CN113061582A - 一种噬菌体组合物、抑菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种噬菌体组合物、抑菌剂及其应用，属于生物工程技术领域。本发明所述噬菌体组合物，包括产气荚膜梭菌噬菌体CCTCCNO:M2020047、沙门氏菌噬菌体CCTCCNO:M2020710、大肠杆菌噬菌体CCTCCNO:M2020711和福氏志贺氏菌噬菌体CCTCCNO:M209029。本发明的噬菌体组合物对产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌均具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌，通过抑制产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生，为防控动物因产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌引发的动物肠道疾病提供了一种安全、无毒副作用的噬菌体抑菌产品来源。

Description

一种噬菌体组合物、抑菌剂及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种噬菌体组合物、包括噬菌体组合物的抑菌剂及其应用。
背景技术
肠道菌群是由数百种微生物组成的复杂群体，微生物间的相互作用，以及由微生物产生的代谢产物对宿主健康起作用，具有免疫调节、营养消化的功能。然而，在肠道菌群里存在许多致病菌，如产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌，会在鸡肠道中定植，过度生长引起肠道菌群失调导致全身感染，严重影响生产性能，甚至引发死亡，给养殖业带来巨大损失。此外，由于饲料中抗生素等促生剂的过量使用，已引发肠道致病菌的普遍耐药，从而给养殖业带来安全隐患。
噬菌体因其靶向抗菌不影响正常菌群以及不易产生耐药性等优势，是目前有效抑制耐药致病菌的优选，噬菌体作为有效对抗耐药菌的新型生物源材料已引起众多研究人员及药物开发企业的关注。迄今，还没有关于利用产气荚膜梭菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、福氏志贺氏菌噬菌体的组合物抑制产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌的记载和报道，而且现有抗菌技术不能有效防控动物肠道疾病发生。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够有效防控动物肠道疾病发生的噬菌体组合物、包括噬菌体组合物的抑菌剂。本发明提供的噬菌体组合物对产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌均具有强裂解作用，能够抑制产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种噬菌体组合物，包括：产气荚膜梭菌噬菌体CCTCC NO:M2020047、沙门氏菌噬菌体CCTCC NO:M 2020710、大肠杆菌噬菌体CCTCC NO:M 2020711和福氏志贺氏菌噬菌体CCTCC NO:M 209029。
优选的，上述噬菌体组合物中各噬菌体的效价分别单独地为105～109pfu/ml。
本发明还提供了一种抑菌剂，包括上述噬菌体组合物和/或上述噬菌体组合物的培养物。
优选的，所述噬菌体组合物的培养物按照如下步骤制备所得：将上述噬菌体分别与气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌对应单独培养，获得相应噬菌体的培养物，按比例混合即得。
优选的，所述产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌的浓度分别单独为1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml。
优选的，所述抑菌剂还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述药学上可接受的辅料包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或几种。
本发明还提供了一种上述噬菌体组合物和/或上述抑菌剂在制备抑制和/或清除产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和/或福氏志贺氏菌的制剂中的应用。
本发明还提供了一种上述噬菌体组合物和/或上述抑菌剂在制备防治动物肠道疾病的药物中的应用。
优选的，所述动物包括鸡、鸭或猪。
本发明的有益效果：本发明提供的噬菌体组合物对产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌均具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌。本发明提供的噬菌体组合物能够通过抑制产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生，为防控动物因产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌引发的动物肠道疾病提供了一种安全、无毒副作用的噬菌体抑菌产品来源。
生物保藏信息：
本发明所述产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage)vB_CpeS_JS01，于2020年1月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020047；
本发明所述沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage)vB_SaeM_S302，于2020年11月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:M 2020710；
本发明所述大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)vB_EcaS_E0503，于2020年11月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020711；
本发明所述福氏志贺氏菌噬菌体(Shigellaflexneri phage)Sh72，于2009年2月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:M 209029。
附图说明
图1为双层平板检测纯化噬菌体结果，其中A为产气荚膜梭菌噬菌体，B为沙门氏菌噬菌体，C为大肠杆菌噬菌体，D为福氏志贺氏菌噬菌体；
图2为噬菌体组合物的裂解效果。
具体实施方式
本发明提供了一种噬菌体组合物，包括：产气荚膜梭菌噬菌体CCTCC NO:M2020047、沙门氏菌噬菌体CCTCC NO:M 2020710、大肠杆菌噬菌体CCTCC NO:M 2020711和福氏志贺氏菌噬菌体CCTCC NO:M 209029。
本发明的产气荚膜梭菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体和福氏志贺氏菌噬菌体均来源于禽养殖场粪样，且均已保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明的噬菌体组合物对产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌均具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和/或福氏志贺氏菌。本发明的噬菌体组合物能够通过抑制产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和/或福氏志贺氏菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生。本发明对于噬菌体组合物中各噬菌体的用量没有特殊限定。在本发明中，所述噬菌体组合物中各噬菌体的效价分别单独地优选为105～109pfu/ml，更优选为106～108pfu/ml。
本发明还提供了一种抑菌剂，包括上述噬菌体组合物和/或上述噬菌体组合物的培养物。
在本发明中，所述抑菌剂优选的还包括药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料优选的包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或几种。
在本发明中，所述噬菌体组合物的培养物优选的按照如下步骤制备所得：将上述噬菌体分别与气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌对应单独培养，获得相应噬菌体的培养物，按比例混合即得。具体的，首先分别获取产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌培养物，分别离心收集沉淀，然后利用TY培养基重悬产气荚膜梭菌沉淀，利用LB培养基分别重悬沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌沉淀，再分别加入上述相应噬菌体，培养获得相应噬菌体的培养物，按比例混合即得所述噬菌体组合物的培养物。
本发明对于离心的具体方式没有特殊限定，采用本领域常规离心方式均可。在本发明中，所述产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌培养物浓度优选的分别单独地为1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml，更优选的分别单独地为2×108cfu/ml～1×109cfu/ml。加入相应噬菌体后，所述培养温度优选为35～38℃，更优选为36～37℃，所述培养时间优选为5～9h，更优选为6～8h。按照本发明所记载的培养条件培养后，优选的还需离心，取上清液过滤，即可获得相应噬菌体的培养物，所述过滤优选为滤膜过滤，所述滤膜的孔径优选为0.22μm。本发明对于噬菌体组合物的培养物中各噬菌体的培养物的用量没有特殊限定，视具体情况而定。
本发明还提供了一种上述噬菌体组合物和/或上述抑菌剂在制备抑制和/或清除产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和/或志贺氏菌的制剂中的应用。
本发明对于制剂的剂型没有特殊限定，可为注射剂型、散剂、片剂等。
本发明还提供了一种上述噬菌体组合物和/或上述抑菌剂在制备防治动物肠道疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述药物中各噬菌体的效价分别单独地为105～109pfu/ml。本发明对于动物的种类没有特殊限定，优选的包括鸡、鸭或猪。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
噬菌体的分离制备及纯化
1、噬菌体分离
在将采自禽养殖场的粪样中加入蛋白胨溶液，室温震荡2～4h，取上清5000×g·min-1离心30min，用0.22μm滤膜过滤上清。
取1ml上清加入50ml TY培养基中，再加入1mlATCC 13124产气荚膜梭菌菌株的过夜培养物(TY过夜培养)，其中ATCC 13124产气荚膜梭菌菌株的过夜培养物中产气荚膜梭菌的浓度为1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml。
分别取1ml上清加入50ml LB培养基中，再分别加入1ml沙门氏菌ATCC 13076、禽大肠杆菌E-0503(分离自河南郑州一家鸡养殖场)和福氏志贺氏菌CMCC 51572的过夜培养物，其中沙门氏菌ATCC 13076、禽大肠杆菌E-0503和福氏志贺氏菌CMCC 51572的过夜培养物中相应菌体的浓度为1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml。
将上述四组样品分别混匀，37℃，150rpm震荡培养过夜，次日分别取上述培养物以10000×g·min-1，4℃，离心30min，取上清，再用0.22μm滤膜过滤上清，分别获得四种噬菌体原液。
分别取2ml过夜培养菌液，其中产气荚膜梭菌涂布于20ml TY琼脂平板，沙门氏菌、禽大肠杆菌和福氏志贺氏菌涂布于LB平板，待吸收后吸取相应的噬菌体原液0.01ml滴于平板表面；待自然晾干后，产气荚膜梭菌平板置于37℃厌氧培养16～18h，沙门氏菌、禽大肠杆菌和福氏志贺氏菌平板置于37℃培养16～18h，观察点样区域变化情况，在点校区域形成透明圈样品则初步判定为阳性结果。
取阳性噬菌体原液0.1ml，进行10倍倍比稀释，取102～106稀释液各0.1ml分别与过夜培养的相应宿主菌液0.1ml混匀，产气荚膜梭菌噬菌体加入约5ml0.6％TY琼脂培养基，沙门氏菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体和福氏志贺氏菌噬菌体加入约5ml 0.6％LB琼脂培养基，分别混匀后分别迅速倾倒入TY和LB平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，产气荚膜梭菌平板置于37℃厌氧培养，沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌平板均置于37℃恒温培养，培养18～20h后，观察噬菌斑形成情况，以出现圆形透明斑为阳性结果。
2、噬菌体纯化
分别取2ml上述4种菌的过夜培养物，离心，其中产气荚膜梭菌用1ml TY培养基重悬，加0.1ml上述产气荚膜梭菌噬菌体原液[以MOI(感染复数)分别1:10和1:100的比例]，加入100ml TY培养基，37℃震摇培养6～8h；沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌分别用1mlLB培养基重悬，分别加0.1ml上述沙门氏菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体和福氏志贺氏菌噬菌体原液[以MOI(感染复数)分别1:10和1:100的比例]，加入100ml LB培养基，37℃震摇培养6～8h。然后取上述4种培养物13000×g.min-1、4℃离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体裂解液。
分别加RNaseA和DNaseⅠ至噬菌体裂解液，终浓度1μg/ml，37℃孵育30min；加9.3gPEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h；4℃、10000×g.min-1离心30min，去上清；加5mlSM溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用30min；加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，振荡30s；4℃，3000×g.min-1离心15min，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(如图1所示)。
实施例2
噬菌体体外裂解效果
将分别过夜培养的产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌菌液按1：1：1：1浓度比例混合，混合菌体的终浓度约为109cfu/ml，离心去培养基，用0.85％生理盐水调整为OD600约为0.5。将4种噬菌体也按1：1：1：1效价比混合后，混合噬菌体的终浓度约为1010pfu/ml，加入上述混合菌液中(MOI分别为0.1和1)，37℃培养，同时设立细菌对照组，即菌液中不加噬菌体组合物；分别在0h，2h，4h，6h，8h，10h后分别取0.2ml检测OD600值，比较加入噬菌体组合物后的OD600变化。
结果如图2所示，MOI 0.1和1组别中起始OD600值分别0.51和0.52。作用2h后，与对照组相比较，加入噬菌体组合物中OD600值发生明显变化，作用4h后，与对照相比较，MOI 0.1组中OD600降至0.26，MOI 1组中降至0.18，8h后，分别降至0.09和0.07；10h后，对照组OD600值约为0.54，而噬菌体组合物中，MOI 0.1组和MOI 1组中OD600值分别为0.067和0.043，且肉眼可观察到菌悬液完全澄清。由此可见，噬菌体组合物对产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌均具有显著的裂解作用，不同作用浓度均能够有效抑制产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌4种菌的生长。
实施例3
噬菌体组合物在禽养殖中的抑菌效果
选取1日龄雏鸡40只，随机分为4组，每组10只。其中A组为对照组正常饲喂，B组正常饲喂同时用噬菌体组合物灌服，约为1×108pfu/0.1ml/只，连续灌服7天，C组正常饲喂同时添加氨苄青霉素饮水(0.1％W/V)，连续饮水7天灌服，D组为空白对照组。第14～21天对B组和C组分别饲喂噬菌体组合物和氨苄青霉素；分别对A，B，C组在第22天应用产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌组合物(约108～109cfu/0.1ml/只，比例为10:1:1:1)进行感染，第25天分别对鸡进行称重、取肠道分析坏死性肠炎发生状况进行评分(0为正常小肠，1为肠道轻度黏液覆盖，2为严重坏死性肠炎)、统计总死亡率，结果参见表1和表2。
表1噬菌体对鸡生长性能影响
Figure BDA0002996264020000071
由表1可以看出，B组噬菌体组合物处理组中肠道评分和死亡率均低于A组，且肠道无显著病理损伤。饲喂噬菌体组中，无死亡且肠道评分与C组相当，无显著病理损伤，与D组空白组相比较无显著性差异，表明噬菌体以1×109pfu/0.1ml/只剂量应用于邹鸡无显著副作用，具有安全无毒副作用的特性。养殖25天中空白对照组死亡1只，噬菌体组合对照组中均存活。混合菌感染A组和B组后，A组死亡4只，B组噬菌体组合物处理组中无死亡，均存活。由此可见，雏鸡应用噬菌体组合物能够显著抑制肠道致病菌生长，在进行混合菌感染后仍能够有效的预防肠道损伤，减少肠炎的发生，从而降低死亡率，减少疾病的发生。
表2噬菌体对雏鸡增重效果
Figure BDA0002996264020000081
由表2可以看出，通过应用噬菌体组合在14天及21天的雏鸡增重高于空白对照组。
实施例4
噬菌体组合物安全性实验
6～8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g±2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组，各10只；其中一组口服噬菌体组合物约为109pfu/0.1ml/只；对照组口服等体积0.85％生理盐水。连续口服21天，脱颈致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。
结果显示，此剂量的噬菌体组合物对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物包括：产气荚膜梭菌噬菌体CCTCCNO:M2020047、沙门氏菌噬菌体CCTCC NO:M 2020710、大肠杆菌噬菌体CCTCCNO:M 2020711和福氏志贺氏菌噬菌体CCTCC NO:M 209029。
2.根据权利要求1所述噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体组合物中各噬菌体的效价分别单独为105～109pfu/ml。
3.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包括权利要求1所述噬菌体组合物和/或权利要求1所述噬菌体组合物的培养物。
4.根据权利要求3所述抑菌剂，其特征在于，所述噬菌体组合物的培养物按照如下步骤制备所得：将权利要求1所述噬菌体分别与气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌对应单独培养，获得相应噬菌体的培养物，按比例混合即得。
5.根据权利要求4所述抑菌剂，其特征在于，所述产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和福氏志贺氏菌的浓度分别单独地为1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml。
6.根据权利要求3～5任意一项所述抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂还包括药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述抑菌剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或几种。
8.权利要求1～2任意一项所述噬菌体组合物和/或权利要求3～7任意一项所述抑菌剂在制备抑制和/或清除产气荚膜梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌和/或福氏志贺氏菌的制剂中的应用。
9.权利要求1～2任意一项所述噬菌体组合物和/或权利要求3～7任意一项所述抑菌剂在制备防治动物肠道疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述动物包括鸡、鸭或猪。
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