CN111662880B - 一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用 - Google Patents

一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage)、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用，属于生物工程技术领域，所述产气荚膜梭菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020047。本发明的噬菌体对产气荚膜梭菌具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除产气荚膜梭菌。本发明的产气荚膜梭菌噬菌体能够通过抑制产气荚膜梭菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生。本发明为防控畜禽因产气荚膜梭菌引发的动物肠道疾病提供了一种安全、无毒副作用的噬菌体抑菌产品来源。

Description

一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，Cp)也称魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，革兰氏阳性厌氧菌，广泛分布于土壤、饲料、污水、动物消化道和粪便中，是引起动物坏死性肠炎(Necrotic Enteritis，NE)、肠毒血症以及人类的食物中毒和创伤性气性坏疽的重要食源性病原菌。在禽产品生产过程中，Cp是健康禽肠道的常在菌，当生长环境及日粮发生改变，会引起该菌大量增殖并附着于肠道黏膜产生大量毒素和蛋白酶导致肠道黏膜损伤，从而引起腹泻及肠炎等疾病，严重影响动物生产性能并造成巨大经济损失。目前，由于长期通过在饲料中添加抗生素等促生长剂的方法来预防和控制动物坏死性肠炎，耐药菌株不断产生导致防治失败，给畜禽养殖业带来巨大经济损失。迄今，还没有关于利用产气荚膜梭菌噬菌体抑制产气荚膜梭菌的记载和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产气荚膜梭菌噬菌体、包括噬菌体的抑菌剂及制备方法和应用，本发明的噬菌体对产气荚膜梭菌具有强裂解作用，能够用于抑制产气荚膜梭菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株产气荚膜梭菌噬菌体，所述产气荚膜梭菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020047。
本发明提供了上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体的培养方法，包括以下步骤：
1)对产气荚膜梭菌培养物进行离心，收集沉淀；
2)利用TY培养基对步骤1)所述沉淀进行重悬，得到菌悬液，在菌悬液中加入上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体，于37℃条件下培养6～8h后，离心，取上清液，上清液经过0.22μm滤膜过滤，得到产气荚膜梭菌噬菌体裂解液。
优选的，步骤1)中所述产气荚膜梭菌培养物浓度为 1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml。
本发明提供了一种抑菌剂，所述抑菌剂包括上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体或上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体的培养物。
优选的，所述抑菌剂还包括药学上可接受的赋形剂。
优选的，所述药学上可接受的赋形剂包括缓冲液、金属离子和表面活性剂中的一种或几种。
本发明提供了上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体或者所述抑菌剂在制备抑制和/或清除产气荚膜梭菌的制剂中的应用。
本发明提供了上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体或者所述抑菌剂在制备防治动物肠道疾病的药物中的应用。
优选的，所述动物包括鸡、鸭或猪。
本发明的有益效果：本发明提供了一株产气荚膜梭菌噬菌体 (Clostridiumperfringens phage)，所述产气荚膜梭菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020047。本发明的噬菌体对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，Cp)具有强裂解作用，能够用于抑制和 /或清除产气荚膜梭菌。本发明的产气荚膜梭菌噬菌体能够通过抑制产气荚膜梭菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生。本发明为防控畜禽因产气荚膜梭菌噬菌体引发的动物肠道疾病提供了一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。
生物保藏说明
产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage)vB_CpeS_JS01，于2020年1月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌区武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020047。
附图说明
图1为双层平板检测纯化噬菌体结果；
图2为噬菌体电镜观察结果；
图3为噬菌体对Cp的裂解效果。
具体实施方式
本发明提供了一株产气荚膜梭菌噬菌体(Clostridium perfringens phage) vB_CpeS_JS01，所述产气荚膜梭菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M 2020047。本发明的产气荚膜梭菌噬菌体来源于禽养殖场粪样。
本发明的噬菌体对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，Cp)具有强裂解作用，能够用于抑制和/或清除产气荚膜梭菌。本发明的产气荚膜梭菌噬菌体能够通过抑制产气荚膜梭菌的过度生长，有效防控动物肠道疾病的发生。
本发明提供了上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体的培养方法，包括以下步骤：
1)对产气荚膜梭菌培养物进行离心，收集沉淀；
2)利用TY培养基对步骤1)所述沉淀进行重悬，得到菌悬液，在菌悬液中加入上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体，于37℃条件下培养6～8h后，离心，取上清液，上清液经过0.22μm滤膜过滤，得到产气荚膜梭菌噬菌体悬液。
本发明首先对产气荚膜梭菌培养物进行离心，收集沉淀；所述产气荚膜梭菌培养物浓度优选为1×108cfu/ml～1×1010cfu/ml，更优选为1×109cfu/ml；本发明对所述离心的参数没有特殊限制，采用本领域常规参数即可。
得到沉淀后，本发明利用TY培养基对所述沉淀进行重悬，得到菌悬液，在菌悬液中加入上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体，于37℃条件下培养6～8h 后，离心，取上清液，上清液经过0.22μm滤膜过滤，得到产气荚膜梭菌噬菌体裂解液。
本发明提供了一种抑菌剂，所述抑菌剂包括上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体或上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体的培养物；所述抑菌剂优选的还包括药学上可接受的赋形剂；所述药学上可接受的赋形剂优选的包括缓冲液、金属离子和表面活性剂中的一种或几种。
本发明提供了上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体或者所述抑菌剂在制备抑制和/或清除产气荚膜梭菌的制剂中的应用；所述产气荚膜梭菌优选的包括畜禽养殖中的产气荚膜梭菌或生产环境中的产气荚膜梭菌。
本发明提供了上述方案所述产气荚膜梭菌噬菌体或者所述抑菌剂在制备防治动物肠道疾病的药物中的应用；所述动物优选的包括鸡、鸭或猪。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中采用的噬菌体宿主菌产气荚膜梭菌ATCC 13124购自于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。产气荚膜梭菌CMCC 67422、CMCC 67423和CMCC 67424购自于中国医学细菌保藏管理中心。
实施例1产气荚膜梭菌噬菌体的分离制备及纯化
1、噬菌体分离
本发明样品采自禽养殖场粪样，将样品加入蛋白胨溶液，室温震荡2～4h，取上清5000×g.min-1离心30min，用0.22μm滤膜过滤上清。取1ml上清加入 50mlTY培养基中，再加入1mlATCC 13124菌株(以下简称Cp)过夜培养物(BHI过夜培养)，再放置于37℃，150rpm震荡培养过夜，次日取上述培养物以10000×g.min-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体原液。
取2ml过夜培养菌液涂布于20ml TY琼脂平板，待吸收后吸取噬菌体原液0.01ml滴于平板表面；待自然晾干后，置于37℃厌氧培养16～18h，观察点样区域变化。
取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取102～106稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，加入约5ml0.6％TY琼脂培养基，混匀后迅速倾倒入TY平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃厌氧培养12h 后，观察噬菌斑形成情况。
2、噬菌体纯化
取2ml新鲜培养的Cp过夜培养物，离心，1ml TY培养基重悬，加0.1ml 噬菌体[以MOI(感染复数)分别1:1、1:10和1:100的比例]；加入100ml TY 培养基，37℃震摇培养6～8h；取上述培养物以13000×g.min-1，4℃，离心 30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体裂解液。分别加 RNase A和DNase Ⅰ至噬菌体悬液，终浓度1μg/ml，37℃孵育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h；4℃离心10000×g.min-1、30min，去上清；加5mlSM溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用30min；加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，振荡30s；4℃， 3000×g.min-1离心15min，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(如图1所示)。
3、噬菌体电镜检测
取纯化噬菌体悬液作电镜观察，加20μl样本滴在铜网上，待其沉淀 15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸染色30min，干燥后电镜观察。
如图2所示，噬菌体属于肌尾噬菌体科，头部对称，直径约为73nm，尾长约为133nm，尾部直径为20nm，将该噬菌体命名为vB_CpeS_JS01。
实施例2、噬菌体vB_CpeS_JS01宿主谱系检测
将TY平板分为若干个区域，吸取不同宿主菌过夜培养物：ATCC 13124、 CMCC67422、CMCC 67423和CMCC 67424 0.1ml滴于TY平板，将菌液均匀地涂开，待其晾干后，取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取102、104和106稀释液0.01ml分别滴加于涂有不同宿主菌的平板中，正放待自然晾干后，置于37℃厌氧培养12h后，观察噬菌体裂解情况。
结果显示：噬菌体vB_CpeS_JS01对Cp菌株CMCC67422、CMCC67423 和CMCC 67424均有透明裂解圈，即噬菌体对Cp菌株均呈阳性。
实施例3、噬菌体vB_CpeS_JS01对Cp的裂解效果
将过夜培养的Cp菌液用TY培养基调整为OD600约为0.1～0.2，加入噬菌体vB_CpeS_JS01于菌液中(MOI分别为0.1和1)，置于37℃培养箱厌氧培养，同时设立阴性对照，仅加入TY培养基，分别在0h，2h，4h，6h，8h，10h后分别取0.2ml检测OD600值，比较加入噬菌体后的OD600变化。
结果如图3所示，37℃作用8h后，与对照组相比较，加入噬菌体组中 OD600值发生显著变化，作用4h后，与对照相比较，加入噬菌体组中OD600均有所降低；10h后，对照组生长至0.54，而以MOI0.1组中OD值略上升至0.14，MOI为1组中OD600仅为0.1。由此可见，噬菌体对Cp具有显著的裂解作用，不同作用浓度均能够有效抑制Cp的生长。
实施例4噬菌体vB_CpeS_JS01在禽养殖中的预防性抗菌效果
选取1日龄雏鸡50只，随机分为5组，每组10只。其中A组为对照组正常饲喂，B组正常饲喂同时用噬菌体灌服，1×108pfu/0.1ml/只，连续灌服7 天，C组正常饲喂并加氨苄青霉素饮水(0.1％W/V)连续饮水7天；D组为噬菌体对照组，1×1010pfu/0.1ml/只，连续灌服14天；E组为空白对照组。第 14～21天再分别饲喂噬菌体和氨苄青霉素；分别对A，B，C组在第19天应用108cfu/0.1ml/只进行Cp菌(ATCC13124)感染，第21天分别对鸡进行称重、取肠道分析坏死性肠炎发生状况进行评分(0为正常小肠，1为肠道轻度黏液覆盖，2为严重坏死性肠炎)、统计总死亡率，结果参见表1。由表1可以看出，应用噬菌体组与应用抗生素组的肠道评分和死亡率均低于对照组，且肠道无显著病理损伤。仅饲喂噬菌体组中，无死亡且肠道健康，与空白组相比较无显著性差异，表明噬菌体以1×1010pfu/0.1ml/只剂量应用于邹鸡无显著副作用，具有安全无毒副作用的特性。
表1噬菌体对鸡生长性能影响
Figure BDA0002506411870000061
结果如表2所示，通过应用噬菌体组与应用抗生素组别在14天及21天的雏鸡增重均高于对照组。养殖21天中对照组死亡2只，噬菌体与抗生素组均无死亡，且肠炎评分均低于对照组。由此可见，应用噬菌体能够抑制细菌的生长，具有与抗生素相当的作用能力，能够有效的预防肠炎的发生。
表2噬菌体对雏鸡增重效果
Figure BDA0002506411870000071
实施例5噬菌体vB_CpeS_JS01安全性实验
6～8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g±2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组，各10只；其中一组口服噬菌体1010pfu/0.1ml/ 只；对照组口服等体积PBS。连续口服14天，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。
结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株产气荚膜梭菌噬菌体（Clostridium perfringens phage），所述产气荚膜梭菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2020047。
2.权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体的培养方法，包括以下步骤：
1）对产气荚膜梭菌培养物进行离心，收集沉淀；
2）利用TY培养基对步骤1）所述沉淀进行重悬，得到菌悬液，在菌悬液中加入权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体，于37℃条件下培养6~8h后，离心，取上清液，上清液经过0.22μm滤膜过滤，得到产气荚膜梭菌噬菌体悬液。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤1）中所述产气荚膜梭菌培养物浓度为1×108cfu/ml~1×1010cfu/ml。
4.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包括权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体或权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体的培养物。
5.根据权利要求4所述抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂还包括药学上可接受的赋形剂。
6.根据权利要求5所述抑菌剂，其特征在于，所述药学上可接受的赋形剂包括缓冲液、金属离子和表面活性剂中的一种或几种。
7.权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体或者权利要求4~6任意一项所述抑菌剂在制备抑制和/或清除产气荚膜梭菌的制剂中的应用。
8.权利要求1所述产气荚膜梭菌噬菌体或者权利要求4~6任意一项所述抑菌剂在制备防治动物肠道疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述动物包括鸡、鸭或猪。
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CN107109372A (zh) * 2014-12-29 2017-08-29 尹特荣生物科技株式会社 新型产气荚膜梭菌噬菌体Clo‑PEP‑1及其用于抑制产气荚膜梭菌增殖的用途
CN110719953A (zh) * 2017-02-24 2020-01-21 尹特荣生物科技株式会社 新型产气荚膜梭菌噬菌体Clo-PEP-2及其用于抑制产气荚膜梭菌增殖的用途

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Capsular Polysaccharide Is a Receptor of a Clostridium perfringens Bacteriophage CPS1;Eunsu Ha等;《Viruses》;20191031;第11卷;1002，1-14 *

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