CN111057681B - 一株噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明从养殖场环境中分离得到一株噬菌体Phage‑HY19，对引起动物腹泻的主要病原ETEC‑K88ac具有宿主范围广的特点，且所述的噬菌体制品是无毒的，可以安全地用于动物腹泻的预防和治疗中，采用噬菌体特异性裂解ETEC‑K88ac，能够避免抗生素使用中所导致的ETEC‑K88ac进化和耐药毒株的产生，还可以用于对养殖环境进行消杀以及用于食品保鲜。

Description

一株噬菌体及其应用
技术领域：
本发明涉及一株噬菌体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌所引起的急性肠道传染病，致病性大肠杆菌是引起动物腹泻临床中常见的病原，严重危害动物健康。近年来，对于大肠杆菌病的临床治疗工作中使用抗生素方面往往不谨慎不合理，使得大肠杆菌具有耐药性且耐药现象越来越严重，使大肠杆菌病的防治越来越难。随着多重耐药菌株的层出不穷以及耐药性转移等弊端的出现，寻找有效、绿色、安全、无公害的抗菌或抑菌制剂替代抗生素控制致病性大肠杆菌势在必行。噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解。噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时十分有效，且杀死细菌的机制与抗生素不同，不易产生耐药性和残留，十分适合成为理想的新型抗菌剂，此外，噬菌体制剂特异性强、潜伏期短、吸附率高等优点。因此，用噬菌体来治疗感染是一个很有前途的抗感染治疗新途径。
近年来噬菌体制剂的研究受到普遍关注，例如发明专利ZL200910029306.9涉及江苏省农科院研发的一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株，该菌株对福氏志贺氏菌有强的裂解作用；发明专利ZL2009102632950同样由江苏省农科院分离得到一种产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体EK99-C，用于幼畜腹泻治疗、细菌感染以及环境净化消毒方面的应用；发明专利ZL201510226544.4涉及由韩国尹特荣生物科技株式会社分离得到的对大肠杆菌具有广泛抗菌活性的噬菌体即噬菌体EK88P-1为有效成份包含的组合物及利用该组合物防止及处理大肠杆菌感染的方法。然而，现在对于致病性大肠杆菌具有裂解作用的噬菌体及相关的噬菌体制剂产品并不丰富，难以满足市场需求。
发明内容：
针对上述问题，本发明旨在提供致病性大肠杆菌噬菌体，其可以有效裂解产肠毒素型大肠杆菌K88ac，并进一步将其加工成噬菌体制剂，用于制备防治产肠毒素型大肠杆菌所导致的腹泻的药物，特别是由产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac所导致的仔猪腹泻，以及作为杀菌剂对于养殖环境进行净化，或者作为鲜肉保鲜剂，用于杀灭产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac。
为解决以上技术问题，丰富噬菌体制剂的种类，本发明采用如下技术方案。
一株噬菌体，命名为Phage-HY19，分类命名：T4-like 噬菌体T-evens 亚群，所述噬菌体已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17584。
所述噬菌体对于产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac具有强的裂解作用。
本发明还请求保护所述噬菌体在制备防治产肠毒素型大肠杆菌所导致的腹泻的药物中的应用。
优选的，所述腹泻是由产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac感染所导致的仔猪腹泻。
本发明还请求保护所述噬菌体在净化养殖环境中的应用。
优选的，所述应用是将包含噬菌体Phage-HY19的培养液或制剂喷洒在待净化的养殖环境的表面。
本发明还请求保护所述噬菌体Phage-HY19在制备食品保鲜剂中的应用，用于杀灭食品表面的产肠毒素型大肠杆菌。
优选的，所述食品是鲜肉或水果，优选为猪鲜肉。
优选的，所述产肠毒素型大肠杆菌是产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明从养殖场环境中分离得到一株对于ETEC-K88ac具有强裂解作用的噬菌体Phage-HY19，对引起动物腹泻的主要病原 ETEC-K88ac具有宿主范围广的特点，且所述的噬菌体制品是无毒的，可以安全地用于动物腹泻的预防和治疗中，由于采用噬菌体特异性裂解ETEC-K88ac，能够避免抗生素使用中所导致的ETEC-K88ac进化和耐药毒株的产生，还可以用于对养殖环境进行消杀以及用于食品保鲜。
附图说明
图1：Phage-HY19噬菌斑图，A，接种后12h；B，接种后24h；C，接种后48h。
图2：噬菌体最佳感染复数（MOI）的测定结果图。
图3：Phage-HY19噬菌体温度敏感性测定结果图。
图4：Phage-HY19噬菌体体外杀菌活性，其中：组1，E.coli-HuNHY19+ Phage-HY19；组2，E.coli-HuNHY19+ PBS；组3：CVCC1524+ Phage-HY19；组4：CVCC1524+ PBS。
具体实施方式
实施例1：产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac噬菌体的分离及纯化
1. 噬菌体的分离：
2016年7月在衡阳市郊某中型养殖场，在2个月内连续出现多栏仔猪发生严重腹泻，且经抗生素治疗未能控制病情，死亡率高达20%，经分离得到一株强毒性的产肠毒素型大肠杆菌E.coli-HuNHY19，于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17622，分类命名：大肠埃希氏菌（ Escherichia coli）。经分型鉴定，E.coli-HuNHY19为O8： K91，K88ac，表明主要流行的致病性大肠杆菌为产肠毒素型大肠杆菌K88ac。
对此，进一步在该猪场的污水处理***排放口采集污水样品，用纱布过滤除去大颗粒杂质，而后12000×g离心10分钟后取上清液用0.22μm孔径的无菌滤器过滤，将滤液置于4℃备用。
将经分离鉴定的产肠毒素型大肠杆菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCCNo.17622）菌种接种于LB培养基中，37℃震荡培养至对数生长期，按照 1%的比例接入到处理过的污水样品，37℃震荡培养24小时，扩增污水样品中的特异性噬菌体，然后将培养后的样品于4℃ 12000×g离心10分钟，上清通过0.22μm孔径的无菌滤器，得到的滤液即可用于特异性噬菌体的分离。
采用点样实验和双层平板实验检测滤液中是否有特异性噬菌体。点样法：将新鲜培养的大肠杆菌均匀涂布于LB平板，自然晾干后，滴加10μL的滤液，静置待滤液被培养基完全吸收后，将平板倒置 37℃静置过夜培养，次日观察滴加滤液处是否有透明的斑点出现。双层平板法：将无菌的 LB 半固体培养基加热至完全融化后45℃保温，加入噬菌体滤液100µL和新鲜培养的大肠杆菌200µL 充分混匀，倒入固体LB平板的上层，自然凝固后，于37℃静置过夜培养，次日观察有无噬菌斑出现。若两种方法结果均呈阳性，则证明滤液中存在噬菌体。
噬菌体的纯化
利用双层平板法对噬菌体进行纯化，用灭菌过的 10 µL 枪头在双层平板上挑取单个清亮、直径大的噬菌斑浸泡于液体 LB 培养基中，4℃静置 6 h，然后用无菌的液体 LB培养基连续倍比稀释，重复双层平板实验，如此重复连续传代 10 代以上，直至形成形状和大小均一的噬菌斑，最后将噬菌体与 SM Buffer（30%）混均后放于-80℃保存，命名为Phage-HY19。具体噬菌斑参见图1。
噬菌体最佳感染复数（MOI）的测定
宿主菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCC No.17622）培养至对数生长期，然后按照噬菌体：宿主菌=10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7转接液体 LB 培养基中，37℃振荡培养 10 h，于4℃ 10,000×g离心15 min，上清用 0.22μm 的无菌滤器过滤，利用双层平板法测定滴度，产生最高滴度的噬菌体/细菌比例即为最佳 MOI。
经测定，如图2所示，Phage-HY19的最佳MOI为10-6，此时该噬菌体获得最有效的增殖并产生最大数量的子代噬菌体，滴度可以达到5.5×109pfu/mL。
噬菌体颗粒的扩增、浓缩与纯化
将2mL过夜培养的宿主菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCC No.17622）加入200mL灭菌的液体LB培养基，37℃，150rpm振荡培养至对数生长初期。按最佳MOI将噬菌体Phage-HY19接入菌液，再加入CaCl2至终浓度1mM，37℃，150rpm摇振培养12-16h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，扩增得到噬菌体裂解液。
将上清液倒入干净的锥形瓶，加入 DNaseI 和 RNaseA 至终浓度为 1 µg/mL，37℃温育30 min，再加入终浓度为 1 mol/L 的 NaCl，促使噬菌体颗粒与细菌碎片分离，搅拌均匀后冰浴 1 小时。4℃，10000 rpm 离心10 min，去除细胞碎片，收集上清，加入质体比10%的 PEG 8000，轻缓搅拌或颠倒使其溶解，避免剧烈搅拌，冰浴2h，使噬菌体颗粒与PEG8000充分结合形成沉淀。4℃，10,000rpm离心10 min，弃上清，回收沉淀的噬菌体颗粒，此时噬菌体颗粒附着于离心桶内壁，将离心桶倒置5 min流干液体，用滤纸吸去残余液体，2mL的SM Buffer重悬沉淀。加入等体积氯仿抽提，回收含噬菌体的水相，反复抽提多
次直到无杂质，4℃保存浓缩的噬菌体颗粒。
透射电子显微镜观察
利用 CsCl 密度梯度离心，将浓缩的噬菌体颗粒滴在铜片上，自然沉淀3min，用滤纸吸去多余的液体，滴一滴2%的磷钨酸染色 10min，室温干燥后使用透射电子显微镜观察。
通过透射电子显微镜观察，Phage-HY19具有典型的二十面体头部和伸缩性的尾部，头部大小为98×82nm，尾部大小约为103×24nm，根据噬菌体分类学可知，属于有尾噬菌体目中的肌尾病毒科，属于T4-like噬菌体。经进一步分型确定其为T4-like噬菌体T-evens亚群。
噬菌体保藏
纯化的噬菌体Phage-HY19于2019年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17584。
实施例2：
1. 噬菌体Phage-HY19的温度敏感性
取 600 µL 滴度为108pfu/mL的噬菌体液于5个无菌EP管中，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下作用20 min、40 min、60 min，每个温度设3个重复，作用时间结束后取样，立即置于水浴中冷却，然后测定噬菌体的效价，实验重复3遍。Phage-HY19的温度敏感性如图3所示，噬菌体Phage-HY19在50-70℃作用1h后，其活性无明显变化；80℃作用40min后，噬菌体全部失活；90℃作用20min后，噬菌体全部失活。
噬菌体Phage-HY19的宿主谱的测定
2.1 试验材料：
E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCC No.17622，O8：K91，K88ac，自行分离鉴定），CVCC1524（O8：K91，K88ac，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC），CVCC1510（O9：K88ac，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC），CVCC200（O149：K91，K88ac，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC），ATCC25922（O1血清型，购自ATCC），CVCC222（O141：K99，购自中国兽医微生物菌株保藏管理中心CVCC），肠炎沙门氏菌（实验室分离鉴定）和痢疾杆菌（实验室分离鉴定）。
试验方法：
采用双层平板法完成。选取2.1试验材料中所列的菌株，对分离得到的噬菌体通过双层平板实验（具体操作同上）进行宿主范围测定，若有噬菌斑出现说明噬菌体能裂解该菌株。具体结果参见下表1。
表1 噬菌体Phage-HY19宿主谱的测定
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE001
以上结果表明：在大肠杆菌E.coli-HuNHY19、CVCC1524、CVCC1510、CVCC200的平板中均有明显的噬菌斑形成，而肠炎沙门氏菌、痢疾杆菌、CVCC222和ATCC25922在双层平板上层培养基生长良好，无噬菌斑形成，说明噬菌体Phage-HY19对ETEC- K88ac宿主菌有裂解作用，无交叉裂解作用。
实施例3：噬菌体Phage-HY19的活性试验
3.1 毒力试验
取5周龄雌性实验用昆明小鼠共20只，随机分为两组，各10只，其中组1为试验组，口服浓度为109pfu/ml噬菌体培养液2mL，组2为对照组，口服等量PBS，连续口服14d，脱颈致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。结果显示，噬菌体Phage-HY19对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常。
体外杀菌活性
将过夜培养的大肠杆菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCC No.17622），CVCC1524（O8：K91，K88ac）菌液各1.0mL(含菌量为1×109cfu/mL)混合，并用LB将其OD600nm值调整为1.0(含菌量为约为1×109cfu/mL)，加入噬菌体Phage-HY19培养液(噬菌体效价为1×108pfu/mL)，最后用LB调整其OD600nm约为0.5左右，于37℃静置培养，同时以不加噬菌体的相应菌株作为对照组。在培养的0、1、2、3、4、5h检测OD600nm值的变化。具体结果参见图4。
从图4展示的结果可知，噬菌体Phage-HY19接种后，菌液的OD600nm值自1h后开始下降，3小时后明显下降，而未添加噬菌体Phage-HY19的菌液的OD600nm值表现出持续上升趋势。试验结果表明，噬菌体Phage-HY19可有效抑制ETEC- K88ac细菌的生长。
3.3 体内杀菌试验
取5周龄雌性实验用昆明小鼠(实验前体内产毒性型大肠杆菌检测为阴性)20只，随机分为两组，分别是试验组和对照组，将大肠杆菌E.coli-HuNHY19接种到LB液体培养基中培养活化后，调整其浓度为108cfu/ml；以每只1mL的剂量灌喂实验用昆明小鼠，试验组在攻毒后1h后，口服噬菌体Phage-HY19培养液（噬菌体效价为1×108pfu/mL）1mL；而对照组在攻毒1h后，口服PBS 1mL，分别在12h、24h、36h，随机从各组取两只小鼠进行脱颈致死，取肠道各1g，加入2mL PBS匀浆，4℃下6000rpm离心15分钟，取0.1mL上清进行稀释，并采用不同稀释度涂布LB平板，计算匀浆液中的大肠杆菌浓度，具体结果如下表2：
表2 小鼠体内噬菌体杀菌试验结果
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
基于以上表2的结果可知，在同样攻毒的条件下，口服噬菌体Phage-HY19培养液12h后，检测到的肠道匀浆中的大肠杆菌浓度为9.2×103 cfu/mL，而对照组的浓度为8.5×105 cfu/mL，在口服24和36h后，检测不到产毒性型大肠杆菌，而对照组的大肠杆菌浓度呈现出持续上升。
环境消毒试验
将大肠杆菌CVCC1524（O8：K91，K88ac）菌液 (含菌量为1×108cfu/mL) 50ml/m2混合均匀喷洒于养殖场料槽表面，然后以噬菌体Phage-HY19培养液（噬菌体效价为1×108pfu/mL）以50ml/m2的喷洒量为的剂量对料槽表面实施喷杀, 2h后，检测大肠杆菌残留。
检测结果显示，2h后料槽表面大肠杆菌CVCC1524浓度为3×103CFU/ m2，4h后，料槽表面未检出大肠杆菌CVCC1524，说明噬菌体Phage-HY19培养液可以有效杀灭养殖环境中大肠杆菌ETEC-K88ac。
食品消毒试验
取新鲜猪瘦肉，将其切成5cm见方（5cm×5cm×5cm）的瘦肉块，将大肠杆菌CVCC1524（O8：K91，K88ac）菌液按照108cfu/kg的用量均匀喷洒于每块新鲜的猪瘦肉表面，然后处理组以噬菌体Phage-HY19培养液（噬菌体效价为1×108pfu/mL）以5ml/kg的喷洒量为的剂量对猪瘦肉表面实施喷杀, 对照组采用同样喷洒量的PBS进行喷杀，2h后检测大肠杆菌含量。
检测结果显示，2h后处理组猪瘦肉表面的大肠杆菌CVCC1524含量为65CFU/g，对照组猪瘦肉表面的大肠杆菌CVCC1524含量为3×105CFU/g；4h后，处理组猪瘦肉表面的大肠杆菌CVCC1524含量为0 CFU/g，对照组猪瘦肉表面的大肠杆菌CVCC1524含量为8×105CFU/g。以上试验表面，说明噬菌体Phage-HY19培养液可以有效杀灭食品表面的大肠杆菌ETEC-K88ac。

Claims (6)

1.一株噬菌体，命名为Phage-HY19，所述噬菌体已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17584，所述噬菌体Phage-HY19对ETEC- K88ac宿主菌有裂解作用，无交叉裂解作用。
2.根据权利要求1所述的噬菌体在制备防治产肠毒素型大肠杆菌所导致的腹泻的药物中的应用，所述腹泻是由产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac感染所导致的仔猪腹泻。
3.根据权利要求1所述的噬菌体在净化养殖环境中的应用，所述应用是将包含噬菌体Phage-HY19的培养液或制剂喷洒在待净化的养殖环境的表面。
4.根据权利要求1所述的噬菌体在制备食品保鲜剂中的应用，所述食品保鲜剂用于杀灭食品表面的产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac。
5.根据权利要求4所述的应用，所述食品是鲜肉或水果。
6.根据权利要求5所述的应用，所述鲜肉为猪鲜肉。
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