CN115125245B - 一种启动子突变体Pα-rpsT及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过对芽孢杆菌来源的启动子‑10区序列定向改造获得了一种强度提高的启动子突变体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供包含该启动子突变体的表达载体、表达***。本发明所述启动子突变体用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域，可以将绿色荧光蛋白GFP异源表达活性提高至178％，介导解淀粉芽胞杆菌表达***中异源蛋白的表达奠定基础。

Description

一种启动子突变体Pα-rpsT及其应用

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种启动子增强突变体Pα-rpsT及其应用。

背景技术

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，在450-490nm的激光下能维持10min中以上的荧光。绿色荧光蛋白的发光现象是由生色团引起的，当GFP折叠后，在有氧的条件下第66位的氨基酸残基脱氢，从而使生色团环化形成对羟基苯甲基-5-咪唑啉酮(p-HBI)，该过程在有氧条件下自发形成，在激发光488nm条件下能够发出绿色荧光。

作为报告基因的GFP其灵敏度很高，对目的基因结构功能没有影响，同时，它可以在特定波长下能够自己产生较强的荧光。可以通过GFP的荧光强度从而知道表达元件的强度。实现表达元件的高通量筛选。为在解淀粉芽孢杆菌中实现表达元件高通量筛选提供了一个新方法。

解淀粉芽孢杆菌是一种***，作为微生物细胞工厂，因其出色的胞外蛋白分泌能力和公认的安全菌株而备受青睐，它不仅是多种酶制剂的生产者，还能产生多种抗菌物质，广泛应用于农业、工业食品和医药等行业中，是原核表达***中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达***中的一种重要的模式菌株。

使用强启动子是实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一，启动子(promoter)是一段RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA Pol)识别、结合和起始转录的特定DNA序列。细菌启动子是与RNA聚合酶结合的靶序列，是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过对启动子的关键区域的突变，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子是构建各种表达***、实现异源基因表达的基础，因此，筛选获取强启动子是介导外源蛋白基因的表达并且提高其产量十分有效的方法。

发明内容

针对当前产业需求和现有技术的不足，本发明主要目的是提供一种实现目的基因高效表达的启动子增强突变体及基因工程菌表达***。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种启动子突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供包含所述启动子突变体的表达载体。

第三方面，本发明提供包含如上所述启动子突变体或表达载体的表达***。

第四方面，本发明提供如上所述启动子突变体的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。

有益效果：

本发明通过对芽孢杆菌来源的启动子分析改造获得了一种强度提高的启动子突变体，该启动子突变体适用于解淀粉芽孢杆菌表达***，可以高效异源表达绿色荧光蛋白GFP，并将GFP表达活性提高至178％，介导解淀粉芽孢杆菌表达***中异源蛋白的表达奠定基础，推动绿色荧光蛋白的高效表达以及工业化生产。本发明的启动子突变体用于提高其它外源蛋白基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达也具有较好的效果。

附图说明

图1：重组载体各片段回收验证图；其中，M：marker，1：ply-2，2：Pα-rpsT。

图2：重组菌绿色荧光蛋白GFP基因的表达活性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

第一方面，本发明提供一种启动子突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供包含所述启动子突变体的表达载体。所述表达载体的骨架可以是任何本领域已知的枯草芽孢杆菌的表达载体。

根据本发明一种优选的实施方式，所述表达载体是pWB980。

第三方面，本发明提供包含如上所述启动子突变体或表达载体的表达***。所述表达***可以是适合于本发明的启动子突变体或表达载体的任何宿主，例如解淀粉芽孢杆菌。

根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主是解淀粉芽孢杆菌基因工程菌△6△eps△pgs△3049-3052(该基因工程菌是以CGMCC No.11218出发敲除六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和噬菌体相关基因3049-3052获得，具体可参见专利申请202111182462.6)。

第四方面，本发明提供如上所述启动子突变体的用途，其用于控制基因表达，尤其应用于解淀粉芽孢杆菌代谢工程领域。

根据本发明一种优选的实施方式，所述启动子突变体用于控制绿色荧光蛋白(GFP)基因在解淀粉芽孢杆菌***中的表达，

以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：

本发明所用培养基：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

解淀粉芽孢杆菌感受态溶液制备：

LBS：山梨醇91.085g/L；氯化钠10g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；

洗涤缓冲液：山梨醇91.085g/L；甘露醇91.085g/L；10％甘油100ml；

重悬缓冲液：山梨醇91.085g/L；甘露醇91.085g/L；10％甘油100mL；14％PEG 6000140g/L。

实施例1：一种新型启动子突变体及其质粒的构建

将来源于枯草芽孢杆菌的a-淀粉酶基因的启动子ply-2(核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示)通过启动子预测分析软件iProEP、Softberry等进行分析，发现其具有两个-10区域和两个-35区域，对其第一个-10区序列(TCTTATATT)进行了多点突变(TGATAGAAT)，获得一个新型的启动子突变体命名为Pα-rpsT，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的启动子序列由生物公司合成，合成的时候带有酶切位点EcoRI和HindIII。

表达载体的酶切以及与目的基因的连接如下：

1)提取含有突变启动子的载体质粒Pα-rpsT-PUC57，和载体pWB980的质粒，然后根据所需要的限制性内切酶(EcoRI、HindIII.)双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；

2)对酶切目标片段Pα-rpsT和pWB980载体片段进行胶回收纯化；

3)将回收好的目的片段Pα-rpsT和pWB980载体片段连接，连接条件，16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：

Pα-rpsT片段 4.5μL

pWB980载体片段 0.5μL

将连接产物化转到枯草芽孢杆菌WB600中，方法如下；

1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；

2)取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期OD600＝1.2(约3–4h)；

3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；

4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL 10mmol/L EGTA，37℃，100r/min培养10min；

5)SPII加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；

6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证(如图1所示)。

实施例2：绿色荧光蛋白基因工程菌

以绿色荧光蛋白基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，GenBank:MN443913.1)为报告基因，由生物公司合成，载体为PUC57，合成的基因序列带有HindIII和BamHI酶切位点。

将绿色荧光蛋白基因和含有突变的启动子的Pα-rpsT-pWB980载体进行酶切连接，构建含有启动子Pα-rpsT和GFP基因表达盒的重组表达载体，并且化转到枯草芽孢杆菌WB600中；提取质粒，再将重组质粒通过电转的方式转入一株解淀粉芽孢杆菌基因工程菌△6△eps△pgs△3049-3052中(该基因工程菌是以CGMCC No.11218出发敲除六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和噬菌体相关基因3049-3052获得，具体可参见专利申请202111182462.6)，得到异源表达碱性蛋白酶的重组菌株。

含有突变启动子Pα-rpsT-pWB980表达载体与目的基因GFP的连接：

1)分别提取含有启动子组合Pα-rpsT-pWB980、GFP的质粒，然后根据所需要的限制性内切酶(HindIII、BamHI)双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；酶切体系如下：

2)对酶切片段进行胶回收纯化；

3)将回收好的GFP片段和Pα-rpsT-pWB980片段连接，连接条件，16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：

GFP片段 4.5μL

线性Pα-rpsT-pWB980片段 0.5μL

Solution I 5.0μL。

将连接产物化转到枯草芽孢杆菌WB600中，方法如下；

1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌WB600单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；

2)取100μL培养液转接至5mL SPI培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期OD600＝1.2(约3–4h)；

3)取200μL生长至对数期末的培养液至2mL SPII培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；

4)在上述SPII培养基的菌体中加入20μL 10mmol/L EGTA，37℃，100r/min培养10min；

5)SPII加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；

6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

提取在WB600中的重组质粒，电转到解淀粉芽孢杆菌△6△eps△pgs△3049-3052中，电转方法如下：

1)75％酒精清洗电转杯，在紫外下照射20min以上，并在冰上预冷；

2)将100μL感受态和10ng质粒DNA混合加入电转杯，冰上放置2min；

3)2500V电击，电击时间一般为4-6ms；

4)电击后立即加入1ml复苏培养基，37℃，复苏3h。涂板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

同时，以启动子ply-2构建上述相同表达***的重组菌作为对照菌，两者区别仅在于碱性蛋白酶基因的启动子不同。

实施例3：绿色荧光蛋白基因的表达及分析

将新鲜平板上的重组基因工程菌的单菌落分别接入50mL卡那霉素抗性LB种子培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，以相同的接种量转接于含有卡那霉素抗性的LB发酵培养基中，于37℃、220rpm发酵培养。

分别取各重组菌发酵培养12h、24h、36h、48h、60h、72h的发酵液，使用酶标仪在激发波488nm、发射波523nm的波长下测其吸光度值，以时间为横坐标，以OD为纵坐标绘制荧光曲线(如图2所示)。

经过测定，60h时各重组菌发酵液中的绿色荧光蛋白活力均达到最高。由启动子突变体Pa-rpsT所构建的重组菌表达绿色荧光蛋白的荧光值为17654，是由原启动子ply-2所构建的重组菌表达荧光活性的178％。可见本发明提供了一种强度显著提高的启动子突变体，并利用其实现了绿色荧光蛋白高效的异源表达。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种启动子突变体Pα-rpsT及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 596

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cattatgttt gaatttccgt ttaaagaatg ggctgcaagc cttgtgtttt tgttcatcat 60

tatgatagaa tactgcatca gggctgcggc atccggaatg ctcatgccga gaatagacac 120

caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata gaatcaattg cggtcgcctt 180

tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc catacattct tcgcttggct 240

gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg tttctgcttc ggtatgtgat 300

tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata aaaaagaaat catctttttt 360

gtttggaaag cgagggaagc gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat 420

ttgtattcac tctgccaagt tgttttgata gagtgattgt gataatttta aatgtaagcg 480

ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaaga 596

<210> 2

<211> 596

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 2

cattatgttt gaatttccgt ttaaagaatg ggctgcaagc cttgtgtttt tgttcatcat 60

tatcttatat tactgcatca gggctgcggc atccggaatg ctcatgccga gaatagacac 120

caaagaagaa ctgcaaaaac gggtgaagca gcagcgaata gaatcaattg cggtcgcctt 180

tgcggtagtg gtgcttacga tgtacgacag ggggattccc catacattct tcgcttggct 240

gaaaatgatt cttcttttta tcgtctgcgg cggcgttctg tttctgcttc ggtatgtgat 300

tgtgaagctg gcttacagaa gagcggtaaa agaagaaata aaaaagaaat catctttttt 360

gtttggaaag cgagggaagc gttcacagtt tcgggcagct ttttttatag gaacattgat 420

ttgtattcac tctgccaagt tgttttgata gagtgattgt gataatttta aatgtaagcg 480

ttaacaaaat tctccagtct tcacatcggt ttgaaaggag gaagcggaag aatgaagtaa 540

gagggatttt tgactccgaa gtaagtcttc aaaaaatcaa ataaggagtg tcaaga 596

<210> 3

<211> 712

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 60

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 120

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 180

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 240

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 300

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 360

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 420

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 480

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 540

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 600

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 660

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt ag 712

Claims (6)

1.一种启动子突变体，其特征在于，所述启动子突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述启动子突变体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架是pWB980。

4.一种表达***，其特征在于，包含权利要求1所述启动子突变体或权利要求3所述表达载体。

5.如权利要求4所述的表达***，其特征在于，所述表达***的宿主是解淀粉芽孢杆菌。

6.如权利要求5所述的表达***，其特征在于，所述表达***还包含核苷酸序列如SEQID NO：3所示的绿色荧光蛋白基因，由所述启动子突变体控制。