WO2020175570A1 - 脳機能調整剤、およびこれを含む飲食品 - Google Patents

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WO2020175570A1
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peptide
brain
collagen
function regulator
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聖子 小泉
井上　直樹
綾 松下
克佳 須永
秀与 菊地
里美 木暮
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新田ゼラチン株式会社
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • Brain function regulator Brain function regulator, and food and drink containing the same
  • the present invention relates to a brain function modifier, and foods and drinks containing the same.
  • Collagen hydrolysates (hereinafter, also referred to as "collagen peptide mixture”) are known to exhibit various physiological activities on living bodies. Recently, it has begun to be reported that a mixture of collagen peptides has physiological activity also on cerebral nerve cells and the like, and has an effect of improving brain functions such as memory (hereinafter also referred to as “brain function improving effect”). ..
  • Patent Document 1 discloses a nerve containing a total of nine collagen-derived peptides including peptides represented by 0 ⁇ V-9 r ⁇ -A r 9. Disclosed are nascent agents. Japanese Unexamined Patent Application Publication No.
  • Patent Document 2 discloses that a peptide derived from collagen and having the following formula: V-? " ⁇ _8_3 has a neurogenesis promoting action.
  • non-patent document 1 the administration of a fish-derived collagen peptide mixture to an aging model mouse increases the expression level of ⁇ (brain-derived neurotrophic factor) in the hippocampus, which results in spatial learning and memory capacity and
  • Non-patent document 2 reports that a collagen-derived dipeptide represented by " ⁇ -1 ⁇ 1 s" is transferred to the cerebrospinal fluid in an experiment using a rat.
  • Non-patent document 3 reports that collagen hydrolyzate promoted hippocampal neurogenesis.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 201 0-1 05996
  • Patent Document 2 JP 201 1-1 1 1 440 JP
  • Non-patent literature ⁇ 02020/175570 2 (: 17 2020 /007806
  • Non-Patent Document 1 Pei Xinrong et al., "Preventive Effect of Marine
  • Non-Patent Document 2 Nagai et al., "Identification of collagen-derived antidepressive peptide and its transfer to cerebrospinal fluid", Proc. of the 2017 Agricultural Chemistry Society Conference, March 5, 2017, P. 997.
  • Patent Document 3 Shi-Kakoi et al., Collagen peptides enhance hippoca mpa L neurogenesis and reduce anxiety related behavior in mice”, Biomedical Research 33 (5), 2012, p.273-279.
  • Non-Patent Document 1 It is not specified by which peptide derived from collagen the brain function improving effect or neurogenesis effect disclosed in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 3 is obtained.
  • the neurogenesis promoting action disclosed in Patent Document 2 above is a finding obtained from an experiment using PC 12 cells derived from rat adrenal pheochromocytoma, and obtained from an experiment targeting cerebral nerve cells. Not a finding.
  • P r o_H yp disclosed in Non-Patent Document 2 suggests that it has a neurogenesis effect in the dentate gyrus of the hippocampus, but P r o_H yp differentiates and grows cerebral nerve cells, resulting in brain function. It has not been confirmed whether it will improve. Therefore, a collagen-derived peptide that exerts an effect of improving brain function by directly acting on cerebral nerve cells without intervening in-vivo signaling substances such as hormones has not been known, and its development is eagerly awaited.
  • the present invention provides a brain function regulator containing a peptide or the like that exerts at least either a brain function improving effect or a brain function lowering preventing effect by directly acting on a brain nerve cell, and a food or drink containing the same.
  • the present inventors have been developing a brain function regulator containing a peptide or the like that exerts at least one of a brain function improving effect and a brain function lowering preventing effect by directly acting on brain nerve cells.
  • a brain function regulator containing a peptide or the like that exerts at least one of a brain function improving effect and a brain function lowering preventing effect by directly acting on brain nerve cells.
  • ⁇ 1- 1 1 to 1 7 10 1 7 Glutamic acid-Hydroxyproline-glycine, abbreviated as one-letter amino acid It may be noted).
  • ⁇ ⁇ li 1 to 1 7 10 Colloidal peptide mixture containing peptides containing the amino acid sequence represented by, specifically, ⁇ ⁇ li 1 to 1 V Tribeptide represented by 10 ⁇ V, etc.
  • the present invention is specifically as follows.
  • the brain function regulating agent according to the present invention is: It contains a peptide having an amino acid sequence represented by IV or a salt thereof, or a chemical modification thereof.
  • the peptide or a salt thereof or a chemically modified form thereof is a triple peptide or a salt thereof represented by the following formula: _ 1 to 1 V-0 IV, or a chemically modified form thereof.
  • the peptide is preferably derived from collagen.
  • the above-mentioned peptide preferably has a weight average molecular weight of 315 or more and 100 or less.
  • the brain function regulator is preferably a brain function improving agent or a brain function lowering preventive agent.
  • the brain function regulator preferably has a cerebral nerve cell differentiation promoting action.
  • the above-mentioned brain function regulator has a cell death inhibitory action on cerebral nerve cells.
  • the above-mentioned brain function regulator preferably has an improving effect on memory ability or cognitive function. ⁇ 2020/175 570 4 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • the food and drink according to the present invention contains the brain function adjusting agent.
  • a brain function regulator containing a peptide or the like that exerts at least one of a brain function improving effect and/or a brain function lowering preventing effect by directly acting on brain nerve cells, and a food and drink containing the same Goods can be provided.
  • Fig. 1 is a graph showing the amount of NgM in plasma (Sample 3) of male Mice after a prescribed time after forcibly orally administering Mn. ..
  • Fig. 2 is a graph showing the amount of NgM in cerebrospinal fluid (Sample No. 10) of male mice after a prescribed time after forcing oral administration of NgM to male mice. ..
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of N. cerebrum in the brain (sample O) of male mice after a predetermined time after forcing oral administration of N. cerevisiae to male mice.
  • 8-Mi means the upper and lower limits of the range (that is, 8 or more and Mi or less), and the unit is not described in 8, and the unit is described only in M. , Then the units of and are the same.
  • the brain function regulating agent according to the present invention contains a peptide having an amino acid sequence represented by _ _ _ 1 to 1 7 _ _ 0 1 or a salt thereof, or a chemical modification thereof.
  • the brain function regulator having such characteristics can promote the differentiation of the brain nerve cells by directly acting on the brain nerve cells, and thereby exhibit the brain function improving effect and the brain function lowering preventing effect.
  • the brain function modifier contains a peptide having an amino acid sequence represented by: 1 to 17 17°, or a salt thereof, or a chemically modified form thereof. ⁇ 2020/175 570 5 (:171? 2020/007806
  • amino acid means 1-type amino acid, unless otherwise specified.
  • the peptide or salt thereof, or a chemical modification thereof is: a tripeptide represented by: 1 to 17 10 zo, a salt thereof, or a chemical modification thereof. Is preferred.
  • the brain function regulator can more markedly exhibit the action of promoting the differentiation of cerebral nerve cells.
  • the "salt" of the above-mentioned peptide is, for example, an inorganic acid salt such as hydrochloride, sulfate or phosphate, an organic acid salt such as methanesulfonate, benzenesulfonate, succinate or oxalate, It can be formed as an inorganic base salt such as sodium salt, potassium salt or calcium salt, or an organic base salt such as triethylammonium salt.
  • the "chemically modified form" of the above peptide refers to a peptide in which a free functional group of an amino acid residue which is a constituent unit is chemically modified.
  • Chemical modification can be performed, for example, on the hydroxyl group of hydroxyproline, the amino group of the amino acid at the 1 ⁇ 1 terminal (amino terminal) side, and the carboxyl group of the amino acid at the ⁇ 3 terminal (carboxyl terminal) side.
  • conventionally known chemical modification techniques for peptides are applied.
  • the chemically modified form of the above-mentioned peptide can exert an effect of improving the solubility from weak acidity to neutrality, an effect of improving the compatibility with other active ingredients, and the like.
  • the above-mentioned amidation can be carried out by reacting the above-mentioned peptide with calposimide or the like.
  • methylation can be performed as a chemical modification of the free amino group in the above tripeptide.
  • At least one of phosphorylation and sulfation can be carried out as the chemical modification of the free hydroxyl group in the above tripeptide.
  • the peptide is preferably derived from collagen.
  • collagen as a raw material is applied to skins, skins, bones, cartilage, tendons, etc. of animals typified by cattle, pigs, sheep, chickens, ostriches, etc., or bones, skins, scales, etc. of fish. It can be obtained by performing conventionally known degreasing or deashing treatment, extraction treatment, and the like. Further, gelatin can be used as a raw material of the above peptides. Gelatin can be obtained by treating collagen obtained as described above by a conventionally known method such as hot water extraction. Collagen and gelatin may be commercially available products.
  • the above-mentioned peptide can be obtained by hydrolyzing both or both of the above-mentioned collagen and gelatin with a combination of two or more kinds of endo-type protease and exo-type protease.
  • the above-mentioned peptide is obtained as a collagen peptide mixture which is mixed with other collagen peptides by the above-mentioned hydrolysis.
  • the peptide is derived from collagen, it is preferably obtained by using a method of enzymatically treating collagen or gelatin in two steps described below.
  • the above-mentioned peptide preferably has a weight average molecular weight of 315 or more and 100 or less.
  • the weight average molecular weight of the peptide is more preferably 3 15 or more and 500 or less, and further preferably 3 15 or more and 200 0 or less. Is.
  • the brain function regulator more significantly shows the action of promoting the differentiation of cerebral nerve cells, and thus the brain function improving effect and the brain function lowering preventing effect are more sufficiently exerted. Can be obtained.
  • the weight average molecular weight of the above peptide exceeds 10000, the brain function modifier may have insufficient brain function improving effect and brain function lowering preventing effect.
  • the weight average molecular weight of the peptide can be determined by performing size exclusion chromatography (SEC) under the following measurement conditions.
  • a sample (collagen peptide mixture) containing about 0.2 g of the above-mentioned peptide was added to about 100 ml of distilled water, and after stirring, a 0.2 M m filter was used.
  • a sample (measurement object) whose weight average molecular weight is to be measured is prepared by filtration. By subjecting this measured substance to the size exclusion chromatography described above, the weight average molecular weight of the peptide can be determined.
  • the peptide is tripeptide represented by Glu-Hyp-Gly, its molecular mass can be taken as the weight average molecular weight.
  • the peptide containing the amino acid sequence represented by IV can be obtained by using a conventionally known liquid phase or solid phase peptide synthesis method or a method of hydrolyzing collagen or gelatin.
  • the above-mentioned peptide is preferably produced from the viewpoint of efficiency by using a chemical synthesis method using an amino acid described later or a method of enzymatically treating collagen or gelatin in a two-step method described below.
  • the above peptides are treated with only the secondary enzyme without the primary enzyme, and the enzyme treatment with the primary and secondary enzymes is performed simultaneously. It is also possible to manufacture by using the method.
  • the above peptides can be obtained using a general peptide synthesis method.
  • a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method are known.
  • the solid phase synthesis method is known as the 01001 method and the Mitsu method.
  • the above peptides can be obtained by using either the method of 0100 or the method of 0.
  • a solid phase synthesis of peptides for example ⁇ Lee 1-1 7 ten ⁇ Toripe peptide synthesis methods represented by the source will be explained.
  • the diameter of the surface modified with amino groups ⁇ 0.1 Prepare beads of polystyrene polymer gel to a solid phase. Separately prepare diisopropyl carbimide as a condensing agent. Next, in the above amino acid sequence, the amino group of glycine, which is the amino acid at the end of ⁇ (carboxyl terminal), was replaced with 01 0 0 (1: While protecting with a group, the carboxyl group of the glycine and the amino group of the solid phase are bonded to each other by a dehydration reaction using the condensing agent. Further, the above solid phase is washed with a solvent to remove the remaining condensing agent and amino acid, and then the protecting group for the amino group of glycine bonded to the above solid phase is removed (deprotected).
  • the mino group is peptide-bonded by using the above condensing agent. Thereafter, in the same manner as above, deprotection of the amino group of hydroxyproline, preparation of glutamic acid protected by 010000, and reaction for peptide bond between this glutamic acid and hydroxyproline were carried out to give the above-mentioned solid To the phase ⁇
  • the tripeptide represented by ISO is synthesized. Finally, the amino group of glutamic acid is deprotected, a solution containing trifluoroacetic acid is added at room temperature, and the tripeptide is separated from the solid phase by shaking for a fixed time. As a result, the tripeptide can be produced.
  • enzymes or gelatin in two steps means the following. That is, after the primary enzyme treatment is carried out by a conventionally known method for cleaving the peptide bond of collagen or gelatin, an enzyme having aminopeptidase 1 ⁇ 1 activity, aminopeptidase 1 ⁇ ! activity and prolyltripeptidylaminopeptid It means performing secondary enzyme treatment with an enzyme that also has a peptidase activity, or a combination of an enzyme that has an aminopeptidase 1 ⁇ 1 activity and an enzyme that has a prolyltripeptidyl aminopeptidase activity.
  • a collagen peptide mixture precursor can be obtained.
  • a collagen peptide mixture containing the above-mentioned specific peptide can be obtained from the above collagen peptide mixture precursor.
  • the method of enzymatically treating collagen or gelatin in two steps will be described in more detail below.
  • the enzyme used in the primary enzyme treatment is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of cleaving the peptide bond of collagen or gelatin. ⁇ 2020/175 570 10 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • Any proteolytic enzyme can be used. Specific examples thereof include collagenase, thiol protease, serine protease, acidic protease, alkaline protease, metal protease, etc., and one selected from these groups may be used alone. You may use together more than one kind.
  • As the thiol protease plant-derived chymopapain, papain, bromelain, fiucin, animal-derived cathepsin, calcium-dependent protease and the like can be used.
  • As the serine protease, tribucine, catebsynlo and the like can be used.
  • As the acidic protease, pepsin, chymotrypsin and the like can be used.
  • As the enzyme used in the primary enzyme treatment when considering the use of the brain function regulator according to the present invention in medicines, foods for specified health uses, etc., without using an enzyme derived from a pathogenic microorganism, Is preferably used.
  • the amount of enzyme in the primary enzyme treatment is preferably 0.1 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of collagen or gelatin, for example.
  • the treatment temperature in the primary enzyme treatment is preferably 30 to 65 ° and the treatment time is preferably 10 minutes to 72 hours.
  • the weight average molecular weight of the collagen peptide mixture precursor obtained by the primary enzyme treatment is preferably 500 to 100,000, more preferably 500 to 500, further preferably 50. It is from 0 to 200. If the weight average molecular weight is within the above range, it can be said that peptides having an appropriate molecular weight are sufficiently produced.
  • the enzyme can be inactivated if necessary. In this case, the deactivation temperature is preferably, for example, 70 to 100 ° .
  • the weight average molecular weight of the collagen peptide mixture precursor can be determined by the method using the above-mentioned item 3.
  • the enzyme used in the secondary enzyme treatment includes an enzyme having aminopeptidase 1 ⁇ 1 activity, an enzyme having both aminopeptidase activity and prolyl tripeptidyl aminopeptidase activity, or an enzyme having aminopeptidase activity.
  • an enzyme having aminopeptidase 1 ⁇ 1 activity an enzyme having both aminopeptidase activity and prolyl tripeptidyl aminopeptidase activity, or an enzyme having aminopeptidase activity.
  • prolyl and prolyl tripeptidyl aminopeptidase activity A combination can be mentioned.
  • the term “enzyme having aminopeptidase N activity” refers to a peptidase having a function of releasing an amino acid from the N-terminal side of a peptide chain, wherein proline or hydroxyproline is second from the N-terminal side.
  • An enzyme that acts when an amino acid other than is present.
  • the term “enzyme having prolyltripeptidylaminopeptidase activity” means that only three amino acid residues on the N-terminal side are selected from a peptide whose third position from the N-terminal side is proline or hydroxyproline. Free peptidase.
  • the enzyme used in the secondary enzyme treatment when considering the use of the brain function regulator according to the present invention in medicines, foods for specified health care, etc., other enzymes can be used without using enzymes derived from pathogenic microorganisms. It is preferable to use.
  • Examples of the enzyme having aminopeptidase N activity include aminopeptidase N (EC3. 4. 1 1. 2.; T. Yoshimoto et al., Agric. Biol. Chem., 52:217-225. (1988)) and the like. Further, for example, an enzyme having an aminopeptidase N activity derived from the genus Aspergirllus can be mentioned. Examples of enzymes having prolyl tribeptidyl aminopeptidase activity include prolyl tribeptidyl aminopeptidase (EC 3.4.1.4; A. Banbu la et a 1., ⁇ Biol. Chem., 274:9246-92
  • the amount of enzyme in the secondary enzyme treatment is preferably, for example, 0.01 to 5 parts by mass of the above-mentioned enzyme with respect to 100 parts by mass of the collagen peptide mixture precursor.
  • the treatment temperature in the secondary enzyme treatment is preferably 30 to 65°C, and the treatment time is preferably 1 to 72 hours.
  • the weight average molecular weight of the collagen peptide mixture obtained by the secondary enzyme treatment is preferably 3 15 to 10000, more preferably 3 15 to 5000, and further preferably 3 15 to 2 ⁇ 2020/175 570 12 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • the weight average molecular weight of the collagen peptide mixture can also be determined by the method using the above-mentioned item 3.
  • the secondary enzyme treatment is carried out mainly for the purpose of producing the above-mentioned specific peptide. Therefore, it is preferable to adjust the amount of enzyme in the secondary enzyme treatment, the treatment temperature, the treatment time and 1 to 1 so that the peptide contained in the collagen peptide mixture precursor is not excessively hydrolyzed. Therefore, it is preferable to bring the collagen peptide mixture into the above range of the weight average molecular weight. It is necessary to inactivate the enzyme after the secondary enzyme treatment. In this case, the deactivation temperature is preferably, for example, 70 to 100 ° . Furthermore, it is preferable to perform sterilization treatment at 120° for several seconds or more. Further, it is also possible to apply heat of 200 ° C. or more to spray-dry this.
  • an enzyme having different activities in addition to the enzyme having the aminopeptidase 1 ⁇ ! activity and the enzyme having prolyltripeptidyl aminopeptidase activity, an enzyme having different activities can be used, and Two or more enzymes having different activities can be used in combination. This makes it possible to decompose and remove by-products.
  • the enzyme used in this case is preferably appropriately selected according to the type of collagen used as a raw material and the type of enzyme used for the primary enzyme treatment. Examples of the different activities mentioned above include dipeptidase activities such as prolidase activity and hydroxyprolidase activity. As a result, by-products such as dipeptide can be decomposed and removed.
  • the aminopeptidase 1 ⁇ ! activity is basically an activity of releasing the amino acids at the 1 ⁇ ! terminal side one by one. Therefore, if the collagen peptide mixture precursor obtained by the primary enzyme treatment contains a peptide having an extremely large molecular weight, the secondary enzyme treatment can be performed only with an enzyme having aminopeptidase 1 ⁇ 1 activity. The processing time remarkably increases.
  • prolyl oligopeptidase which is an endopeptidase having an activity of hydrolyzing the carboxyl group side of proline (prolidase activity)
  • prolyl oligopeptidase which is an endopeptidase having an activity of hydrolyzing the carboxyl group side of proline (prolidase activity)
  • a peptide having a relatively large molecular weight can be produced by the primary enzymatic treatment.
  • This peptide has, for example, an amino acid sequence represented by [B] _ ⁇ I Sor 2 — ⁇ I Lee 1 to 1 7 1 ⁇ I Sor] (X) and 2 1 1 to 1 7 be able to.
  • a collagen peptide mixture containing a specific peptide can be produced.
  • a purification method in this case a conventionally known method can be used. For example, various liquid chromatographies such as ultrafiltration, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography and affinity chromatography can be used. Graffiti can be used.
  • the collagen peptide mixture can be purified by the following procedure. That is about 2 9/1 0 _ the ion exchange column (for example, trade name: "Toyopearl (registered trademark) ⁇ Snake Hachimi one 6 5 0", manufactured by Tosoh Corporation) of the collagen peptide mixture! After you load in, Collect the first void volume fraction eluted with distilled water. Then, the first void volume fraction is ⁇ 2020/175 570 14 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • the brain function regulator according to the present invention is preferably a brain function improving agent or a brain function lowering preventive agent.
  • Brain function modifier contains a peptide or a salt or a chemical modification thereof, including amino acid sequence represented by ⁇ Lee 1-1 7 ten ⁇ V, described later with [Evaluation Test 1] And, as described in [Evaluation Test 2], it is possible to show the action of promoting the differentiation of cerebral nerve cells by directly acting on the cerebral nerve cells.
  • the brain function regulator can exert a brain function improving effect and a brain function lowering preventing effect. Therefore, the brain function adjusting agent can be used as a brain function improving agent for the treatment of a patient whose brain function is lowered.
  • the brain function regulator can also be used as a brain function decline preventive agent for the purpose of preventing the decline of brain function due to aging and the like.
  • the brain function regulator has a cerebral nerve cell differentiation promoting action. Further, the brain function regulator preferably has a cell death inhibitory action on cerebral nerve cells. It is also preferable that the brain function regulator has an effect of improving memory ability or cognitive function. As described in [Evaluation Test 1] and [Evaluation Test 2] described later, the brain function regulator promotes the differentiation of cerebral nerve cells by directly acting on the cerebral nerve cells. ⁇ 2020/175 570 15 ⁇ (:171? 2020/007806
  • the brain function regulator can show a progressive effect. It can be considered from the following [Evaluation test 1] and [Evaluation test 2] that the brain function regulator also has a cell death inhibitory action on cerebral nerve cells. Through these actions, the brain function regulator can exert an action of improving memory ability or cognitive function.
  • the brain function regulator can be orally or parenterally administered in various forms. When administered orally, it may be in the form of tablets, granules, capsules, powders, solutions, suspensions, emulsions and the like. Further, the above-mentioned drug function regulating agent can be mixed with foods and drinks.
  • the above brain function modifier can be in the form of injection into the brain, injection, transdermal agent, suppository, nasal drop, inhalant, etc. ..
  • Preferable dosage forms of the brain function adjusting agent include tablets, granules, capsules, powders, and liquid agents for direct injection into the brain.
  • Brain function modulators include, for example, the above-mentioned tripeptides represented by 1 to 1 V and 10 V, but since this tripeptide is rapidly absorbed in the intestinal tract, it can be taken orally. Is.
  • the dose of the above-mentioned brain function-adjusting agent varies depending on the age, sex, body weight, sensitivity difference, administration method, administration interval, type of preparation, etc. of the subject.
  • the dose may be, for example, 0,000, 1 to 2 per adult per day.
  • the dosage form of the above-mentioned brain function-adjusting agent is, for example, a tablet, it is a tablet containing a brain function-adjusting agent in an amount of from 0.0001 to 80% by weight, and when it is a powder, for example, A powder containing a brain function-adjusting agent in a range of 1 to 100% by mass can be prepared.
  • the above-mentioned dose can be appropriately determined with reference to the dose in the case of oral administration in the case of parenteral administration, in the case of administration in the form of other forms and the like.
  • the brain function-adjusting agent can be administered in 1 to several times a day in divided doses, or can be administered once to several days in a day. ⁇ 2020/175 570 16 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • the above-mentioned brain function modifier may appropriately contain other active ingredients, carriers for formulations, etc. within a range that does not adversely affect the effects of the present invention.
  • Other active ingredients include, for example, docosahexaenoic acid (01 to 18), eicosapentaenoic acid (Machi-8), astaxanthin, citrus leaf extract, and arachidonic acid.
  • a pharmaceutically acceptable carrier used for formulation into a pharmaceutical preparation diluents, binders (syrup, gum arabic, gelatin, sorbit, tragacanth, polyvinylpyrrolidone), excipients (lactose, Syo-sugar, Cornstarch, Phosphorus® love potassium, sorbit, glycine), lubricants (magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica), disintegrants (valleycilla starch) and wetting agents (sodium lauryl sulfate) And so on.
  • the brain function regulating agent according to the present invention contains a peptide containing an amino acid sequence represented by 0 1 _ 1 to 1 7 _ 0 1 or a salt thereof, or a chemically modified product thereof.
  • Brain function modifier ⁇ 1 peptide comprising the amino acid sequence represented by Li _ 1 to 1 7 _ ⁇ 1 Seo, e.g. ⁇ Lee 1-1 Soviet one ⁇ unknown of Toripe peptide represented by ⁇ Seo
  • it has a cerebral nerve cell differentiation promoting action, and thus at least one of a cerebral function improving effect and a cerebral function lowering preventing effect can be obtained.
  • the present invention is intended for brain function adjustment. It can be said to be a peptide containing an amino acid sequence represented by V, a salt thereof, or a chemically modified form thereof.
  • the food or drink according to the present invention contains the brain function adjusting agent.
  • the brain function regulators For example, it is preferable to be included in the brain function regulators.
  • the tripeptides represented by 1 to 1 and 1 to 10 are rapidly absorbed in the intestinal tract as described above, and thus can be taken orally. .. Therefore, the present invention can be taken as a food or drink containing the above brain function-regulating agent by mixing it with a meal or a drink. Further, the food or drink according to the present invention can be used as a food for specified health use or a food with functional claims.
  • the concentration of the brain function modifier contained in is preferably 0.001 to 100% by mass.
  • a collagen peptide mixture containing the amino acid sequence represented by Glu-Hyp-GIy (trade name: "collagen peptide CP-B", manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) was used. During the test period described later, the subjects were allowed to take 5 g of the above test food once a day by adding it to any beverage. The ingestion time of the beverage was not specified.
  • the test period was four consecutive weeks selected from the period from October 20, 2016 to January 21, 2011.
  • a comparative study before and after the open label intervention was conducted at the Kyoto University Future Research Center.
  • informed consent was given to all subjects and the written consent was obtained from all subjects under the purpose of the “Helsinki Declaration” of the World Medical Association.
  • this study was approved by the Ethics Review Committee for Advanced Research Unit of Kyoto University (approval number ⁇ 27-P– 13).
  • GM gray mass cerebral health care index
  • FA anisotropic cerebral health care index of nerve fibers
  • MC I mild cognitive impairment
  • S-PA standard language-versus-related learning
  • the magnetic resonance imaging (MRI) scan is performed on the day before the start of intake of the above test food (hereinafter also referred to as “before intervention”) and the day after the end of intake of the above test food (29 days from the start of intake, below, (Also referred to as “after intervention”).
  • Pre-intervention MRI imaging was performed between October 20, 2010 and October 24, 2014, and post-intervention MR imaging was performed from January 18, 2014 to January 1, 2016. It was executed by 21st of the month. Imaging of MR ⁇ was carried out at Kokoro Research Center, Kyoto University.
  • MRI apparatus As the MRI apparatus, a 3T scanner "Ve rio" manufactured by Siemens, Germany was used, and imaging was performed using a 32-channel head array coil. MP-RAGE pulse sequence was used for 3D T 1 weighted images. The parameters are as follows. Repetition time (TR) 1 900 m s; Echo time (TE) 2 ⁇ 2020/175 570 19 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • Gray matter was extracted from the 1-weighted image using the brain function mapping tool 3 1 ⁇ /11 2 and the gray matter volume and the intracranial volume were used to extract the whole brain. Min 1 to 10 scores were calculated. Software from diffusion tensor image 3 !_ 5. ⁇ .1
  • the tools used for the statistical processing performed in the process of calculating the scores of Yaichi 1 to 10 are the medical statistical program “3 cho 8 cho 6 ⁇ ⁇ ”.
  • the within-group comparison before and after the intervention was performed based on the Wilcoxon rank sum test, and when the significance level (value) was less than 0.05, it was judged to be significant before and after the intervention.
  • “! ⁇ !” means the number of subjects
  • “Mizu 336 Means before intervention “03 1:” means after intervention
  • “ ⁇ ” means the difference before and after intervention.
  • the mild cognitive impairment (1 ⁇ /10 I) score was calculated by using the "Atama health check (Millenia Co., Ltd.)" which is a scale for confirming cognitive function. Specifically, the subjects were asked to memorize 10 words, and after giving an explanation unrelated to the test, how many of the above 10 words could be verbally answered were measured.
  • the IV! (3 I score of each subject was compared with the test results of each subject with the same age group based on information such as the subject's sex, age, years of learning, and race, and a demographic objective evaluation was performed. For this study, IV!
  • the standard language-related learning (3 _) score was developed by the Japanese Society for Higher Brain Dysfunction for the purpose of understanding human verbal memory.
  • the contents of the specific test of the score are as follows. First, a sheet consisting of 10 pairs of related words (words that are semantically related) and 10 pairs of irrelevant words (words having a weak semantic relationship) is prepared. Then, the examiner reads out the 10 relevant pairs of related words written on the sheet and asks the subject to remember them. Then, one of these paired words is presented and the other paired word is answered. In addition, the inspector will read out the 10 unrelated word pairs listed on the above sheet. ⁇ 2020/175 570 21 ⁇ (:171? 2020 /007806
  • the brain function regulator can be used as a brain function improving agent or a brain function lowering preventive agent.
  • the brain function regulator can be used as a brain function improving agent or a brain function lowering preventive agent.
  • the cell density of living cells was 1.2X10 ⁇ 0 with respect to the mixed solution.
  • cytosine (3 — D- arabinofuranoside (A-) was added so that the final concentration would be 10 MM in order to maintain only CGC and suppress the growth of non-neuronal cells.
  • ra C was added, and KC I was added so that the final concentration was 25 mM in the control sample described later, and other samples (peptides or amino acids shown in Tables 5 to 7 described later were added. (Sample) was adjusted to a final concentration of 15 mM and added.
  • each sample was prepared by adding the peptides or amino acids shown in Tables 5 to 7 below to the final concentrations shown in Tables 5 to 7, respectively. ..
  • control (K + ) means a control sample.
  • NMDA trade name: “M3262”, manufactured by Sigma-Aldrich
  • BDN F trade name: “SRP”.
  • ⁇ represents a ring ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ I ⁇ ), 1 to 1 represents histidine, represents proline, ⁇ represents glycine, ⁇ represents hydroxyproline, mit represents glutamic acid, and 8 represents alanine. Represents.
  • “ ⁇ 11 to 1?” means a sample to which a cyclic dipeptide consisting of histidine-proline (manufactured by PHI Japan Co., Ltd.) was added
  • “ ⁇ 10” means a cyclic dipeptide consisting of glycine-proline ( P-Japan Co., Ltd.) is added to the sample
  • “Cho [3 ⁇ 4 1 to 1]” means a sample to which thyrotropin-releasing hormone (P-H Japan Co., Ltd.) is added.
  • glutamic acid means a sample to which glutamic acid (trade name: “0 1 2 5 1", manufactured by Sigma-Aldrich), which is known to have an antioxidant effect, is added.
  • Glutathione is, ⁇ Lee 1 to 1 7 one ⁇ Seo (£ 0 0) in glutathione which the chemical structure is similar (trade name: "0 6 0 1 3", manufactured by Sigma-Aldrich) sample was added.
  • Means " ⁇ ” means a sample to which a tripeptide consisting of glycine-proline-hydroxyproline (manufactured by PHC Japan Co., Ltd.) was added.
  • Glutamic acid "Glutathione” and “ ⁇ ” are all comparative examples.
  • ⁇ means a sample to which a cyclic dipeptide consisting of proline-hydroxyproline (manufactured by PHC Japan Co., Ltd.) was added, and "0- ⁇ ” means hydroxyproline-glycine. Cyclic dipeptide (manufactured by P-H Japan Co., Ltd.) was added to the sample, and “ ⁇ 1 ⁇ ” means the sample to which cyclic dibeptide (manufactured by PHI Japan Co., Ltd.) consisting of monohydroxyproline glutamate was added.
  • ⁇ is a dipeptide consisting of proline-hydroxyproline (trade name: “0—3025”, Minhachi) ⁇ 2020/175 570 27 ⁇ (: 171? 2020 /007806
  • ⁇ 1 to 1 1//1 company added sample ⁇ ⁇ indicates dipeptide consisting of hydroxyproline-glycine (trade name: “0-2 3 6 5 ”, Mami 801 1 to 1 80% (manufactured by 1/1 company), and “80” means a sample to which a dipeptide consisting of alanine-hydroxyproline (manufactured by PHC Japan Co., Ltd.) was added. About “ ⁇ ”, it is known to cross the blood-brain barrier.
  • ⁇ is, dipeptide consisting of glycine over proline (trade name: " ⁇ - 3 0 1 5", Snake eight Rei_1-made 1 Snake IV Company) was the sample added
  • ""M” means each sample to which a dipeptide consisting of glutamic acid-hydroxyproline (manufactured by PHI Japan Co., Ltd.) was added. Both “ ⁇ ” and “Mi” are comparative examples.
  • “Mix” means a sample to which a tripeptide (manufactured by PHI Japan Co., Ltd.) represented by _ _ _ 1 to 1 7 _ _ _ was added, which is an example in this test.
  • the brain function regulating agent and the food and drink containing the same can promote the differentiation of brain neuronal cells by directly acting on the brain nerve cells. .. Due to such an action, the brain function regulator and foods and drinks containing the same can exert an action of improving memory or cognitive function. Therefore, the brain function regulator can be used as a brain function improving agent or a brain function lowering preventive agent.
  • mice All experimental animals were in accordance with the “Standard for breeding and storage of experimental animals” of the Prime Minister's Office. 8 weeks old ⁇ 1
  • Two male S-type mice were purchased from Sankyo Lab Service Co., Ltd. Then, the above male mice were acclimated for 1 week to form a 9-week-old male mouse and then fasted for 12 hours. Then, the male mice Snake hundred to (0 I Lee 1-1 7 ten ⁇ Seo, Inc. P. H. Japan Co., purity 95% or more) 2 was forcedly orally administered as an aqueous solution of 2500 to prepare two male mice for analysis of delivery to the brain parenchyma of £00.
  • Anesthesia was subcutaneously injected 10 minutes before 2 hours and 4 hours after each.
  • the above anesthetic is called triple anesthesia, and is medetomidine hydrochloride 0.39/9.
  • brain substance a part of the brain substance (hereinafter, also simply referred to as “brain”) was extracted from 0.28 to 0.333!!9.
  • Plasma was first obtained from the above blood by centrifugation at 4 ° for 10 minutes at a centrifugal acceleration of 240 ° , and this was temporarily stored at 180 ° . Then, after mixing with ethanol in an amount 3 times the liquid volume of the above plasma, centrifugation was performed under the conditions of 4°, centrifugal acceleration of 100° and 10 minutes to obtain a supernatant. Then, add 5 to the above supernatant. Ammonium bicarbonate prepared in 1 was added to and mixed with 4 times the liquid volume of the above supernatant.
  • each of the samples (oral administration) for measuring the total amount of plasma in the male mouse was measured by filtering the supernatant containing the ammonium bicarbonate with a 0.2 filter (manufactured by Sartorius Co., Ltd.). Samples before ( ⁇ hour), after 1 hour after oral administration, after 2 hours and after 4 hours (collectively referred to as "Sample 3" below) were obtained.
  • each cerebrospinal fluid containing the above ammonium bicarbonate was filtered through a 0.2 filter (manufactured by Sartorius Co., Ltd.) to obtain a sample for measuring the amount of cerebral spinal fluid in the male mouse ( Before oral administration (0 hours), after 1 hour of oral administration, after 2 hours and after 4 hours of administration, these samples were collectively referred to as “sample swab” below).
  • Example c Each sample for measuring the amount of EOG in the brain by filtering the above suspension containing nickel with a 0.2 M m filter (manufactured by Sartorius Co., Ltd.) (before oral administration ( ⁇ hours), oral administration Each sample after 1 hour, 2 hours, and 4 hours was collectively referred to as “Sample c” below).
  • FIG. 1 is a graph showing the amount of EOG in the plasma (sample a) of male mice after a predetermined time after forcing oral administration of EOG to male mice.
  • Fig. 2 is a graph showing the amount of E0G in cerebrospinal fluid (Sample b) of male mice after a predetermined time after forcibly orally administering EOG to male mice.
  • Fig. 3 is a graph showing the amount of EOG in the brain (sample c) of a male mouse after a predetermined time after forcibly orally administering EOG to a male mouse.
  • the EOG levels shown in Figures 1 to 3 are the average values obtained from two male mice.
  • H P L C device ACQU I TY U P LC H-C l a s s s B i o (W a t e r s Co r p o r a t i o n#)
  • Injection volume 0.5 ⁇ .
  • M S / M S equipment “Xe v o TQ— XS”, Wa t er s Co r p o r a t i o n

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Abstract

脳機能調整剤は、Ｇｌｕ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはその塩、もしくはその化学修飾体を含有する。

Description

\¥02020/175570 1 卩（：17 2020 /007806 明 細 書
発明の名称 ： 脳機能調整剤、 およびこれを含む飲食品
技術分野
[0001] 本発明は、 脳機能調整剤、 およびこれを含む飲食品に関する。
背景技術
[0002] コラーゲン加水分解物 （以下、 「コラーゲンペプチド混合物」 とも記す） は、 生体に対して様々な生理活性を示すことが公知である。 最近、 コラーゲ ンぺプチド混合物が脳神経細胞などに対しても生理活性を示し、 記憶力など の脳機能を改善する効果 （以下、 「脳機能改善効果」 とも記す） を有するこ とが報告され始めた。 たとえば特開 201 0- 1 05996号公報 （特許文 献 1） は、 0 \ V - 9 r〇 - A r 9で表されるぺプチドをはじめとする合計 9つのコラーゲン由来べプチドを含有する神経新生促進剤を開示している。 特開 201 1 — 1 1 1 440号公報 （特許文献 2） は、 コラーゲン由来であ って◦ 丨 V- ? 「〇_八 丨 3で表されるペプチドに神経新生促進作用がある ことを開示している。 非特許文献 1は、 魚由来のコラーゲンペプチド混合物 を老化モデルマウスに投与することにより、 海馬における巳〇 （脳由来 神経栄養因子） の発現量が増加し、 もって空間学習記憶能力および受動的回 避能力が高まることを報告している。 非特許文献 2は、 ラッ トを用いた実験 においてコラーゲン由来の 「〇— 1~1ソ で表されるジペプチドが、 脳脊髄 液に移行することにより抗うつ効果を発揮したことを報告している。 非特許 文献 3は、 コラーゲン加水分解物が海馬の神経新生を促進したことを報告し ている。
先行技術文献
特許文献
[0003] 特許文献 1 :特開 201 0- 1 05996号公報
特許文献 2 :特開 201 1 - 1 1 1 440号公報
非特許文献 \¥02020/175570 2 卩（：17 2020 /007806
[0004] 非特許文献 1 : Pei Xinrong et al. , ” Preventive Effect of Marine
CoUagen Peptide on Learning and Memory Impairment in SAMP8 Mice”, Food and Fermentat i on Industries, 2009, Vo L 135(07), p.1-5
非特許文献 2 :永井ら、 「コラーゲン由来抗うつべプチドの同定およびその脳 脊髄液への移行」 、 201 7年度農芸化学会大会講演要旨集、 2017年3月5日 、 P· 997
特許文献 3 :し· Kakoi et al. , Collagen peptides enhance hippoca mpa L neurogenesis and reduce anxiety related behavior in mice ”， Biomedical Research 33 (5) , 2012, p.273-279
発明の概要
発明が解決しようとする課題
[0005] 上記非特許文献 1および非特許文献 3に開示された脳機能改善効果、 また は神経新生作用は、 コラーゲン由来のどのようなぺプチドによって得られる のかが特定されていない。 上記特許文献 1 に開示された神経新生促進作用は 、 9つのコラーゲン由来のペプチドのうち、 どのペプチドによるのかが特定 されていない。 上記特許文献 2に開示された神経新生促進作用は、 ラッ トの 副腎褐色細胞腫由来の PC 1 2細胞を用いた実験から得られた知見であり、 脳神経細胞を対象とした実験から得られた知見ではない。 さらに上記非特許 文献 2が開示する P r o_H y pは、 海馬歯状回における神経新生作用を有 することを示唆するが、 P r o_H y pによって脳神経細胞が分化および成 長することにより脳機能が改善するかどうかについては確認されていない。 したがって、 未だホルモンなどの生体内シグナル伝達物質を介することなく 脳神経細胞に直接作用することによって脳機能改善効果を奏するコラーゲン 由来のぺプチドは知られておらず、 その開発が切望されている。
[0006] 上記実情に鑑み、 本発明は、 脳神経細胞に直接作用することにより脳機能 改善効果または脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するペプチド などを含む脳機能調整剤、 およびこれを含む飲食品を提供することを目的と 〇 2020/175570 3 卩（：171? 2020 /007806
する。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、 脳神経細胞に直接作用することにより脳機能改善効果また は脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するぺプチドなどを含む脳 機能調整剤を開発する中で、 コラーゲンべプチド混合物に含まれるペプチド のアミノ酸配列のうち◦ 1 リー1~1 7 一〇 1 7 （グルタミン酸ーヒ ドロキシ プロリンーグリシン、 以下、 アミノ酸を一文字で表記する略号を用いて 「巳 〇〇」 とも記す場合がある） に注目した。 〇 丨 リー1~1 7 一〇 丨 ソで表され るアミノ酸配列を含むぺプチドを含有するコラーゲンべプチド混合物、 具体 的には◦ 丨 リー1~1 V 一〇 丨 Vで表される トリベプチドなどを脳神経細胞に 作用させた結果、 これらが脳神経細胞の分化を促進し、 もって脳機能改善効 果および脳機能低下予防効果を奏することを知見し、 本発明に到達した。 本 発明は、 具体的には以下のとおりである。
[0008] 本発明に係る脳機能調整剤は、 ◦ I
Figure imgf000005_0001
I Vで表されるアミノ 酸配列を含むぺプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体を含有する。
[0009] 上記べプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体は、 ◦ 丨 リ _ 1~1 V - 0 I Vで表される トリぺプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体で あることが好ましい。
[001 0] 上記ペプチドは、 コラーゲン由来であることが好ましい。
上記べプチドは、 その重量平均分子量が 3 1 5以上 1 0 0 0 0以下である ことが好ましい。
[001 1 ] 上記脳機能調整剤は、 脳機能改善剤または脳機能低下予防剤であることが 好ましい。
上記脳機能調整剤は、 脳神経細胞の分化促進作用を有することが好ましい
[0012] 上記脳機能調整剤は、 脳神経細胞の細胞死抑制作用を有することが好まし い。
上記脳機能調整剤は、 記憶力または認知機能の改善作用を有することが好 〇 2020/175570 4 卩（：171? 2020 /007806
ましい。
［0013］ 本発明に係る飲食品は、 上記脳機能調整剤を含む。
発明の効果
［0014］ 本発明によれば、 脳神経細胞に直接作用することにより脳機能改善効果ま たは脳機能低下予防効果の少なくともいずれかを奏するぺプチドなどを含む 脳機能調整剤、 およびこれを含む飲食品を提供することができる。
図面の簡単な説明
［0015］ ［図 1］図 1は、 雄性マウスに対し巳〇〇を強制的に経口投与した後、 所定時間 後の雄性マウスの血漿 （試料 3） 中の巳〇〇量を表すグラフである。
［図 2］図 2は、 雄性マウスに対し巳〇〇を強制的に経口投与した後、 所定時間 後の雄性マウスの脳脊髄液 （試料 1〇） 中の巳〇〇量を表すグラフである。
［図 3］図 3は、 雄性マウスに対し巳〇〇を強制的に経口投与した後、 所定時間 後の雄性マウスの脳 （試料〇） 中の巳〇〇量を表すグラフである。 発明を実施するための形態
［0016］ 以下、 本発明に係る実施形態について、 さらに詳細に説明する。 ここで、 本明細書において 「八〜巳」 という形式の表記は、 範囲の上限下限 （すなわ ち八以上巳以下） を意味し、 八において単位の記載がなく、 巳においてのみ 単位が記載されている場合、 の単位と巳の単位とは同じである。
［0017］ ［脳機能調整剤］
本発明に係る脳機能調整剤は、 〇 丨 リ _ 1~1 7 _〇 1 ソで表されるアミノ 酸配列を含むぺプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体を含有する。 このような特徴を備える脳機能調整剤は、 脳神経細胞に直接作用することに より脳神経細胞の分化を促進し、 もって脳機能改善効果および脳機能低下予 防効果を奏することができる。
［0018］ <◦ 丨 リー1~1 7 一〇 丨 ソで表されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは その塩、 もしくはその化学修飾体 >
上述のとおり脳機能調整剤は、 ◦ 丨 リー 1~1 7 一◦ 丨 ソで表されるアミノ 酸配列を含むぺプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体を含有する。 〇 2020/175570 5 卩（：171? 2020 /007806
本明細書において 「アミノ酸」 は、 特に明示しない限り、 1-型アミノ酸を意 味する。 「〇 丨 1<1— 1~1 7 一〇 丨 ソで表されるアミノ酸配列を含むペプチド 」 とは、 当該ペプチドを構成するアミノ酸配列中に 「〇 丨 リー1~1 7 一〇 1 V （グルタミン酸ーヒドロキシプロリンーグリシン） 」 で表されるアミノ酸 配列が 1箇所以上含まれていることを意味する。
[0019] 上記脳機能調整剤において、 上記ペプチドまたはその塩、 もしくはその化 学修飾体は、 ◦ 丨 リー1~1 7 一〇 丨 ソで表されるトリペプチドまたはその塩 、 もしくはその化学修飾体であることが好ましい。 この場合、 脳機能調整剤 は、 脳神経細胞の分化を促進する作用をより顕著に示すことができる。
[0020] 上記ペプチドの 「塩」 は、 たとえば塩酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩などの無機 酸塩、 メタンスルホン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 コハク酸塩、 シュウ酸 塩などの有機酸塩、 ナトリウム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩などの無機塩 基塩、 トリエチルアンモニウム塩などの有機塩基塩などとして形成されるこ とができる。
[0021 ] 上記ペプチドの 「化学修飾体」 とは、 構成単位であるアミノ酸残基が有す る遊離の官能基が化学修飾されたペプチドをいう。 化学修飾は、 たとえばヒ ドロキシプロリンの水酸基、 1\1末 （アミノ末端） 側のアミノ酸のアミノ基お よび <3末 （カルボキシル末端） 側のアミノ酸のカルボキシル基に対して実行 することができる。 化学修飾の具体的手段およびその処理条件は、 従来公知 のペプチドの化学修飾技術が適用される。 このような化学修飾によって、 上 記ペプチドの化学修飾体は、 弱酸性から中性で溶解性が向上する効果、 他の 有効成分との相溶性が向上する効果などを奏することができる。
[0022] たとえば◦ 丨 リー 1~1ソ 一◦ 丨 ソのトリペプチドに対し、 ヒドロキシプロ リンにおける水酸基の化学修飾として、 〇ーアセチル化などを行うことがで きる。 この〇ーアセチル化は、 たとえば水溶媒中または非水溶媒中で無水酢 酸を作用させることによって実行することができる。 グリシンにおけるカル ボキシル基の化学修飾として、 エステル化、 アミ ド化などを行うことができ る。 上記エステル化は、 上記ペプチドをメタノールに懸濁した後、 これに乾 〇 2020/175570 6 卩（：171? 2020 /007806
燥塩化水素ガスを通気することによって実行することができる。 上記アミ ド 化は、 上記ペプチドにカルポジイミ ドなどを作用させることによって実行す ることができる。
[0023] さらに上記トリペプチド中の遊離のアミノ基の化学修飾として、 メチル化 を行うことができる。 上記トリベプチド中の遊離の水酸基の化学修飾として 、 リン酸化および硫酸化の少なくともいずれかを行うことができる。
[0024] 上記ペプチドは、 コラーゲン由来であることが好ましい。 この場合、 原料 としてのコラーゲンは、 たとえば牛、 豚、 羊、 鶏、 ダチョウなどに代表され る動物の皮、 皮膚、 骨、 軟骨、 腱など、 あるいは魚類の骨、 皮、 鱗などに対 して従来公知の脱脂または脱灰処理、 抽出処理などを実行することにより得 ることができる。 さらに上記ペプチドの原料として、 ゼラチンを用いること もできる。 ゼラチンは、 上述のようにして得たコラーゲンを熱水抽出などの 従来公知の方法で処理することにより得ることができる。 コラーゲンおよび ゼラチンは、 市販のものを原料として用いることもできる。
[0025] 上記ペプチドは、 上記コラーゲンおよびゼラチンの両方またはいずれか一 方に対し、 エンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの 2種以上を 組み合わせて加水分解することによって得ることができる。 上記ペプチドは 、 上記の加水分解によって他のコラーゲンべプチドとともに混在するコラー ゲンべプチド混合物として得られるが、 このコラーゲンべプチド混合物自体 、 およびこれを部分精製した混合物を本発明に係る脳機能調整剤として用い ることができる。 さらに、 上記コラーゲンペプチド混合物をさらに精製する ことにより、 ◦ 丨 リー 1~1 V 一〇 丨 Vで表されるアミノ酸配列を含むぺプチ ドを高純度で得ることができる。 上記ペプチドは、 コラーゲン由来である場 合、 後述するコラーゲンまたはゼラチンを 2段階で酵素処理する方法を用い ることにより得ることが好ましい。
[0026] さらに上記べプチドは、 その重量平均分子量が 3 1 5以上 1 0 0 0 0以下 であることが好ましい。 上記べプチドの重量平均分子量は、 より好ましくは 3 1 5以上 5 0 0 0以下であり、 さらに好ましくは 3 1 5以上 2 0 0 0以下 である。 上記ペプチドの重量平均分子量が上述した範囲内である場合、 脳機 能調整剤は、 脳神経細胞の分化を促進する作用をより顕著に示し、 もって脳 機能改善効果および脳機能低下予防効果をより十分に得ることができる。 上 記べプチドの重量平均分子量が 1 0000を超える場合、 脳機能調整剤は、 脳機能改善効果および脳機能低下予防効果が不十分と恐れがある。
[0027] 上記ペプチドの重量平均分子量は、 以下の測定条件の下でサイズ排除クロ マトグラフィー （S EC） を実行することにより求めることができる。 機器 ：高速液体クロマトグラフィー （H P LC） （東ソー株式会社製） カラム： TS KGe l （登録商標） G 2000 S WXL
カラム温度： 40°C
溶離液： 45質量％アセトニトリル （0. 1質量％ T FAを含む） 流速 ： 1. 0 m L / m i n
注入量： 1 0 M L
検出 ： U V 2 1 4 n m
分子量マーカー：以下の 5種を使用
C y t o c h r om C Mw : 1 2000
A p r o t i n i n Mw : 6500
B a c i t r a c i n Mw : 1 450
G I y— G I y— T y r— A r g Mw : 45 1
G l y— G l y— G l y Mw : 1 89〇
[0028] 具体的には、 約 0. 2 gの上記ペプチドを含む試料 （コラーゲンペプチド 混合物） を約 1 00 m Iの蒸留水に添加し、 撹拌した後、 0. 2 M mフィル ターを用いてろ過することにより、 重量平均分子量を測定する試料 （被測定 物） を調製する。 この被測定物を上述したサイズ排除クロマトグラフィーに 供することにより、 上記べプチドの重量平均分子量を求めることができる。 なお、 上記べプチドが G l u -H y p-G l yで表されるトリベプチドであ る場合、 その分子質量を重量平均分子量とすることができる。
[0029] <脳機能調整剤の製造方法 > 〇 2020/175570 8 卩（：171? 2020 /007806
脳機能調整剤に含まれる◦ 丨
Figure imgf000010_0001
I Vで表されるアミノ酸配列 を含むペプチドは、 従来公知の液相または固相のペプチド合成方法、 あるい はコラーゲンまたはゼラチンを加水分解する方法を用いることにより得るこ とができる。 たとえば上記ペプチドは、 効率性の観点から後述するアミノ酸 を用いた化学合成方法、 あるいは後述するコラーゲンまたはゼラチンを 2段 階で酵素処理する方法を用いることにより製造することが好ましい。 さらに 上記べプチドは、 コラーゲンまたはゼラチンを 2段階で酵素処理する方法に 代えて、 1次酵素を省略し 2次酵素のみにより酵素処理する方法、 1次酵素 および 2次酵素による酵素処理を同時に行う方法を用いることにより製造す ることも可能である。
[0030] （化学合成方法）
上記ペプチドは、 一般的なペプチド合成法を用いて得ることができる。 こ のペプチド合成法としては、 固相合成法および液相合成法が公知である。 固 相合成法には、 01〇〇法と巳〇〇法とが知られている。 上記べプチドは、 01〇〇法および巳〇〇法のいずれの方法を用いても得ることができる。 以 下、 ペプチドの固相合成法として、 たとえば◦ 丨 リー1~1 7 一〇 丨 ソで表さ れるトリぺプチドの合成方法について説明する。
[0031 ] まず表面をアミノ基で修飾した直径〇. 1
Figure imgf000010_0002
程度のポリスチレン高分子 ゲルのビーズを固相として準備する。 縮合剤としてジイソプロピルカルポジ イミ ドを別途準備する。 次に、 上記アミノ酸配列において〇末 （カルボキシ ル末端） 側のアミノ酸であるグリシンのアミノ基を 01 0 0 （1： 丨 リ 0 「 6
Figure imgf000010_0003
基で保護するとともに、 上記 縮合剤を用いた脱水反応により上記グリシンのカルボキシル基と上記固相の 上記アミノ基とをべプチド結合させる。 さらに上記固相を溶媒で洗浄するこ とにより、 残存する縮合剤およびアミノ酸を除去した後、 上記固相にぺプチ ド結合しているグリシンのアミノ基の保護基を除去 （脱保護） する。
[0032] 続いて、 〇〇基でアミノ基を保護したヒドロキシプロリンを準備し、 このヒドロキシプロリンのカルボキシル基と、 上記グリシンの脱保護したア 〇 2020/175570 9 卩（：171? 2020 /007806
ミノ基とを上記縮合剤を用いることによりペプチド結合させる。 以後、 同様 の要領で上記ヒドロキシプロリンのアミノ基の脱保護、 01〇〇基で保護し たグルタミン酸の準備、 ならびにこのグルタミン酸と上記ヒドロキシプロリ ンとをペプチド結合させる反応を実行することにより、 上記固相に◦ 丨 リー
Figure imgf000011_0001
I ソで表されるトリペプチドを合成する。 最後に、 上記グルタミ ン酸のアミノ基の脱保護を行い、 かつ室温にてトリフルオロ酢酸を含む溶液 を加えるとともに、 _定時間振盪することによって上記固相から上記トリぺ プチドを切り離す。 これにより上記トリベプチドを製造することができる。
[0033] （コラーゲンまたはゼラチンを用いた製造方法）
以下、 上記ペプチドの製造方法の一例として、 コラーゲンまたはゼラチン を 2段階で酵素処理することにより、 ◦ 丨 リー 1~1 7 一〇 丨 ソで表される卜 リペプチド （以下、 「特定のペプチド」 とも記す） を製造する方法について 説明する。
[0034] ここでコラーゲンまたはゼラチンを 「2段階で酵素処理する」 とは、 次の ことを意味する。 すなわち、 コラーゲンまたはゼラチンのペプチド結合を切 断する従来公知の方法により 1次酵素処理を実行した後に、 アミノぺプチダ _ゼ1\1活性を有する酵素、 アミノぺプチダーゼ1\!活性およびプロリルトリベ プチジルアミノぺプチダーゼ活性を併有する酵素、 またはアミノぺプチダー ゼ1\1活性を有する酵素およびプロリルトリベプチジルアミノぺプチダーゼ活 性を有する酵素の組合せにより 2次酵素処理を実行することをいう。 1次酵 素処理を実行することにより、 コラーゲンべプチド混合物前駆体を得ること ができる。 さらに 2次酵素処理を実行することにより、 上記コラーゲンぺプ チド混合物前駆体から上記特定のぺプチドを含むコラーゲンべプチド混合物 を得ることができる。 コラーゲンまたはゼラチンを 2段階で酵素処理する方 法について、 以下さらに詳述する。
[0035] - 1次酵素処理一
1次酵素処理で用いる酵素としては、 コラーゲンまたはゼラチンのぺプチ ド結合を切断することが可能な酵素であれば、 特に限定されるべきではなく 〇 2020/175570 10 卩（：171? 2020 /007806
、 任意のタンパク質分解酵素を用いることができる。 具体的には、 コラゲナ —ゼ、 チオールプロテアーゼ、 セリンプロテアーゼ、 酸性プロテアーゼ、 ア ルカリ性プロテアーゼ、 メタルプロテアーゼなどを挙げることができ、 これ らの群から選ばれる 1種を単独で用いてもよく、 2種以上を併用してもよい 。 上記チオールプロテアーゼとしては、 植物由来のキモパパイン、 パパイン 、 ブロメライン、 フイシン、 動物由来のカテブシン、 カルシウム依存性プロ テアーゼなどを用いることができる。 セリンプロテアーゼとしては、 トリブ シン、 カテブシンロなどを用いることができる。 酸性プロテアーゼとしては 、 ペプシン、 キモトリプシンなどを用いることができる。 1次酵素処理で用 いる酵素としては、 本発明に係る脳機能調整剤を医薬、 特定保健用食品など に用いることを考慮した場合、 病原性微生物由来の酵素を用いることなく、 それ以外の酵素を用いることが好ましい。
[0036] 1次酵素処理における酵素量としては、 たとえばコラーゲンまたはゼラチ ン 1 0 0質量部に対し上述した酵素を 0 . 1〜 5質量部とすることが好まし い。 1次酵素処理における処理温度は 3 0〜 6 5 °〇とし、 処理時間は 1 0分 〜 7 2時間とすることが好ましい。 上記 1次酵素処理により得られるコラー ゲンべプチド混合物前駆体の重量平均分子量は、 好ましくは 5 0 0〜 1 0 0 〇〇、 より好ましくは 5 0 0〜 5 0 0 0、 さらに好ましくは 5 0 0〜 2 0 0 0である。 重量平均分子量が上述の範囲にあれば、 分子量が適切なペプチド が十分に生成しているといえる。 1次酵素処理の後に、 必要に応じて酵素を 失活させることができる。 この場合の失活温度としては、 たとえば 7 0〜 1 0 0 °〇とすることが好ましい。 コラーゲンべプチド混合物前駆体の重量平均 分子量は、 上述した 3巳〇を用いる方法によって求めることができる。
[0037] 2次酵素処理
2次酵素処理で用いる酵素としては、 アミノぺプチダーゼ1\1活性を有する 酵素、 アミノぺプチダーゼ 活性およびプロリルトリベプチジルアミノぺプ チダーゼ活性を併有する酵素、 またはアミノぺプチダーゼ 活性を有する酵 素およびプロリルトリベプチジルアミノぺプチダーゼ活性を有する酵素の組 合せを挙げることができる。 ここで本明細書において 「アミノぺプチダーゼ N活性を有する酵素」 とは、 ペプチド鎖の N末側からアミノ酸を遊離させる 働きを有するぺプチダーゼであって、 N末側から 2番目にプロリンあるいは ヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合に作用する酵素をいう。 本明細書において 「プロリルトリベプチジルアミノぺプチダーゼ活性を有す る酵素」 とは、 N末側から 3番目がプロリンあるいはヒドロキシプロリンで あるべプチドから、 N末側の 3アミノ酸残基のみを遊離するべプチダーゼを いう。 2次酵素処理で用いる酵素も、 本発明に係る脳機能調整剤を医薬、 特 定保健用食品などに用いることを考慮した場合、 病原性微生物由来の酵素を 用いることなく、 それ以外の酵素を用いることが好ましい。
[0038] アミノぺプチダーゼ N活性を有する酵素としては、 たとえばアミノぺプチ ダーゼ N (EC3. 4. 1 1. 2. ; T.Yoshimoto et al., Agric. Biol . Chem., 52:217-225(1988)) などを挙げることができる。 またたとえば、 A s p e r g i l l u s属由来のアミノぺプチダーゼ N活性を有する酵素を 挙げることができる。 プロリルトリベプチジルアミノぺプチダーゼ活性を有 する酵素としては、 たとえばプロリルトリベプチジルアミノぺプチダーゼ ( E C 3. 4. 1 4. ; A. Banbu la et a 1. , 丄 Biol. Chem. , 274:9246-92
52(1999)) などを挙げることができる。
[0039] 2次酵素処理を実行することにより、 上記コラーゲンべプチド混合物前駆 体に含まれていなかったぺプチドを含むコラーゲンべプチド混合物を得るこ とができる。 具体的には、 上記特定のペプチドを含むコラーゲンペプチド混 合物を得ることができる。
[0040] 2次酵素処理における酵素量としては、 たとえば上記コラーゲンペプチド 混合物前駆体 1 〇〇質量部に対して上述した酵素を〇. 〇 1〜 5質量部とす ることが好ましい。 2次酵素処理における処理温度は 30〜 65°Cとし、 処 理時間は 1〜 72時間とすることが好ましい。 上記 2次酵素処理により得ら れるコラーゲンべプチド混合物の重量平均分子量は、 好ましくは 3 1 5〜 1 0000、 より好ましくは 3 1 5〜 5000、 さらに好ましくは 3 1 5〜 2 〇 2020/175570 12 卩（：171? 2020 /007806
0 0 0である。 コラーゲンペプチド混合物の重量平均分子量も、 上述した 3 巳〇を用いる方法によって求めることができる。
[0041 ] 2次酵素処理は、 上述した特定のペプチドを生成することを主たる目的と して実行される。 このため上記コラーゲンべプチド混合物前駆体に含まれる ぺプチドが過剰に加水分解されてしまわないように、 2次酵素処理における 酵素量、 処理温度、 処理時間および 1~1を調整することが好ましい。 これに よりコラーゲンべプチド混合物を上述した重量平均分子量の範囲内とするこ とが好ましい。 2次酵素処理の後に、 酵素を失活させる必要がある。 この場 合の失活温度としては、 たとえば 7 0〜 1 0 0 °〇とすることが好ましい。 さ らに 1 2 0 °〇で数秒以上の殺菌処理を行うことが好ましい。 また、 これに 2 0 0 °〇以上の熱をかけて噴霧乾燥させることも可能である。
[0042] 2次酵素処理では、 上記アミノぺプチダーゼ1\!活性を有する酵素、 プロリ ルトリベプチジルアミノぺプチダーゼ活性を有する酵素の他に、 異なる活性 を併有する酵素を用いることができ、 かつ異なる活性を有する酵素を 2種以 上併用することもできる。 これにより副生成物を分解し除去することが可能 となる。 この場合において用いる酵素としては、 原料となるコラーゲンの種 類、 1次酵素処理に用いる酵素の種類に応じて適宜選択することが好ましい 。 上述した異なる活性としては、 たとえばプロリダーゼ活性、 ヒドロキシプ ロリダーゼ活性などのジベプチダーゼ活性を挙げることができる。 これによ り副生成物となるジベプチドなどを分解除去することができる。
[0043] さらにアミノぺプチダーゼ1\!活性は、 基本的に 1\!末端側のアミノ酸を 1つ ずつ遊離させる活性である。 このため 1次酵素処理によって得られるコラー ゲンべプチド混合物前駆体に分子量が極めて大きいぺプチドが含まれる場合 、 2次酵素処理をアミノぺプチダーゼ1\1活性を有する酵素のみで実行したと き、 その処理時間が著しく長期化する。 このような場合に対応するため、 2 次酵素処理では、 たとえばプロリンのカルボキシル基側を加水分解する活性 （プロリダーゼ活性） を有するエンドぺプチダーゼであるプロリルオリゴぺ プチダーゼを用いることができる。 これにより 2次酵素処理を効率的に行う 〇 2020/175570 13 卩（：171? 2020 /007806
ことができる。
［0044］ コラーゲンまたはゼラチンを 2段階で酵素処理する方法では、 1次酵素処 理によって比較的分子量の大きなぺプチドを生成することができる。 このべ プチドは、 たとえば ［乂】_〇 I ソー乂2—◦ I リー 1~1 7 一◦ I ソ］ （X】およ び乂2¹ 1~1 7 ） で表されるアミノ酸配列を有することができる。 続く 2次酵 素処理では、 上記 ［乂,一〇 I ソー乂2-〇 1 リー1~1 7 一〇 1 7］ で表される ぺプチドにアミノぺプチダーゼ1\1活性を有する酵素が作用し、 1\1末端の X ,が 遊離することにより ［（3 I ソー乂2 _〇 I
Figure imgf000015_0001
ソ］ で表されるア ミノ酸配列を有するペプチドが得られる。 次に、 上記 ［◦ 丨 ソー乂2 -◦ 丨 リ — 1~1 7 一◦ 丨 ソ］ で表されるペプチドに、 アミノぺプチダーゼ1^活性を有 する酵素が 2度作用し、 グリシンおよび乂2が遊離することにより、 ［◦ I リ _ 1~1 7 _〇 丨 ソ］ で表されるペプチドが得られる。 以上から、 特定のぺプ チドを生成することができる。
［0045］ -コラーゲンべプチド混合物の精製_
上述した 2段階での酵素処理を実行することにより、 特定のぺプチドを含 むコラーゲンべプチド混合物を製造することができる。 上記コラーゲンぺプ チド混合物には、 特定のぺプチド以外のペプチド、 すなわち◦ 丨 リ _ 1~1ソ - 0 I ソで表されるトリペプチド以外のペプチドも含まれているため、 必要 に応じて精製することが好ましい。 この場合の精製方法としては、 従来公知 の方法を用いることができ、 たとえば限外濾過、 サイズ排除クロマトグラフ イー、 イオン交換クロマトグラフイー、 逆相クロマトグラフイー、 アフイニ テイクロマトグラフイーなどの各種液体クロマトグラフイーなどを用いるこ とができる。
［0046］ 具体的には、 コラーゲンべプチド混合物を以下の操作により精製すること ができる。 すなわち上記コラーゲンペプチド混合物の約 2 9 / 1 0 !_をイ オン交換カラム （たとえば商品名 ： 「トヨパール （登録商標） 〇巳八巳一 6 5 0」 、 東ソー株式会社製） に負荷した後、 蒸留水で溶出される第 1ボイ ド ボリューム画分を回収する。 次いで、 第 1ボイ ドボリューム画分を上記イオ 〇 2020/175570 14 卩（：171? 2020 /007806
ン交換カラムとは逆のイオン交換基を有するカラム （たとえば商品名 ： 「卜 ヨバール （登録商標） 3 _ 6 5 0」 、 東ソー株式会社製） に負荷した後、 蒸留水で溶出される第 2ボイ ドボリューム画分を回収する。
［0047］ 次に、 第 2ボイ ドボリューム画分をゲル濾過カラム （たとえば商品名 ： 「 セファデックス 1_ 1~1 - 2 0」 、 ◦巳ヘルスケア ·ジャパン株式会社製） に負 荷し、 3 0質量％メタノール水溶液で溶出することにより、 上記特定のぺプ チドが含まれる画分を回収する。 最後に、 この画分に対して逆相カラム （た とえば商品名 ： 「 巳〇 门 〇1 3 3 11 6 「 6 5 1^ 0 ^ 8 3 0 0 カラム
」 、 ゥォーターズ社製） を装填した高速液体クロマトグラフィー
Figure imgf000016_0001
） を用い、 〇. 1質量％トリフルオロ酢酸を含む 3 2質量％以下のアセトニ トリル水溶液の直線濃度勾配で分画することにより、 特定のぺプチドを高純 度で得ることができる。
［0048］ <脳機能改善剤または脳機能低下予防剤 >
本発明に係る脳機能調整剤は、 脳機能改善剤または脳機能低下予防剤であ ることが好ましい。 脳機能調整剤は、 〇 丨 リー1~1 7 一〇 丨 Vで表されるア ミノ酸配列を含むぺプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体を含有し 、 もって後述する ［評価試験 1］ および ［評価試験 2］ で説明するように、 脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化促進作用を示すこと ができる。 これにより脳機能調整剤は、 脳機能改善効果および脳機能低下予 防効果を奏することができる。 したがって脳機能調整剤は、 脳機能改善剤と して脳機能が低下した患者の治療に用いることができる。 脳機能調整剤は、 脳機能低下予防剤として加齢などによる脳機能の低下を予防する目的で用い ることもできる。
［0049］ 上記脳機能調整剤は、 脳神経細胞の分化促進作用を有することが好ましい 。 さらに脳機能調整剤は、 脳神経細胞の細胞死抑制作用を有することが好ま しい。 脳機能調整剤は、 記憶力または認知機能の改善作用を有することも好 ましい。 脳機能調整剤は、 後述する ［評価試験 1］ および ［評価試験 2］ で 説明するように、 脳神経細胞に直接作用することにより脳神経細胞の分化促 〇 2020/175570 15 卩（：171? 2020 /007806
進作用を示すことができる。 脳機能調整剤は、 後述する ［評価試験 1］ およ び ［評価試験 2］ から、 脳神経細胞の細胞死抑制作用を有することも考慮す ることができる。 これらの作用を通じて脳機能調整剤は、 記憶力または認知 機能の改善作用を奏することができる。
［0050］ 上記脳機能調整剤は、 経口的にまたは非経口的に種々の形態で投与するこ とができる。 その形態としては、 経口的に投与する場合、 たとえば錠剤、 顆 粒剤、 カプセル剤、 粉剤、 液剤、 懸濁製剤、 乳化製剤などの剤型とすること ができる。 さらに上述した剤型の脳機能調整剤を、 飲食品に混合することも できる。
［0051］ 上記脳機能調整剤は、 非経口的に投与する場合、 たとえば脳内への注入、 注射剤、 経皮剤、 坐剤、 点鼻剤および吸入剤などの剤型とすることができる 。 脳機能調整剤の好ましい剤型としては、 錠剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 粉剤 、 脳内へ直接注入するための液剤などを挙げることができる。 脳機能調整剤 は、 たとえば上述した◦ 丨 リー1~1 V 一〇 丨 Vで表されるトリベプチドを含 むが、 このトリペプチドは、 腸管で迅速に吸収されるため、 経口投与による 摂取が可能である。
［0052］ 上記脳機能調整剤の投与量は、 対象者の年齢、 性別、 体重、 感受性差、 投 与方法、 投与間隔、 製剤の種類などによって異なる。 上記脳機能調整剤を経 口投与する場合、 当該投与量は、 たとえば成人 1 日あたり〇. 0 0 0 1〜 2
Figure imgf000017_0001
であることがより好ましい。 上記脳機能調整剤は、 その剤型がたとえば錠剤 である場合、 1錠当たり 0 . 0 0 1〜 8 0質量％で脳機能調整剤が含まれる 錠剤とし、 たとえば粉剤である場合、 〇. 〇〇 1〜 1 〇〇質量％で脳機能調 整剤が含まれる粉剤とすることができる。 上記投与量は、 非経口的に投与す る場合、 その他の形態の製剤によって投与する場合などにおいて、 経口投与 の場合の投与量を参考にして適宜決めることができる。 脳機能調整剤は、 1 日 1〜数回に分けて投与することができ、 あるいは 1〜数日に 1回投与する こともできる。 〇 2020/175570 16 卩（：171? 2020 /007806
[0053] 上記脳機能調整剤は、 本発明の効果に悪影響を及ぼさない範囲で、 他の有 効成分、 製剤用の担体などを適宜含有させることができる。 他の有効成分と して、 たとえばドコサへキサエン酸 （〇1~1八） 、 エイコサペンタエン酸 （巳 八） 、 アスタキサンチン、 イチヨウ葉エキス、 アラキドン酸などを挙げる ことができる。 さらに医薬製剤に製剤化する際に用いる薬学上許容される担 体としては、 希釈剤、 結合剤 （シロップ、 アラビアゴム、 ゼラチン、 ソルビ ッ ト、 トラガカント、 ポリビニルピロリ ドン） 、 賦形剤 （乳糖、 シヨ糖、 コ —ンスターチ、 リン®愛カリウム、 ソルビッ ト、 グリシン） 、 滑沢剤 （ステア リン酸マグネシウム、 タルク、 ポリエチレングリコール、 シリカ） 、 崩壊剤 （バレイシヨデンプン） および湿潤剤 （ラウリル硫酸ナトリウム） などを挙 げることができる。
[0054] <用途発明 >
本発明に係る脳機能調整剤は、 〇 1 リ _ 1~1 7 _〇 1 ソで表されるアミノ 酸配列を含むペプチド、 またはその塩、 もしくはその化学修飾体を含有する 。 脳機能調整剤は、 〇 1 リ _ 1~1 7 _〇 1 ソで表されるアミノ酸配列を含む ペプチド、 たとえば◦ 丨 リー 1~1ソ 一◦ 丨 ソで表されるトリぺプチドの未知 の属性として脳神経細胞の分化促進作用を有し、 もって脳機能改善効果また は脳機能低下予防効果の少なくともいずれかの効果を得ることができる。 換 言すれば本発明は、 脳機能調整用の◦ 丨
Figure imgf000018_0001
丨 Vで表されるアミ ノ酸配列を含むペプチド、 またはその塩、 もしくはその化学修飾体であると いえる。
[0055] [飲食品]
本発明に係る飲食品は、 上記脳機能調整剤を含む。 たとえば脳機能調整剤 に含まれることが好ましい◦ 丨 リー1~1ソ 一◦ 丨 ソで表されるトリペプチド は、 上述のとおり腸管で迅速に吸収されるため、 経口投与による摂取が可能 である。 したがって、 本発明は、 上記脳機能調整剤を含む飲食品として食事 または飲料に混ぜて摂取することができる。 さらに本発明に係る飲食品は、 特定保健用食品、 または機能性表示食品として用いることもできる。 飲食品 に含まれる脳機能調整剤の濃度としては、 0. 001〜 1 00質量％である ことが好ましい。
実施例
[0056] 以下、 実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
[0057] [評価試験 1 :臨床試験]
＜試験食品 （脳機能調整剤を含む飲食品） ＞
試験食品として、 G l u -H y p-G I yで表されるアミノ酸配列を含む コラーゲンペプチド混合物 （商品名 ： 「コラーゲンペプチド C P-B」 、 新 田ゼラチン株式会社製） を用いた。 後述する試験期間中、 被験者に対し 1 日 1回 5 gの上記試験食品を、 任意の飲料に添加することにより摂取させた。 上記飲料の摂取時間については、 特定しなかった。
[0058] ＜試験デザイン＞
試験期間は 201 6年 1 0月 20日から 1 1月 2 1 日までの期間から選ば れる連続した 4週間とした。 オープンラベル介入前後の比較試験を、 京都大 学こころの未来研究センターで実行した。 本試験では世界医師会の 「ヘルシ ンキ宣言」 の主旨の下、 被験者全員に対してインフォームドコンセントを実 施し、 被験者全員から書面による同意を得た。 本試験に対し、 201 5年 9 月 1 8日に京都大学心の先端研究ユニッ ト倫理審査委員会から承認 （承認番 号 ·· 27— P— 1 3） を得た。
[0059] 本試験では、 灰白質量一脳健康管理指数 （GM—BHQ : Gray Matter V 〇 lume— Brai n Healthcare Quotient） スコア、 神経線維の異方性一脳健康 管理指数 （FA— BHQ : Fractional Anisotropy— Brain Healthcare 〇u otient） スコア、 軽度認知障害 （MC I） スコアおよび標準的言語対関連学 習 （S— PA） スコアを得ることにより、 上記試験食品の脳機能に対する作 用効果を評価した。
[0060] ＜被験者＞
本試験では、 49歳から 63歳 （平均 56. 1 ±3. 6歳） の健康な 30 名を被験者とした。 被験者の主な採用基準としては、 「コラーゲン加水分解 物を試験開始以前 1力月間摂取していない者」 、 「ゼラチンを含め、 主な食 物アレルギーの既往歴がない者」 、 「脳梗塞および認知症などの神経疾患、 精神疾患の既往歴のない者」 である。 その他、 「https://www.acrin.org/Por ta ls/0/Protoco ls/6684/ACRIN6684 Amend7 012412 master ForOn l i ne. pdf J の secti〇n6に記載された事項を、 被験者から除外する基準とした。 試験期間 中において、 被験者の自己都合を理由とする 1名の脱落者があった。 さらに 上記 S— PAスコアを得るための試験を、 5名の被験者が自己都合により受 けなかった。 このため S - P Aスコアを得るための試験については 24名、 それ以外の試験については 29名により、 各プロトコールに従って統計解析 を行った。
[0061] <評価方法および評価結果 >
（MR Iスキヤン）
磁気共鳴画像 （MR I） スキャンは、 上記試験食品の摂取開始日の前日 （ 以下、 「介入前」 とも記す） および上記試験食品の摂取終了日の翌日 （摂取 開始日から 29日目、 以下、 「介入後」 とも記す） に実施した。 介入前の M R Iの撮像は、 201 6年 1 0月 20日から 1 0月 24日までの間に実行し 、 介入後の MR 丨の撮像は、 201 6年 1 1月 1 8日から 1 1月 2 1 日まで の間に実行した。 MR 丨の撮像は、 京都大学こころの未来研究センターで実 行した。 具体的な M R 丨スキャンの方法については、 FNemoto K et al. , ”MRI-based Brain Healthcare Quotients: A bridge between neur a l and behavioral ana lyses for keeping the brain healthy", P LoS ONE, 2017, 12（10）: e 0187137 （https://doi.org/10.1371/_journal. pone.0187137） 』 に記載された方法に従った。
[0062] M R I装置は独 S i e m e n s社の 3 Tスキャナー 「Ve r i o」 を使用 し、 32チャンネルヘッ ドアレイコイルを用いて撮像した。 3次元 T 1強調 画像は、 MP- RAGEパルスシーケンスを使用した。 パラメータは次のと おりである。 反復時間 （T R） 1 900m s ; エコー時間 （T E） 2 〇 2020/175570 19 卩（：171? 2020 /007806
. 52 3 ; 反転時間 （丁 I） 900 3 ; フリップ角 9 ° ; マ トリクスサイズ 256 X 256 ; 視野 （ 〇 ） 256〇1〇1 ; スラ イス厚 1
Figure imgf000021_0001
である。 拡散テンソル画像 （口丁 丨） については、 〇[¾八 八を用いたスピンェコー ·ェコープレナーイメージング （3
Figure imgf000021_0002
丨） を用いることにより収集した。 拡散テンソル画像のスライスは、 〇1\/1 I I に平行とした。
[0063] パラメータは次のとおりである。 反復時間 （丁 [¾）
Figure imgf000021_0003
ェコー時間 （丁巳） 81 〇13 ; フリップ角 90° ; マトリクスサイ ズ 1 1 4X 1 1 4 ; 視野 （ 〇 ） 224〇1〇1 ; スライス厚
Figure imgf000021_0004
111である。 ベースライン画像 （6 =〇 3/〇11112） および匕= 1 000
Figure imgf000021_0005
〇12の 30軸の拡散方向の画像を得た。
[0064] 丁 1強調画像から脳機能マッビングツールである 3 1\/11 2を用いて灰白 質を抽出し、 灰白質容積と頭蓋内容積とを用いて全脳の
Figure imgf000021_0006
巳 1~10スコア を算出した。 拡散テンソル画像からソフトウェアである 3 !_ 5. 〇. 1
1 を用いて干 ^ 3^ 〇 I \ 0113 I 3^ 11 I 50 「〇 ソ （ 八） 画像を生 成し、 これに基づいて全脳の 八一巳 1~1〇スコアを算出した。
[0065] ここで
Figure imgf000021_0007
および 八一巳 1~1〇スコアを算出する過程で 行う統計処理に用いたツールは、 医学用統計プログラムである 「3丁八丁 6 丨 丨 丨」 である。 有意性の評価は、 介入前後の群内比較をウィルコ クソンの順位和検定に基づいて行い、 有意水準 （ 値） が〇. 05以下であ る場合に介入前後で有意性ありと判断した。 ◦ IV! _巳 1~10スコアおよび 八 —巳 1~1〇スコアの介入前後の値、 その差、 9 V a \ 〇 & （ 値） を下記表 1 に示す。 表 1中、 「!\!」 が被験者数を意味し、 「巳 336 丨 丨 n
Figure imgf000021_0008
が介入 前を意味し、 「 03 1：」 が介入後を意味し、 「△」 が介入前後の差を示す
[0066] 〇 2020/175570 20 卩（：171? 2020 /007806
[表 1 ]
Figure imgf000022_0006
*ウィルコクソン順位和検定に基づく
[0067] 表 1 によれば、
Figure imgf000022_0001
が見られた。
Figure imgf000022_0002
た。 したがって、 上記試験食品 （脳機能調整剤としての◦ 丨
Figure imgf000022_0003
I Vで表されるトリペプチドを含むコラーゲンペプチド混合物） には、 脳機 能を調整する作用を有することが分かった。
[0068] （IV!〇 I スコア）
認知機能確認スケールである 「あたまの健康チェック （ミレニア株式会社 製） 」 を用いることにより、 軽度認知障害 （1\/1〇 I） スコアを算出した。 具 体的には、 被験者に 1 0個の単語を覚えさせ、 試験とは無関係の解説をはさ んだ後、 上記 1 〇個の単語のうち何個を口頭で回答できるかを測定した。 各 被験者の IV!（3 Iスコアは、 被験者の性別、 年齢、 学習年数、 人種などの情報 を基に、 各被験者の試験結果を同年齢グループと比較し、 人口統計学的に客 観評価することにより校正した。 本試験については、 各被験者に対して IV!
Figure imgf000022_0004
Iスキヤンが行われた日と同日に実施した。
[0069] 八スコア）
標準的言語対関連学習 （3 _ ） スコアは、 ヒトの言語性記憶を把握す る目的で日本高次脳機能障害学会によって開発された。
Figure imgf000022_0005
スコアの具 体的な試験の内容は、 次のとおりである。 まず有関係対語 （意味的に関連の ある単語） 1 0対と、 無関係対語 （意味的関連が希薄な単語） 1 〇対より構 成されたシートが準備される。 次に、 そのシートに記載された 1 0対の有関 係対語を検査者が読み上げ、 被験者に記憶してもらう。 その後、 これらの対 となる単語の一方を提示し、 これと対をなしていた他方の単語を回答させる 。 さらに、 上記シートに記載された 1 0対の無関係対語を検査者が読み上げ 〇 2020/175570 21 卩（：171? 2020 /007806
、 被験者に記憶してもらう。 その後、 これらの対となる単語の一方を提示し 、 これと対をなしていた他方の単語を回答させる。 最後に、 回答の正答数か ら各被験者の 3 _ スコアが算出される。 なお介入前および介入後におい ては、 それぞれ異なる 1 0対の有関係対語および 1 〇対の無関係対語が記載 されたシートが準備される。 本試験についても、 各被験者に対して
Figure imgf000023_0001
丨 ス キャンが行われた日と同日に実施した。
[0070] ここで 1\/1〇 丨 スコアおよび
Figure imgf000023_0002
スコアを算出する過程で行う統計処理 に用いたツールも上記 「3丁八丁 1\/1 3 6 丨 丨 丨 」 とした。 有意性の評価 は、 介入前後の群内比較をウィルコクソンの順位和検定に基づいて行い、 有 意水準 （ 値） が〇. 0 5以下である場合に介入前後で有意性ありと判断し た。 1\/1〇 丨 スコアおよび 3 - 八スコアの介入前後の値、 その差、 9 V a リ 6 （ 値） を下記表 2に示す。 表 2中、 「1\1」 が被験者数を意味し、 「巳 3 3 6 1 丨
Figure imgf000023_0003
が介入前を意味し、 「 〇 3 1：」 が介入後を意味し、 「△ 」 が介入前後の差を示す。
[0071 ] [表 2]
Figure imgf000023_0005
*ウィルコクソン順位和検定に基づく
[0072] 表 2によれば、
Figure imgf000023_0004
スコアおよび 3— 八スコアの両者において介入前 後で有意性のある改善が見られた。 表 2の結果を、 表 1の結果を踏まえて考 察すれば、 上記試験食品は、 脳機能を調整する作用を通じて記憶力または認 知機能の改善作用を有し、 もって脳機能改善効果が得られることが示唆され る。 さらに上述の結果から試験食品は、 脳機能低下予防効果も得られること が示唆される。 このため脳機能調整剤は、 脳機能改善剤または脳機能低下予 防剤として用いることができる。
[0073] （被験者個々人の脳機能に対する脳機能調整剤の作用効果）
被験者個々人における◦ IV!—巳 ! !〇スコアの増減および 八一巳 ! !〇スコ 〇 2020/175570 22 卩（：171? 2020 /007806
アの増減と、 1\/1〇 丨スコアの増減および 3 - 八スコアの増減との相関性の 有無を調べることにより、 被験者個々人の脳機能に対して、 脳機能調整剤が 及ぼす作用効果について検討した。 上記の相関性については、 各測定値を用 いてスピアマンの順位相関係数 （「） を算出し、 介入前後で統計処理を行っ た。 この統計処理に用いたツールも上記 「3丁八丁 1\/1 3 6 丨 丨 丨」 とし た。 「が〇. 2以下である場合を 「相関なし」 と、 「が〇. 2超過〇. 4以 下である場合を 「低い相関あり」 と、 「が〇. 4超過〇. 7以下である場合 を 「相関あり」 と、 「が〇. 7超過 1未満を 「強い相関あり」 と、 「が 1で ある場合を 「完全な相関」 とそれぞれ評価した。 その結果である 「の値を表 3に示す。
[0074] [表 3]
Figure imgf000024_0003
#^<0.05, スピアマン順位相関係数（「）に基づく
[0075] 表 3によれば、
Figure imgf000024_0001
丨スコアの増減との間に 相関が認められ、 八_巳 1~1〇スコアの増減と 3 _ 八スコアの増減との間 に相関が認められた。
[0076] <考察 >
上記によれば、 特定のペプチドを含有する脳機能調整剤は、 被験者個々人 の脳機能に及ぼす作用効果に注目すれば、 _巳 1~1 0スコアが改善するこ とによって 3— 八スコアが改善し、
Figure imgf000024_0002
よって IV! 0 丨スコアが改善することが推定された。 このため脳機能調整剤は 、 脳機能改善剤または脳機能低下予防剤として用いることができる。
[0077] [評価試験 2 :細胞生物学的試験 （ I n V 丨 I 「〇試験） ]
<試料の準備 >
すべての実験動物は、 総理府の 「実験動物の飼育および保管などに関する 基準」 および城西大学生命科学研究センターの 「動物実験に関するガイ ドラ イン」 に従った。 1 5〜 2 5週齢雄性および雌性 丨 3 I 3 「系ラッ トを日 本クレア株式会社から購入することにより準備した。 その後、 上記ラッ トを 湿度 2 3 ± 2 °〇、 相対湿度 5 5 ± 1 0 %、 照明サイクル 1 2時間、 明期 7 : 0 0〜 1 9 : 0 0、 固形試料 （商品名 ： 「〇巳_ 2」 、 日本クレア株式会社 製） および自由飲水の条件の下で飼育するとともに、 同じ条件下で交配させ ることにより生後 7日齢ラッ トを得た。 さらに生後 3〜 8日齢の上記 I 3 1 「系ラッ トを日本クレア株式会社から購入することにより準備した。
[0078] （初代培養小脳顆粒細胞 （〇〇〇 の調製および培養）
上記 丨 3 I 3 「系ラッ トを上述した条件下で生後 7〜 9日齢まで飼育し た後、 これらから小脳を摘出し、 これを表 4に示す各分散溶液 （ I液〜 液 ） を用いた後述の方法により分散することにより、 上記小脳から顆粒細胞お よびその他の脳神経細胞 （以下、 これらの細胞を総称して 「小脳顆粒細胞 （ 〇◦〇 」 とも記す） を含む分散液を得た。 この小脳顆粒細胞 （〇〇〇 は 、 脳神経細胞である。 その後、 当該分散液に含まれる〇 0（3を培養した。 上 記分散溶液の 「溶液名」 、 「含有試薬」 および 「その量」 を表 4に示す。 小 脳顆粒細胞 （0◦〇 の調製方法は、 次のとおりである。
[0079] [表 4]
Figure imgf000025_0001
〇 2020/175570 24 卩（：171? 2020 /007806
[0080] まず、 生後 7〜 9日齢の上記ラッ ト 1 0匹を断頭し、 クリーンベンチ内で 小脳を摘出し、 余分な組織、 血管、 漿膜などを除去した後、 それをカミソリ でミンチ状のぺーストにした。 このべーストに 丨液を添加することにより懸 濁液とし、 この懸濁液を 1 000
Figure imgf000026_0001
で 30秒間遠心することにより上清 と細胞群と含む第 1分離液を得た。 この第 1分離液から上清を除去した後、 残存する細胞群に対し、 あらかじめ恒温槽内で 37°〇に加温しておいた I I 液を少量ずつ加え撹拌し、 これを 50 !_メディウム瓶に移し、 さらに 37 °〇で 1 5分間撹拌することにより I 「 7 3 丨 nによる組織消化を行った。
[0081] 次に、 上記メディウム瓶に 丨 V液を加えて上記
Figure imgf000026_0002
丨 を失活させ 、 さらに 1 000 「 で 30秒間遠心することにより、 上清と細胞群と含 む第 2分離液を得た。 この第 2分離液から上清を除去した後、 残存する細胞 群に対しパスツールピペッ トを用いて少量の丨 丨 丨液を添加することにより 、 これを分散させた。 その後、 1 5分間静置することにより上清と細胞群と 含む第 3分離液を得、 その上清を V液中に採取した。 さらに第 3分離液中に 残存する細胞群に対し少量の丨 丨 丨液を添加することにより、 これを再分散 させた。 その後、 5〜 1 0分間静置することにより上清と細胞群と含む第 4 分離液を得、 その上清を第 3分離液の上清を含む上記 V液に採取した。
[0082] 第 3分離液の上清および第 4分離液の上清を含む上記 V液を、 1 000 「 で 5分間遠心することにより上清と細胞群と含む第 5分離液を得た。 こ の第 5分離液から上清を除去した後、 残存する細胞群に対して基礎培地 （巳 1\/1巳 ： 巳 333 1 1\/16〇1 1 リ 111 巳 9 1 6、 シグマアルドリッチ社製） を添加し、 撹拌することにより、 小脳顆粒細胞 （〇〇〇 および巳1\/1巳を含 む混合液を得た。 その後、 この混合液を〇. 4質量％濃度の 1 V V p a n 巳 I リ 6液で染色し、 染色された細胞数と、 その生存率を計測した。
[0083] 次に、 上記混合液に対し、 生存している細胞の細胞密度が 1. 2X 1 0^0
6 I
Figure imgf000026_0003
となるように
Figure imgf000026_0004
（+） 巳1\/1巳を添加し、 懸濁するこ とにより培養用試料を得た。 この培養用試料を、 あらかじめ 50 9/ 1_ 濃度の 〇 I
Figure imgf000026_0005
（？ !_ !_） でコーティングされた 1 2 ㊀ I I プレートに 0. 766 mLずつ播種し、 37 °C、 5体積％濃度の C〇2と したインキユベーターの環境下で培養した （この日を 「培養〇日目」 とする
[0084] 培養 1 日目に各 we I I に対し、 CGCのみを維持し、 非神経細胞の増殖 を抑制する目的で、 最終濃度が 1 〇MMとなるように c y t o s i n e （3 — D— a r a b i n o f u r a n o s i d e （A r a C） を添加した。 さら に KC I を、 後述する対照試料において最終濃度が 25 mMとなるように添 加し、 それ以外の試料 （後述する表 5〜 7に示すペプチドまたはアミノ酸を 添加した試料） においては、 最終濃度が 1 5 mMとなるように調整して添加 した。
[0085] さらに培養 1 日目および培養 4日目に、 下記表 5〜 7に示すペプチドまた はアミノ酸を、 それぞれ表 5〜 7に示す最終濃度となるように添加すること により各試料を調製した。
[0086] 培養 7日目には、 MTTアッセイ法を用い、 CGCの細胞生存率 （V i a b i I i t y） を計測することにより、 各試料の CGCに対する分化促進作 用の有無を調べた。 具体的には、 KC 丨濃度が 25 mMである対照試料の細 胞生存数に対する各試料の細胞生存数の百分率を求め、 これを統計処理する ことにより、 CGCに対する分化促進作用の有意性を評価した。 この有意性 の評価は、 統計処理としてソフトウェア （商品名 ： 「ェクセル統計 （Ve r 2. 1） 」 、 株式会社社会情報サービス製」 を用い、 S m i r n o v-G r u b b s （両側検定） を実行し、 かつ有意水準 （P値） を 0. 05として棄 却した。 その後、 S t u d e n t’ s t— t e s t （ t検定） を実行する ことにより判断した。 結果を表 5〜表 7示す。 表 5〜 7中 「* （アスタリス ク） 」 が付された試料において、 CGCの分化促進作用を有する （有意性が ある） と判断された。
[0087] ここで表 5中、 「対照 （K+） 」 は、 対照試料を意味する。 「NMDA」 （ 商品名 ： 「M3262」 、 シグマアルドリッチ社製） は、 N-メチルー D- アスパラギン酸を添加した試料を意味し、 「BDN F」 （商品名 ： 「S R P 〇 2020/175570 26 卩（：171? 2020 /007806
3 0 1 4」 、 シグマアルドリッチ社製） は、 脳由来神経栄養因子を添加した 試料を意味する。 「 1\/1 0 」 および 「巳〇 」 は、 脳神経細胞の分化に 関与することが知られ、 いずれも本試験において参考例となる。
［0088］ さらに表 5〜表 7中に表されるペプチドについては、 アミノ酸を一文字で 表記する略号を用いる。 〇は環状 （〇ソ〇 丨 I 〇） を表し、 1~1はヒスチジン を表し、 はプロリンを表し、 ◦はグリシンを表し、 〇はヒドロキシプロリ ンを表し、 巳はグルタミン酸を表し、 八はアラニンを表す。 すなわち表 5中 、 「〇一1~1 ?」 は、 ヒスチジンープロリンからなる環状ジペプチド （株式会 社ピーエイチジャパン製） を添加した試料を、 「〇一〇 」 は、 グリシンー プロリンからなる環状ジペプチド （株式会社ピーエイチジャパン製） を添加 した試料を、 「丁［¾ 1~1」 は、 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン （株式会社ピ —エイチジャパン製） を添加した試料をそれぞれ意味する。 これらは、 脳血 液脳関門を通過することが知られ、 いずれも比較例となる。 表 5中、 「グル タミン酸」 は、 抗酸化作用が知られるグルタミン酸 （商品名 ： 「0 1 2 5 1 」 、 シグマアルドリッチ社製） を添加した試料を意味する。 「グルタチオン 」 は、 ◦ 丨 リー 1~1 7 一◦ 丨 ソ （£ 0 0） に化学構造が類似するグルタチオ ン （商品名 ： 「0 6 0 1 3」 、 シグマアルドリッチ社製） を添加した試料を 意味する。 「〇 〇」 は、 グリシンープロリンーヒドロキシプロリンからな るトリペプチド （株式会社ピーエイチジャパン製） を添加した試料を意味す る。 「グルタミン酸」 、 「グルタチオン」 および 「〇 〇」 は、 いずれも比 較例となる。
［0089］ 表 6中、 「〇一 〇」 は、 プロリンーヒドロキシプロリンからなる環状ジ ペプチド （株式会社ピーエイチジャパン製） を添加した試料を、 「0 -〇◦ 」 は、 ヒドロキシプロリンーグリシンからなる環状ジベプチド （株式会社ピ —エイチジャパン製） を添加した試料を、 「〇一巳〇」 は、 グルタミン酸一 ヒドロキシプロリンからなる環状ジベプチド （株式会社ピーエイチジャパン 製） を添加した試料をそれぞれ意味する。 表 6中、 「 〇」 は、 プロリンー ヒドロキシプロリンからなるジペプチド （商品名 ： 「0— 3 0 2 5」 、 巳八 〇 2020/175570 27 卩（：171? 2020 /007806
〇1~1巳1\/1社製） を添加した試料を、 「〇◦」 は、 ヒドロキシプロリンーグリ シンからなるジペプチド （商品名 ： 「0 - 2 3 6 5」 、 巳八〇1~1巳1\/1社製） を添加した試料を、 「八〇」 は、 アラニンーヒドロキシプロリンからなるジ ペプチド （株式会社ピーエイチジャパン製） を添加した試料をそれぞれ意味 する。 「 〇」 については、 脳血液脳関門を通過することが知られている。
「〇 _ 〇」 、 「〇 _〇◦」 、 「〇 _巳〇」 、 「 〇」 、 「〇◦」 および ！ 八〇」 は、 いずれも比較例となる。
[0090] 表 7中、 「◦ 」 は、 グリシンープロリンからなるジペプチド （商品名 ： 「◦- 3 0 1 5」 、 巳八〇1~1巳 IV!社製） を添加した試料を、 「巳〇」 は、 グ ルタミン酸ーヒドロキシプロリンからなるジペプチド （株式会社ピーエイチ ジャパン製） を添加した試料をそれぞれ意味する。 「〇 」 および 「巳〇」 は、 いずれも比較例となる。 「巳〇〇」 は、 〇 丨 リ _ 1~1 7 _〇 丨 ソで表さ れるトリペプチド （株式会社ピーエイチジャパン製） を添加した試料を意味 し、 本試験において実施例となる。
[0091 ]
\¥0 2020/175570 28 卩(：17 2020 /007806
[表 5]
Figure imgf000030_0001
[0092] \¥0 2020/175570 29 卩(：17 2020 /007806
[表 6]
Figure imgf000031_0001
[0093] [表 7]
Figure imgf000032_0001
[0094] <考察 >
表 5〜 7によれば、 巳〇〇は、 1\/1 0八および巳 0 を添加した参考例 と同様に、 直接〇〇〇に作用することにより、 〇〇〇の分化を促進する作用 を有することが分かった。 表 5〜 7から巳〇〇は、 0 0（3の細胞死を抑制す る作用を有することも示唆された。
[0095] <評価試験 1および評価試験 2から得られる考察 >
上述した評価試験 1および評価試験 2によれば、 本発明に係る脳機能調整 剤およびそれを含む飲食品は、 脳神経細胞に直接作用することにより、 脳神 経細胞の分化を促進することができる。 このような作用により脳機能調整剤 およびそれを含む飲食品は、 記憶力または認知機能の改善作用を奏すること ができる。 もって脳機能調整剤は、 脳機能改善剤または脳機能低下予防剤と して用いることができる。
[0096] [評価試験 3 : 巳〇〇の有効濃度を分析する 丨 n V 丨 I 「〇試験] 培養 1 日目および培養 4日目に巳〇〇を、 表 8に示す最終濃度となるよう 〇 2020/175570 31 卩(：171? 2020 /007806
に添加した以外は、 評価試験 2と同じ方法を用いることにより、 0 0（3に対 して分化促進作用を奏することができる日〇◦の有効濃度を調べた。 結果を 表 8に示す。
[0097] [表 8]
Figure imgf000033_0004
[0098] <考察 >
表 8によれば、 巳〇〇は、 その濃度が 7 1\/1以上である場合、 〇〇〇に対 して分化促進作用を有意に奏することができる。
[0099] [評価試験 4 :経口摂取した日〇〇の脳実質への送達性を分析する評価試 験]
<試料の準備 >
すべての実験動物は、 総理府の 「実験動物の飼育および保管などに関する 基準」 に従った。 8週齢〇1
Figure imgf000033_0001
ソ系雄性マウスを三協ラボサービス株式会社か ら 2匹購入した。 その後、 上記雄性マウスを 1週間順化させて 9週齢雄性マ ウスとした後、 1 2時間絶食させた。 次いで、 上記雄性マウスに対し巳〇〇 （0 I リー1~1 7 一〇 丨 ソ、 株式会社ピーエイチジャパン製、 純度 9 5 %以 上） 2
Figure imgf000033_0002
を、 2 5〇 しの水溶液として強制的に経口投与することによ り、 £ 0 0の脳実質への送達性を分析する雄性マウスを 2匹準備した。
[0100] 上記雄性マウスに対し、 経口投与前 （0時間） 、 経口投与 1時間経過後、
2時間経過後および 4時間経過後の各 1 0分前に麻酔剤を皮下注射した。 上 記麻酔剤は、 三種混合麻酔と呼ばれ、 塩酸メデトミジン〇. 3 9 / 9と
、
Figure imgf000033_0003
酒石酸ブトルファノール4 01 9 / 1< 9とを含 む。 上記麻酔剤を注射した時点から 1 〇分後に、 上記雄性マウスからそれぞ れ脳脊髄液を〇. 5〜 7 し採取し、 尾静脈から血液を 2 0〜 8 0 し採取 〇 2020/175570 32 卩（：171? 2020 /007806
し、 さらに脳実質の一部 （以下、 単に 「脳」 とも記す） を〇. 2 8〜0 . 3 3〇! 9摘出した。
[0101 ] 上記血液に対しては、 まず 4 °〇、 遠心加速度 2 0 4 0 0◦で 1 0分間遠心 分離することにより血漿を得、 これを一時的に一 8 0 °〇で保存した。 次いで 、 上記血漿の液量の 3倍量のエタノールと混合した後、 4 °〇、 遠心加速度 1 0 0 0◦および 1 0分間の条件で遠心分離を行うことにより上清を得た。 そ の後、 上記上清に対して 5
Figure imgf000034_0001
に調製した重炭酸アンモニウムを上記上清 の液量の 4倍量加えて混合した。 さらに上記重炭酸アンモニウムを含む上記 上清を〇. 2 フィルター （ザルトリウス株式会社製） で濾過することに より、 上記雄性マウスの血漿中の巳〇〇量を測定するための各試料 （経口投 与前 （〇時間） 、 経口投与 1時間経過後、 2時間経過後および 4時間経過後 の各試料。 これらを総称して以下、 「試料 3」 とも記す） を得た。
[0102] 上記脳脊髄液に対しては、 上記脳脊髄液の液量の 3倍量のエタノールと混 合した後、 4 °0, 遠心加速度 1 0 0 0 0および 1 0分間の条件で遠心分離を 行った。 その後、 上記遠心分離を行った脳脊髄液に対して 5 0 1\/1に調製し た重炭酸アンモニウムを 5 0 !_加えて混合した。 さらに上記重炭酸アンモ ニウムを含む上記脳脊髄液を〇. 2 フィルター （ザルトリウス株式会社 製） で濾過することにより、 上記雄性マウスの脳脊髄液中の巳〇〇量を測定 するための各試料 （経口投与前 （0時間） 、 経口投与 1時間経過後、 2時間 経過後および 4時間経過後の各試料。 これらを総称して以下、 「試料匕」 と も記す） を得た。
[0103] 上記脳に対しては、
Figure imgf000034_0002
（リン酸緩衝生理食塩水） で洗浄した後、 アル ミホイルで包み、 次いで液体窒素中で凍結後、 冷凍庫 （_ 8 0 °〇 で凍結保 存した。 その後上記脳を解凍し、 上記脳と等量の 巳 3でホモジネートし、 さらに上記脳の重量に対して 3倍量のアセトニトリルと混合した後、 4 °〇、 遠心加速度 1 0 0 0◦および 1 0分間の条件で遠心分離を行うことにより懸 濁液を得た。 次に、 上記懸濁液に対して 5 0
Figure imgf000034_0003
に調製した重炭酸アンモニ ウムを上記懸濁液の液量の 2倍量加えて混合した。 さらに上記重炭酸アンモ ニウムを含む上記懸濁液を 0. 2Mmフィルター （ザルトリウス株式会社製 ） で濾過することにより、 脳中の EOG量を測定するための各試料 （経口投 与前 （〇時間） 、 経口投与 1時間経過後、 2時間経過後および 4時間経過後 の各試料。 これらを総称して以下、 「試料 c」 とも記す） を得た。
[0104] 上記試料 a、 試料 bおよび試料 c中の EOG量を、 後述する条件の LC_ M S / M Sにより定量解析した。 各試料については適宜希釈されているため 、 以下の計算式を用いて補正することにより実際の E〇 G量を求めた。
実際の EOG量 （MM） =分析値 （nM） X希釈換算係数/ 1 000 （単位 換算） 。
[0105] 結果を、 図 1、 図 2および図 3に示す。 図 1は、 雄性マウスに対し EOG を強制的に経口投与した後、 所定時間後の雄性マウスの血漿 （試料 a） 中の EOG量を表すグラフである。 図 2は、 雄性マウスに対し EOGを強制的に 経口投与した後、 所定時間後の雄性マウスの脳脊髄液 （試料 b） 中の E〇G 量を表すグラフである。 図 3は、 雄性マウスに対し EOGを強制的に経口投 与した後、 所定時間後の雄性マウスの脳 （試料 c） 中の EOG量を表すグラ フである。 また図 1〜図 3に示す EOG量は、 2匹の雄性マウスから得られ た平均値である。
[0106] なお、 LC— MS/MSによる定量解析は、 次の条件で実行した。
H P L C装置： ACQU I TY U P LC H-C l a s s B i o （W a t e r s Co r p o r a t i o n#）
カラム： H y p e r s i I GOL D P F P 2. l X l 50mm、 5 n， m （T h e r mo F i s h e r S c i e n t i f i c. I n c製） カラム温度： 40°C （リニアグラジェント）
移動相： （A） 0. 2%ギ酸および 2 mM酢酸アンモニウム含有水溶液
（B） 1 00%メタノール
（グラジェント設定）
T i me （分） 流速 （M L/分） 移動相 （A） の質量％
イニシャル 200 98 3. 50 200 98
3. 5 1 400 5
7. 00 400 5
7. 1 0 200 98
1 7. 00 200 98
注入量： 〇 . 5 丨。
[0107] M S / M S装置： 「Xe v o TQ— XS」 、 Wa t e r s Co r p o r a t i o n社
イオン化法： P o s i t i v e ES I
C a p i l a r y ( k V ) : 1
D e s o l v a t i o n t e m p e r a t u r e (°C) : 500
S o u r c e t e m p e r a t u r e (。〇 : 1 50
M RM条件：
ペプチド (略号) precursor ion (m/z) product ion (m/ z)
G I u -H y p-G I y (EOG) 3 1 8 22
5〇
[0108] <考察 >
図 1〜図 3によれば、 強制的に E〇 Gが経口投与された雄性マウスでは、 E〇Gが血液中に移行し、 次いで脳脊髄液に移行することが理解される。 脳 脊髄液に移行した E0Gは、 経口投与後 1時間程度の短時間で脳組織にも移 行することが理解される。 以上より、 経口摂取した E 0Gは血液を介するこ とにより、 その一部が脳脊髄液を経て脳組織に送達されることが示唆された
[0109] 以上のように本発明の実施の形態および実施例について説明を行なったが 、 上述の各実施の形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初か ら予定している。
[0110] 今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限 \¥0 2020/175570 35 卩（：17 2020 /007806 的なものではないと考えられるべきである。 本発明の範囲は上述した説明で はなくて請求の範囲によって示され、 請求の範囲と均等の意味および範囲内 でのすベての変更が含まれることが意図される。

Claims

\¥0 2020/175570 36 卩（：17 2020 /007806 請求の範囲
[請求項 1 ] 〇 丨 リー1~1 7 一〇 1 Vで表されるアミノ酸配列を含むペプチドま たはその塩、 もしくはその化学修飾体を含有する、 脳機能調整剤。
[請求項 2] 前記ペプチドまたはその塩、 もしくはその化学修飾体は、 〇 1 リー
Figure imgf000038_0001
ソ 一◦ 丨 ソで表されるトリぺプチドまたはその塩、 もしくはその 化学修飾体である、 請求項 1 に記載の脳機能調整剤。
[請求項 3] 前記ペプチドは、 コラーゲン由来である、 請求項 1 または 2に記載 の脳機能調整剤。
[請求項 4] 前記べプチドは、 その重量平均分子量が 3 1 5以上 1 0 0 0 0以下 である、 請求項 1〜 3のいずれかに記載の脳機能調整剤。
[請求項 5] 前記脳機能調整剤は、 脳機能改善剤または脳機能低下予防剤である
、 請求項 1〜 4のいずれかに記載の脳機能調整剤。
[請求項 6] 前記脳機能調整剤は、 脳神経細胞の分化促進作用を有する、 請求項
1〜 5のいずれかに記載の脳機能調整剤。
[請求項 7] 前記脳機能調整剤は、 脳神経細胞の細胞死抑制作用を有する、 請求 項 1〜 6のいずれかに記載の脳機能調整剤。
[請求項 8] 前記脳機能調整剤は、 記憶力または認知機能の改善作用を有する、 請求項 1〜 7のいずれかに記載の脳機能調整剤。
[請求項 9] 請求項 1〜 8のいずれかに記載の脳機能調整剤を含む、 飲食品。
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