阶段酶处理的方法，可制造胶原肽混合物。另外，通过再纯化制备的胶原肽混合物，也可制造特定的肽。
此酶处理的方法，具体而言，通过将胶原或明胶用一般方法第1次酶处理之后，进行使用有氨基肽酶N活性的酶、或者兼有氨基肽酶N活性及脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶、或者有氨基肽酶N活性的酶及有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶的组合的第2次酶处理的2阶段酶处理，可得到含上述特定的肽的胶原肽混合物。
作为原料的胶原，无特别限定，可举出例如，牛、猪等的哺乳动物来源的胶原、鲨、鲷等的鱼类来源的胶原等。这些可从上述哺乳动物的骨、皮部分、上述鱼类的骨、皮、鳞部分等得到。具体而言，对于上述骨、皮、鳞等实施脱脂-脱灰处理、提取处理等的以往公知的处理也可。另外，原料的明胶可通过将上述胶原用热水提取等的以往公知的方法处理来得到。
<第1次酶处理>
作为第1次酶处理中使用的酶，只要是能切断胶原或明胶的肽键的酶，则无特别限定，通常、使用被称为蛋白质分解酶或蛋白酶的酶。具体而言，可举出例如，胶原酶、巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶等，可将这些单独，或者多个组合而使用。作为上述巯基蛋白酶，已知植物来源的木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、动物来源的组织蛋白酶、钙依赖性蛋白酶等。另外，作为上述丝氨酸蛋白酶，已知胰蛋白酶、组织蛋白酶D等，作为上述酸性蛋白酶，已知胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。再有，作为使用的酶，考虑到将制备的胶原肽混合物及特定的肽在药物或特定保健用食品等中利用，优选使用病原性微生物来源的酶以外的酶。
作为第1次酶处理的处理条件，例如，相对于胶原或明胶100重量份使用酶0.1～5重量份，可于30～65℃处理1～72小时。由上述胶原或明胶的第1次酶处理得到的胶原肽混合物的平均分子量优选为500～2000、更优选为500～1800。平均分子量在上述范围，则可认为充分地生成分子量比较大的肽。第1次酶处理后，根据需要使酶失活也可，作为此时的失活温度，例如，是70～100℃。
<第2次酶处理>
作为第2次酶处理中使用的酶，可举出有氨基肽酶N活性的酶、或者兼有氨基肽酶N活性及脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶，或者有氨基肽酶N活性的酶及有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶的组合。其中，“氨基肽酶N活性”基本上是有从肽链的N末端游离氨基酸的作用的肽酶，在从N末端第2位存在脯氨酸或羟基脯氨酸以外的氨基酸时发挥作用。另外，“脯氨酰三肽基氨基肽酶活性”是从自N末端第3位是脯氨酸或羟基脯氨酸的底物游离N末端3残基的肽酶。再有，作为使用的酶，考虑到将制备的胶原肽混合物及特定的肽在药物或特定保健用食品等中利用，优选使用病原性微生物来源的酶以外的酶。具体而言，作为有氨基肽酶N活性的酶，可举出例如氨基肽酶N（EC3.4.11.2；Yoshimoto，T.，et al.，Agric.Biol.Chem.，52：217-225（1988）等）。另外，作为有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶，可举出例如脯氨酰三肽基氨基肽酶（EC3.4.14.-；Banbula，A.，et al.，J.Biol.Chem.，274：9246-9252，（1999）等）。
在第2次酶处理中，发生使用上述的酶、例如，曲霉（Aspergillus）属来源的有氨基肽酶N活性的酶及有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶的酶反应。由此反应，生成在第1次酶处理物中不含的特定的肽。
作为第2次酶处理的处理条件，例如，相对于第1次酶处理物100重量份使用酶0.01～5重量份，可于30～65℃处理1～72小时。由上述第2次酶处理得到的胶原肽混合物的平均分子量优选为500～1800、更优选为500～1500。此第2次酶处理以特定结构的肽分子的生成作为主要的目的，在由第1次酶处理得到的胶原肽混合物之中，优选第2次酶处理至成为上述平均分子量的范围而不至于比较大的肽过量地水解。第2次酶处理后，有使酶失活的必要，作为失活温度，例如，是70～100℃。
再者，作为第2次酶处理中使用的酶，机据副产物的分解等的目的、成为原料的胶原的种类、第1次酶处理中使用的酶的种类，除了上述氨基肽酶N活性或脯氨酰三肽基氨基肽酶活性之外，可使用兼有不同的活性的酶，或者，联用有不同的活性的酶。
作为那样的其他活性，例如，可通过作用氨酰脯氨酸二肽酶活性或羟基氨酰脯氨酸二肽酶活性等的二肽酶活性来分解副生的二肽。另外，氨基肽酶N活性基本上是游离N末端侧的各1个氨基酸，有根据成为原料的胶原的种类或第1次酶处理中使用的酶的种类，在第1次酶处理的分解不充分，第2次酶处理中必要的时间变长的情况。从而，例如，通过作用作为水解脯氨酸的羧基侧的端肽酶的脯氨酰寡肽酶活性等的其他活性，将不要部位作为寡肽等的块切断除去，可更有效进行第2次酶处理。
<2阶段的酶处理>
对于此2阶段酶处理进行详细说明，首先，通过第1次酶处理，生成对于经经口免疫耐受机制的骨-软骨组织的炎症缓和有用的分子量比较大的肽、例如，［X1-Gly-X2-Hyp-Gly-Pro］（X1及X2≠Hyp）。
接下来在第2次酶处理中，通过氨基肽酶N活性作用于上述［X1-Gly-X2-Hyp-Gly-Pro］，C末端的脯氨酸游离而得到［X1-Gly-X2-Hyp-Gly］，或者，再者，N末端的X1游离而得到［Gly-X2-Hyp-Gly］。
再者，氨基肽酶N活性作用于上述［X1-Gly-X2-Hyp-Gly］，甘氨酸和X2间的肽键被切断，得到特定的肽［X2-Hyp-Gly］（X2=Leu，Pro，Glu，Ser或Ala）。
另外，脯氨酰三肽基氨基肽酶活性作用于上述［Gly-X2-Hyp-Gly］，羟基脯氨酸和甘氨酸间的肽键被切断而成为［Gly-X2-Hyp］，接下来，通过氨基肽酶N活性发生作用，甘氨酸和X2间的肽键被切断，得到特定的肽［X2-Hyp］（X2=Leu，Glu，Ile或Ser）。
如此，使氨基肽酶N活性和脯氨酰三肽基氨基肽酶活性二者作用，则可在本发明的特定的肽之中，有效得到肠道吸收性优良的二肽，从而优选。
在专利文献2中使用的酶、例如蛋白酶N“AMANO”G中不含有氨基肽酶N活性的酶或有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶。从而，在与专利文献2的实施例1（HACP-01-N）同条件下制备肽混合物（CPT-Cont），用LC-MS/MS解析法分析，在其混合物中除了GPO以外不含特定的肽（参照、比较例2）。
<胶原肽混合物的纯化>
由上述2阶段酶处理、及根据需要追加的发酵，可制备胶原肽混合物。但是，在同胶原肽混合物中，由于含特定的肽以外的氨基酸及肽，根据需要，用以往公知的方法纯化也可。作为纯化方法，可举出例如，超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、逆相层析、亲和层析等的各种液相层析等。
通过将同胶原肽混合物进行分级分离-纯化而可得特定的肽。作为分级分离-纯化的方法，无特别限制，可举出例如，超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、逆相层析、亲和层析等的各种液相层析、将这些组合的方法等一样的以往公知的方法。具体而言，例如，可如以下一样分级分离-纯化。即，首先，将上述胶原肽混合物的约2g/10mL分2次装载到离子交换柱（例如，DEAETOYOPEARL650M柱（Tosoh公司制）或SPTOYOPEARL650M柱（Tosoh公司制）等），用蒸馏水回收溶出的空体积级分。接下来，将回收的级分装载到与上述离子交换柱有相反的离子交换基的柱（例如，SPTOYOPEARL650M柱（Tosoh公司制）或DEAETOYOPEARL650M柱（Tosoh公司制）等），用蒸馏水回收溶出的空体积级分。接下来，将此级分装载到凝胶过滤柱（例如，SEPHADEX LH-20柱（Pharmacia公司制）等），用30%甲醇水溶液溶出而回收与作为化学合成品的特定的肽溶出的位置相当的级分。对于本级分，供于装填逆相柱（例如，μBondasphere5μC18
Figure BDA00003570569600131
柱（Waters公司制）等）的高效液相层析（HPLC），由含0.1%三氟醋酸的32%以下的乙腈水溶液的直线浓度梯度分级分离。然后，通过将回收的特定的肽级分减压干燥，可得高纯度的特定的肽。
【3.糖尿病的治疗或预防剂】
本发明中涉及的胶原肽混合物及特定的肽等有DPPIV抑制活性及/或GLP-1分泌促进活性，可作为糖尿病的治疗或预防剂使用。其中，糖尿病的治疗或预防剂是指糖尿病的治疗及/或预防中使用的药剂。另外，也可使在特定保健用食品、健康食品、各种食材中含有而利用。
含有胶原肽混合物及特定的肽等的糖尿病的治疗或预防剂可以经口或非经口各种的形态的制剂施用。作为其形态，可举出例如，锭剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、粉剂、液剂、注射剂、经皮剂、栓剂、点鼻剂及吸入剂等，优选可举出经口施用的锭剂、颗粒剂、胶囊剂等、非经口施用的注射剂、经皮剂等。胶原肽混合物及特定的肽等的施用量根据患者的状态或体重、化合物的种类、施用途径等而不同。每成人1天，经口施用的情况，可举出例如，约0.1～1000mg、优选为约1～500mg、更优选为约10～200mg。注射剂的情况可举出例如，约0.01～200mg、优选为约0.1～100mg、更优选为约1～50mg。其他形态的制剂可参考这些的施用量适宜确定。这些制剂分成1天1次～数次施用，或者可1～数天施用1次。再有，经口施用时，能通过食前施用将血糖值抑制到正常范围内。特定的肽、特别是含有Hyp的肽由于对消化酶的抗性高，几乎不发生向氨基酸的分解，另外由于从肠道迅速地吸收到血液，或者从肠道直接吸收到肠道表面细胞或L细胞，由经口施用的摄取是适宜的。
作为用于经口施用制剂的药物载体，可举出例如，赋形剂（结晶性纤维素、乳糖、沙糖、玉米淀粉、磷酸钾、山梨糖醇、甘氨酸等）、结合剂（糖浆、***胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯基吡咯烷酮等）、润滑剂（硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、氧化硅等）、崩解剂（马铃薯淀粉等）及湿润剂（月桂基硫酸钠等）等的惯用的。经口施用制剂可将胶原肽混合物或特定的肽等和上述药物载体混合的由以往公知的方法，打锭成型而作为锭剂，或制备成其他、颗粒剂、散剂、胶囊剂等的固体剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂等的液剂、冷冻干燥制剂等之任意的形态。此时，相对于制剂全量，将上述特定的肽以0.001重量份以上的比例配合是优选的。更优选以0.01重量份以上的比例配合。不足0.001重量份则有无法充分地表达本发明的效果的担忧。
在非经口施用时，可使用例如，注射用蒸馏水、生理食盐水、葡萄糖水溶液等制剂化为注射剂或点滴剂，或者栓剂等。在注入到静脉时，使用将胶原肽混合物或特定的肽等用生理盐水等稀释的，作为其浓度，如上述，将特定结构的肽分子的含量作为0.1mol/L以上是优选的。另外，上述特定的肽的含量是10μmol/L以上是优选的。
<其他有效成分>
含有本发明的胶原肽混合物及特定的肽等的糖尿病的治疗或预防剂在不损害本发明的效果的范围内，可适宜组合其他有效成分。作为其他有效成分，可举出例如，其他糖尿病治疗剂（胰岛素制剂、磺酰脲剂、双胍系药剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素抵抗性改善剂、胰岛素分泌促进剂、GLP-1类似物等）等。此时，作为配合剂使用也可，或者以联用使用也可。
【4.DPPIV抑制剂/GLP-1分泌促进剂】
本发明的DPPIV抑制剂，如上所述，作为糖尿病的治疗或预防剂使用。而且，本DPPIV抑制剂，再者，可用于例如，发作、缺血、帕金森病、片头痛等之中枢神经***疾病、关节炎、慢性类风湿性关节炎等的免疫及自身免疫疾病、肿瘤等的治疗及预防（特表2004-534836号公报、及“二肽基肽酶IV抑制剂的关节炎发症抑制效果”，田中澄子等著，炎症，Vol.18，No.3，1998年5月）。
本发明的GLP-1分泌促进剂，如上所述，作为糖尿病的治疗或预防剂使用。而且，本GLP-1分泌促进剂，再者，有在肺中的表面活性剂分泌促进作用、在心脏中的心肌保护作用及心功能改善作用、在脑中的神经细胞保护作用、记忆脑的增加作用及食欲抑制作用、在消化管中的胃***降低作用、在肾脏中的钠调节作用等。从而，可用于需要这些的作用的疾病、例如，肥胖、神经变性症状（阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、脑卒中，多发性硬化症、脑的损伤、脊髓损伤及末梢神经障碍等）等的治疗及预防（非专利文献1及特开2010-90129号公报）。
【实施例】
接下来，对于本发明的糖尿病的治疗或预防剂中含的胶原肽混合物及特定的肽等，由其性能评价试验和其配合例，更具体说明本发明，本发明不限于这些。以下，为方便起见、将“重量份”简记为“份”，“重量%”简记为“%”。
〔特定的肽的准备〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的特定的肽由前述的固相法合成。
即，首先，将表面经氨基修饰的直径0.1mm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠作为固相使用，通过作为缩合剂使用二异丙基碳二亚胺（DIC）10份的脱水反应使经Fmoc（芴基-甲氧基-羰基）基保护氨基的脯氨酸45份与丙氨酸45份键合（肽键）之后，将固相用溶剂（乙基醇）充分洗涤，除去残留的脯氨酸等。其后，通过将结合到固相的脯氨酸的保护基由三氟醋酸的温育除去（脱保护）来合成PA。
在上述肽分子的合成中使用Liberty肽合成***（CEM公司制）。
同样合成LO、EO、IO、SO、LOG、POG、EOG、SOG、AOG、AO、GPO、（POG）5、PO、OG、PG及PP。如接下来详记，使用LC-MS/MS测定EO及EOG的［m/z］的结果，EO是261.1>132.0，EOG是318.1>225.0。
〔其他肽的准备〕
作为后述的性能评价试验及配合例中使用的比较用的其他肽，将PAG、FO及IOG的各肽与上述特定的肽同样地由固相法合成。
〔实施例1：含特定的肽的胶原肽混合物的准备1〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的含有特定的肽的猪皮来源的胶原肽混合物（CPT-PU）根据以下所示的方法得到。
即，将作为猪皮来源胶原的热变性物的明胶（I型胶原）1kg溶解于75℃的温水4L，温度调节到60℃之后，作为第1次反应，通过添加黄色曲霉来源蛋白酶10g，pH5.0～6.0、于45～55℃温度保持3小时进行酶水解处理。接下来，作为第2次酶反应，向其中各添加7.5g米曲霉（Aspergillus oryzae）来源的氨基肽酶N（EC3.4.11.2）及脯氨酰三肽基氨基肽酶（EC3.4.14.-），将其可溶化之后，于50℃反应5小时。反应后，将此反应液于100℃加热处理10分钟，其后，冷却到60℃，使用活性炭和过滤助剂（硅藻土）过滤，对得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到猪皮来源的胶原肽混合物（CPT-PU）。
将此CPT-PU供于薄层层析（TLC）。即，向TLC板（商品名“Cellulose F”，Merck公司制）滴下10μg可溶化于水中的CPT-PU（斑原点）而干燥之后，用溶剂（n-丁醇：醋酸：水=4：1：（2）展开。喷雾靛红-Zn发色液，通过确认蓝色斑的发色Rf值与在相同板的合成肽POG的Rf值一致，确认此CPT-PU含此肽。
对于上述CPT-PU，再进行LC-MS/MS分析。但是，由于在此CPT-PU中含多种肽而解析困难，将同样品由Sep-PakC18筒柱（Waters公司制）逆相色谱分级分离分离之后，将冷冻干燥的样品溶解于20μL的MQ水，进行LC-MS/MS分析。
从上述解析确认，此CPT-PU含肽LOG、EOG、SOG、AOG、PA。
从由LC-MS/MS的定量解析知，上述CPT-PU含4%的PA、含各2%的AOG、POG、含各1.5%的LOG、EOG、SOG。
其中，如以下一样进行由LC-MS/MS的定量解析。
作为HPLC装置使用“NANOSPACE SI-2”（资生堂公司制）。此装置安装有柱：Hypersil GOLD PFP2.1×150mm，5μm。作为移动相：（A）含有0.2%蚁酸及2mM醋酸铵的水溶液、（B）甲醇，设定梯度，注入量：1μl、柱温度：于40℃经线性梯度。在以下的条件下使用与其连结的MS/MS（串联型质谱分析：TSQ Vantage，Thermo FisherScientific Inc.）装置。即，使用离子化法（正电ESI），SRM条件设定如下（以下，以［m/z］表示）：LOG是302.2>189.4；POG是286.1>189.3；PA是187.1>70.3；EO是261.1>132.0；LO是245.1>132.3；IO是245.2>132.1；EOG是318.1>225.4；SOG是276.1>189.4；SO是219.1>132.2；AOG是260.1>189.4。
〔实施例2：含特定的肽的胶原肽混合物的准备2〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的含有特定的肽的鱼鳞来源的胶原肽混合物（CPT-P-H）除了使用鱼鳞来源明胶以外，通过与上述CPT-PU的制造同样的操作得到。
此CPT-P-H与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，确认肽POG的存在。
再者，从LC-MS/MS解析确认，此CPT-P-H也含肽LOG、EOG、SOG、AOG、PA。
从由LC-MS/MS的定量解析知，上述CPT-P-H含2.5%的PA、含各2%的SOG、LOG、AOG、含1.5%的POG、含1%的EOG。
〔实施例3：含特定的肽的胶原肽混合物的准备3〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的含有特定的肽的猪皮来源的胶原肽混合物（CPT-P-20）根据以下所示的方法得到。
即，将作为猪皮来源胶原的热变性物的明胶（I型胶原）1kg一边加温一边溶解于20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）4L之后，冷却到40℃，作为第1次酶反应，添加1g的胶原酶（新田明胶公司制、胶原酶N2）后，pH7.0～7.8、于40℃保持24小时来进行酶分解处理。接下来作为第2次酶反应，向此反应液添加各10g黑曲霉（Aspergillusniger）来源的氨基肽酶N（EC3.4.11.2）及脯氨酰三肽基氨基肽酶（EC3.4.14.-），将其可溶化之后，于pH4.0、50℃反应5小时。反应后，将此反应液加热处理至100℃经10分钟，其后，冷却到60℃，使用活性炭和过滤助剂（硅藻土）过滤，对于得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到CPT-P-20。
此CPT-P-20与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，确认肽POG的存在。
再者，从LC-MS/MS解析确认，此CPT-P-20也含肽PA、LOG、AOG、EOG、SOG、EO、LO、IO、SO。
从由LC-MS/MS的定量解析知，上述CPT-P-20含3%的PA、含2.5%的LOG、含2%的EOG、含1%的AOG、各含0.5%的POG、SOG、EO、LO、IO、SO。
〔实施例4：含特定的肽的胶原肽混合物的准备4〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的含有特定的肽的猪皮来源的胶原肽混合物（CPT-P-22）根据以下所示的方法得到。
即，将作为猪皮来源胶原的热变性物的明胶（I型胶原）1kg一边加温一边溶解于20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）4L之后，冷却到40℃，作为第1次酶反应，添加1g的胶原酶（新田明胶公司制、胶原酶N2）后，pH7.0～7.8、于40℃保持24小时来进行酶分解处理。接下来作为第2次酶反应，向此反应液添加各10g米曲霉（Aspergillusoryzae）来源的氨基肽酶N（EC3.4.11.2）及脯氨酰三肽基氨基肽酶（EC3.4.14.-），将其可溶化之后，于pH4.0、50℃反应3小时。反应后，将此反应液加热处理至100℃经10分钟，其后，冷却到60℃，使用活性炭和过滤助剂（硅藻土）过滤，对于得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到CPT-P-22。
此CPT-P-22与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，确认肽POG的存在。
再者，从LC-MS/MS解析确认，此CPT-P-22也含肽LOG、EOG、SOG、AOG、EO、LO、IO、PA。
从由LC-MS/MS的定量解析知，上述CPT-P-22含3%的PA、含2.5%的LOG、含各1%的POG、AOG、EOG、含各0.5%的SOG、EO、LO、IO。
〔实施例5：含特定的肽的胶原肽混合物的准备5〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的含有特定的肽的猪皮来源的胶原肽混合物（CPT-P-25）根据以下所示的方法得到。
即，将作为猪皮来源胶原的热变性物的明胶（I型胶原）1kg一边加温一边溶解于20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）4L之后，冷却到40℃，作为第1次酶反应，添加1g的胶原酶（新田明胶公司制、胶原酶N2）后，pH7.0～7.8、于40℃保持24小时来进行酶分解处理。接下来作为第2次酶反应，向此反应液添加各7.5g黑曲霉（Aspergillusniger）来源的氨基肽酶N（EC3.4.11.2）及脯氨酰三肽基氨基肽酶（EC3.4.14.-），将其可溶化之后，于pH4.0、50℃反应3小时。反应后，将此反应液加热处理至100℃经10分钟，其后，冷却到60℃，使用活性炭和过滤助剂（硅藻土）过滤，对于得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到CPT-P-25。
此CPT-P-25与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，确认肽POG的存在。
再者，从LC-MS/MS解析确认，此CPT-P-25也含肽LOG、EOG、SOG、AOG、EO、LO、PA。
从由LC-MS/MS的定量解析知，上述CPT-P-25含4%的POG、含2.5%的PA、含1%的LOG、含各0.5%的AOG、EOG、SOG、EO、LO。
〔实施例6：含特定的肽的胶原肽混合物的准备6〕
鱼鳞来源的胶原肽（CPT-PP），除了作为第1次反应使用猕猴桃来源的猕猴桃碱（EC3.4.22.14）20g以外，由与实施例2的CPT-P-U的制造同样的操作得到。
此CPT-PP与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，确认肽POG的存在。
再者，从LC-MS/MS解析确认，此CPT-PP也含肽LOG、EOG、SOG、AOG、EO、PA。
从由LC-MS/MS的定量解析知，上述CPT-PP含5%的PA、含2%的LOG、含各1.5%AOG、EOG、SOG、EO、含0.5%的POG。
〔比较例1：不含特定的肽的胶原肽混合物的准备〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的，除了GPO以外不含有特定的肽之任何的比较用的胶原肽混合物（CPT-JB）根据以下所示的方法得到。
即，将作为猪皮来源胶原的热变性物的明胶（I型胶原）1kg一边加温一边溶解于20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）4L之后，冷却到40℃，作为第1次酶反应，添加1g的胶原酶（新田明胶公司制，胶原酶N2）后，于pH7.0～7.8、40℃保持18小时来进行酶分解处理。接下来，将用酶水解处理得到的溶液加热处理至100℃经10分钟，其后，冷却到60℃，使用活性炭和过滤助剂（硅藻土）过滤，对于得到的母液于120℃高温杀菌处理3秒钟。然后，将杀菌后的母液喷雾干燥，得到CPT-JB。
另外，将此CPT-JB与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，再者，进行LC-MS/MS解析，除了GPO以外检测不到特定的肽之任何的存在。
〔比较例2：不含特定的肽的胶原肽混合物的准备〕
后述的性能评价试验及配合例中使用的不含有特定的肽之任何的比较用的胶原肽混合物（CPT-Cont）根据以下所示的方法得到。
即，将胶原肽HACP-01（JELLICE公司制、胶原酶分解物）10g和蛋白酶N“AMANO”G（天野酶公司制、枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）来源）0.1g溶解于水中，于55℃加热1小时而酶处理之后，于80℃加热处理30分钟而使酶失活。将此酶处理溶液冷冻干燥而得到CPT-Cont。
另外，将此CPT-Cont与上述CPT-PU的情况同样地由TLC分析，再者，进行LC-MS/MS解析，检测不到特定的肽之任何的存在。
〔性能评价试验〕
接下来示使用上述各肽及胶原肽混合物进行的各性能评价试验的详细。
<评价试验1：DPPIV抑制活性>
将DPPIV抑制活性使用DPPIV抑制活性测定试剂盒“DPPIVDrug Discovery Kit-AK-499”（BIOMOL公司制）测定。作为肽样品底物，使用H-Gly-Pro-7-氨基-4-甲基香豆素“P189-9090 AMC底物”（BIOMOL公司制），作为酶，使用DPPIV“E434-9090DPPIV酶；人重组体”（BIOMOL公司制）。
抑制活性用将DPPIV活性抑制50%之时的浓度评价。此值越低，抑制活性越高，以少量有效抑制DPPIV活性。
对于肽的结果示于表1，胶原肽混合物的结果示于表2。
【表1】
Figure BDA00003570569600211
【表2】
Figure BDA00003570569600212
<评价试验2：GLP-1分泌促进活性>
使用人来源肠道L细胞（NCI-H716细胞：ATCC制），用含10%的FBS的RPIM培养基（ATCC公司制），以5×105细胞/ml×200μl（1×105细胞/孔）接种到预包被的聚-L-赖氨酸板（96孔板），培养2天。确认细胞粘附到板后，将培养基用试验培养基（146mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，20mM HEPES，5.6mMglucose，2mg/ml BSA）置换，添加样品至各终浓度达5mM。将1小时后的培养上清用PBS稀释30倍，用GLP-1ELISA试剂盒（Lewis制）根据流程进行试验。
将样品未添加（空白）的GLP-1分泌设为100%，算出样品5mM添加区的GLP-1分泌促进率。
对肽的结果示于表3，对于胶原肽混合物的结果示于表4。
【表3】
Figure BDA00003570569600221
（n=4）空白的GLP-1浓度是742±231pg/ml。
【表4】
Figure BDA00003570569600222
（n=4）空白的GLP-1浓度是742±231pg/ml。
<评价试验3：肠道吸收性>
将Wister系雄大鼠（170g）绝食一晚供于实验。在待测样品样品中使用各215nmol/10mL上述各肽，在胃内施用。
作为试验方法，在大鼠的心脏和门静脉安装套管而进行单向灌流。作为灌流液，使用向包含NaCl 9.0g、5.75%KCl 8mL、10.55%KH2PO42mL、19%MgSO4 2mL、NaHCO3 2.73g、葡萄糖3.43g、水1255mL的Krebs-Ringer碳酸氢液（KRB液，pH7.4），相对于上述KRB液500mL加牛血清白蛋白10g、***（0.123mg/mL）0.5mL、去甲肾上腺素（0.024mg/mL）0.5mL的液体。
向从门静脉采集的灌流样品溶液5.0mL加0.5mL30%磺基水杨酸，剧烈搅拌，在冰箱放置一晚。将此样品于3000rpm离心分离10分钟，进行除蛋白质。对于离心上清液，通过比色定量其0.5mL中的羟基脯氨酸量，得游离型Hyp量。
再者，在螺旋盖试管中秤取上述离心上清液3.0mL，向其加当量的浓盐酸，于110℃水解24小时。在蒸发器中浓缩干燥，除去盐酸，溶解于5mL的蒸馏水，加数滴饱和氢氧化锂溶液而调节至pH5～7，定容到10mL。对于此溶液2mL，通过比色定量羟基脯氨酸量，得总Hyp量。从水解后的总Hyp量减去水解前的游离型Hyp量而得到的值成为肽态Hyp量。从此肽态Hyp量，首先确认待测样品样品的各肽吸收到大鼠门静脉灌流液中的定量值。
上述羟基脯氨酸量的比色定量由Firschein及Shill法进行，具体而言，如以下一样进行。
即，向样品溶液2mL加2-丙醇2mL，充分地搅拌。向其中加作为氧化剂的氯胺T液0.5mL而正确地放置4分钟之后，冰冷却。向其中加p-二甲基氨基苯甲醛溶液5mL，充分地搅拌之后，在沸腾水浴中正确地加热2分钟。其后，立即冰冷却，放置1小时之后，以波长575nm比色定量。
再有，氯胺T液是将氯胺T（5g）溶解调节于蒸馏水50mL，冷藏保存，使用前用醋酸缓冲液（pH6.0）1:4稀释而使用。另外，p-二甲基氨基苯甲醛溶液（Ehrlich溶液）是向p-二甲基氨基苯甲醛粉末20g加浓盐酸22mL而在沸腾水中加热溶解，立即在冰水中冷却，加2-丙醇122mL搅拌溶解而制备。
接下来，使用下述的HPLC分析及质谱分析（LC/MS/MS）进行回收到大鼠门静脉灌流液中的肽、即，肠道吸收的上述各肽的鉴定、定量。
【HPLC分析】
灌流液中的肽的分析由逆相HPLC分析进行。作为HPLC装置，使用由送液泵、脱气器、自动采样机、柱加热器、紫外部分光光度计、打印机、***控制器构成的日本分光公司制的LCSS-905***。逆相柱使用Nova Pak C18（3.9×150mm）。
使用含有0.1%TFA的乙腈-水***的线性梯度移动层，样品注入量是70μL、流速是1mL/min。
【LC/MS/MS分析】
作为HPLC装置使用U980HPLC（日本分光公司制），此装置安装有ODS（C18）柱（Mightysil RP-18,2×250mm，Kanto Chemical CoLtd公司制）。作为移动相溶剂，作为含有0.2%蚁酸的乙腈-水***，由线性梯度在40分钟内将浓度从0%升高到40%乙腈，用100%乙腈进行10分钟清洗。样品注入量是10μL，柱温度是40℃。
MS分析通过由4通道的多反应监测法的Quattro LC质量分光光度计（Micromass，Manchester，UK）的MS/MS方式进行。即，将来自HPLC的溶出液用作为［M+H］+的m/z和其片段离子种的m/z监测。此时，作为［M+H］+m/z，LOG使用302.2>189.4；POG使用286.1>189.3；PA使用187.1>70.3；EO使用261.1>243.4；LO使用245.1>132.3；IO使用245.2>132.1；EOG使用318.1>225.4；SOG使用276.1>189.4；SO使用219.1>132.2；AOG使用260.1>189.4而进行监测。
将灌流液进行最终浓度3%的磺基水杨酸处理，进行除蛋白质。将上清液冷冻干燥，将干燥粉末10mg溶解于蒸馏水中，进行阳离子交换树脂柱处理，从而得到氨溶出级分。除去此级分的溶剂，溶解于蒸馏水中，进行LC/MS/MS分析。
结果如表5所示。
【表5】
Figure BDA00003570569600251
<评价试验4：由葡萄糖负荷试验的糖耐量评价>
给6周龄雄ob/ob小鼠（日本SLC）以通常饲料（MF、ORIENTAL酵母）给饵7天而顺化而供于实验。使同小鼠绝食一晚（16小时）之后，经口施用各胶原肽（0.85g/kg）或酪蛋白（0.85g/kg、DMV公司、荷兰），30分钟后，经口施用葡萄糖（2g/kg），实施葡萄糖负荷试验（2g/kg）而检测给糖耐量带来的效果。0，15，30，60及120分钟后，使用血中葡萄糖测定装置（Glutest Ace R、三和化学研究所社制）测定血糖值，算出AUC0-120min，进行评价。
结果如表6所示。
【表6】
Figure BDA00003570569600261
＊：相比酪蛋白有显著差异（P<0.05）。
<性能评价试验的结果的考察>
如上所述，Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp有DPPIV抑制活性。特别是，Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp及Ser-Hyp-Gly的DPPIV抑制活性高。另外，Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp有GLP-1分泌促进活性。再者，这些的肽由于对消化酶抗性高，几乎不发生向氨基酸的分解，另外由于从肠道迅速地吸收到血液，或者从肠道直接吸收到肠道表面细胞或L细胞，通过经口施用示优良的效果。
〔配合例〕
使用上述特定的肽，得到本发明中涉及的制剂。接下来示它们的配合例。
<实施例7～12>
用表7所示的配合将各材料混合，相对于表7中记载的配合全体以10份的比例使用作为赋形剂的结晶性纤维素，通过常规方法打锭成形，得到可作为经口用使用的实施例7～12中涉及的制剂。
【表7】
Figure BDA00003570569600271
<实施例13>
使用上述CPT-PU制造咀嚼型的片。
具体而言，混合下述配合成分，使用打锭成型器，制备一粒0.8g的咀嚼型的片。此咀嚼型的片，将全量作为100%之时，含1%的POG、含2%的PA、含1%的AOG、各含0.75%的LOG、EOG、SOG。
CPT-PU 50.0kg
抗坏血酸 10.0kg
MICROCALMAG S（SK Foods公司制） 4.6kg
MABIT（林原公司制） 19.0kg
结晶纤维素 10.0kg
乳化剂 3.2kg
阿司帕坦 0.5kg
发酵乳粉末 1.4kg
粉末香料 1.0kg
柠檬酸 0.3kg
<实施例14>
使用上述CPT-PU，混合下述配合成分，溶解于100～140mL的热水而制备饮用的粉末清炖肉汤（1袋6.0g）。此粉末清炖肉汤，将全量作为100%之时，含0.7%的POG、含1.4%的PA、含0.7%的AOG、各含0.6%的LOG、EOG、SOG。
CPT-PU 35.0kg
鸡精粉末 25.0kg
食盐 18.0kg
葡萄糖 7.7kg
乳酸钙 7.0kg
谷氨酸钠 4.0kg
洋葱提取物粉末 1.0kg
HVP 1.0kg
牛肉调味料 0.5kg
5’-核糖核苷酸2钠 0.5kg
白胡椒 0.2kg
姜黄 0.1kg
<实施例15>
使用上述CPT-PU，混合下述配合成分，溶解于100～150mL的水而制备饮用的粉末汁（1袋13.0g）。此粉末汁，将全量作为100%之时，含0.8%的POG、含1.6%的PA、含0.8%的AOG、各含0.6%的LOG、EOG、SOG。
CPT-PU 40.4kg
抗坏血酸钠 1.2kg
赤藓糖醇 52.0kg
乙酰舒泛K 0.1kg
阿司帕坦 0.1kg
柠檬酸钠 0.8kg
柠檬酸（结晶） 4.6kg
麝香葡萄酒调味料 0.8kg
<实施例16>
使用上述CPT-PU，根据下述配合成分，向纯化水中溶解其他配合成分，制备成pH3.5、B’×9.0%之后，于110℃实施30秒钟加热杀菌处理，冷却到10℃后无菌填充到纸包装而制备清凉饮用水（1包装125mL）。此清凉饮用水，将全量作为100%之时，含0.05%的POG、含0.1%的PA、含0.05%的AOG、各含0.04%的LOG、EOG、SOG。
CPT-PU 2.5kg
维生素混合物DN（BASF日本公司制） 0.1kg
赤藓糖醇 5.5kg
乙酰舒泛K 0.015kg
阿司帕坦 0.005kg
柠檬酸 约0.6kg
水果混合物调味料 0.16L
荔枝调味料 0.04L
纯化水 余量（设定成合计为100.0kg）
<实施例17>
首先，向下述配合成分之中的纯化水（B）浸渍上述CPT-PU及明胶30分钟而使膨润之后，加热到80℃经30分钟而使完全地溶解，作为明胶溶液。接下来，向下述配合成分之中的纯化水（A）溶解乳寡糖、粉末麦芽还原糖、赤藓糖醇、及难消化性糊精，煮之后，添加阿司帕坦、上述明胶溶液、预先溶解于纯化水（A）之一部分的柠檬酸（结晶）、胡椒薄荷调味料、薄荷调味料、柠檬调味料、及红花黄染料，制备成B’×79～81%之后除沫，填充到淀粉模型中于室温干燥24小时，制备胶冻（1粒4g）。此胶冻，将全量作为100%之时，含0.1%的POG、含0.2%的PA、含0.1%的AOG、各含0.08%的LOG、EOG、SOG。
CPT-PU 5.0kg
乳寡糖 41.0kg
粉末麦芽还原糖 31.0kg
赤藓糖醇 5.0kg
难消化性糊精 5.0kg
阿司帕坦 0.05kg
明胶（APH250、新田明胶公司制） 7.0kg
柠檬酸（结晶） 1.2kg
胡椒薄荷调味料 0.6L
薄荷调味料 0.2L
柠檬调味料 0.7L
红花黄染料 适量
纯化水（A） 20.0L
纯化水（B） 18.0L
<实施例18>
使用实施例6的制剂，通过用经灭菌的生理食盐水可溶化至LOG成2.5mM的浓度，得到向静脉的注入用液剂。
【工业实用性】
由本发明，提供糖尿病的治疗或预防剂。另外，提供可作为糖尿病的治疗或预防剂使用的胶原肽混合物、及其制造方法。

Claims (8)

1.胶原肽混合物，其含有选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、其化学修饰体及其药学上容许的盐的3种以上。
2.权利要求1所述的胶原肽混合物，其含有Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp及Leu-Hyp-Gly。
3.糖尿病的治疗或预防剂，其含有权利要求1或2所述的胶原肽混合物。
4.糖尿病的治疗或预防剂，其含有选自下列的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐：Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp。
5.二肽基肽酶IV抑制剂，其含有选自下列的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐：Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp及Ser-Hyp-Gly。
6.胰高血糖素样肽-1分泌促进剂，其含有选自下列的至少1种肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐：Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp。
7.选自Glu-Hyp及Glu-Hyp-Gly的肽或其化学修饰体或它们的药学上容许的盐。
8.通过将胶原或明胶以2阶段进行酶处理来制造含有选自Glu-Hyp-Gly、Glu-Hyp、Leu-Hyp-Gly、Pro-Ala、Ser-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Ser-Hyp-Gly、Gly-Pro-Hyp、（Pro-Hyp-Gly）5、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Pro-Gly、Pro-Pro及Ala-Hyp的至少1种肽的胶原肽混合物的制造方法，其中
第1次酶处理中使用的酶选自：胶原酶、巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶及金属蛋白酶，
第2次酶处理中使用的酶是有氨基肽酶N活性的酶、或者兼有氨基肽酶N活性及脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶，或者是有氨基肽酶N活性的酶及有脯氨酰三肽基氨基肽酶活性的酶的组合。
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