CN111363723A - 新型霍乱弧菌噬菌体及其应用 - Google Patents

新型霍乱弧菌噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一株新型的霍乱弧菌噬菌体及其应用，该噬菌体的拉丁名为Vibrio cholerae phage，被命名为vB‑VchS‑PR02，对霍乱弧菌有广谱的杀菌能力，于2019年11月04日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18861。所述噬菌体对霍乱弧菌具有强烈的裂解作用，可用于制备防治霍乱弧菌感染的药物或生物食疗添加剂、消毒剂，为霍乱弧菌感染疾病的预防、治疗提供了安全有效的方法。

Description

新型霍乱弧菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及新型霍乱弧菌噬菌体及其应用。
背景技术
南美白对虾(Penaeus vannamei)是世界养殖业产量最高的三大优良品种之一，具有适应性强、生长速度快、抗病能力强等三大特点。在20世纪80年代，我国对虾养殖业的发展带动了我国水产养殖业的迅猛发展，促进了我国沿海地区经济的发展。然而，近年随着南美白对虾养殖规模和养殖密度的迅速增大，养殖水体逐渐恶化，病害问题也日趋严重。
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是一种常见的海洋致病菌。南美白对虾感染霍乱弧菌是引起白便综合征的重要原因。白便综合症已经成为近年来南美白对虾养殖生产中仅次于早期死亡综合征的重大疾病，养殖户谈“白便”色变，此病导致南美白对虾大量死亡。至于霍乱弧菌引起南美白对虾白便综合征的发病机理，可能是由于霍乱弧菌在南美白对虾肠组织中经大量生长增殖、黏附肠黏膜表面、产生毒力因子，引起肠壁黏膜损伤，进一步通过血淋巴循环至肝胰腺组织并在其中繁殖和产生毒素后，导致肝胰腺出现肿大、糜烂等病变，最终促使肝胰腺和肠对相关消化液或消化酶合成和分泌功能失常，导致南美白对虾发病死亡。
目前，传统防治南美白对虾的白便综合征的方法是西药抗生素，但是抗生素的大量使用，不仅会污染水体，还会导致致病菌产生耐药性，而由于霍乱弧菌存在多种耐药机制，很容易发生耐药性，抗生素的使用难以达到预期效果。因此，研发一种疗效显著、使用安全的新型制剂用于杀灭水体的霍乱弧菌对对虾养殖业极为重要。
噬菌体又称细菌性病毒，是一类专一性裂解细菌的病毒，在环境中分布广泛，种类多样，结构简单，具有很强的宿主特异性。一旦噬菌体感染细菌，噬菌体就在细菌细胞内增殖。增殖后，后代噬菌体会摧毁细菌的细胞壁使其宿主菌裂解，宿主菌裂解后噬菌体释放出来又会感染新的宿主菌，这表明噬菌体具有高效的杀灭细菌能力。噬菌体杀灭细菌具有高度特异性，某种噬菌体仅感染杀灭某种特定的细菌而不会伤害其他细菌。利用噬菌体控制水产致病菌早在噬菌体被发现之前就有应用，但由于对噬菌体的研究不够充分，而抗生素在当时具有广谱抑菌效果，且疗效好见效快，这使得噬菌体应用被大大削弱。近年来，由于抗生素滥用引发的一系列耐药菌问题，使得噬菌体重新回归人们的视野，应用噬菌体控制致病菌的研究也在科学界引起了广泛兴趣。作为应对抗生素抗性的重要武器之一，噬菌体的临床应用潜力巨大。
但是，目前还没有出现有效的霍乱弧菌噬菌体，能用于防治南美白对虾的白便综合征，因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株新型霍乱弧菌噬菌体及其作为药物和水体消毒剂的应用，可能够通过以泼洒、拌料的方式对南美白对虾施加霍乱弧菌噬菌体，从而达到防治白便综合征的效果，还能避免抗生素治疗南美白对虾白便病面临的耐药难题。
在第一方面，本申请提供一种从海鲜大市场污水中分离的对霍乱弧菌有广谱的杀菌能力的霍乱弧菌噬菌体，其拉丁名为Vibrio cholerae phage，被命名为vB-VchS-PR02，在2019年11月04日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.18861。
该噬菌体vB-VchS-PR02对霍乱弧菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产安全有效的水体消毒剂及防治霍乱弧菌引起的南美白对虾白便病的药物提供了噬菌体来源。
在第二方面，本发明还提供了所述新型霍乱弧菌噬菌体vB-VchS-PR02在防治霍乱弧菌感染疾病的药物、水体消毒剂中的应用。
优选地，所述的应用中，所述疾病为南美白对虾白便综合症，以该噬菌体作为药物活性成分的药物或者该噬菌体，作为饲料添加剂添加入南美白对虾的饲料中，对南美白对虾体内的霍乱弧菌具有明显的抑制杀灭效果，能有效预防霍乱弧菌引起的南美白对虾白便病的发生。此外，该噬菌体还可通过直接泼洒到水体中的方式南美白对虾进行给药。
在第三方面，本发明还提供一种用于防治由霍乱弧菌感染所导致的疾病的药物，其活性成分包括上述新型霍乱弧菌噬菌体vB-VchS-PR02。
此外，本发明还提供一种检测试剂盒，其包括如上所述的新型霍乱弧菌噬菌体。本领域技术人员可根据本发明公开内容和本领域常识利用霍乱弧菌噬菌体vB-VchS-PR02制备检测试剂盒，用于检测其特异侵染的霍乱弧菌，用于检测和防控由其宿主菌霍乱弧菌侵染导致的疾病。
所述药物还包括辅料；所述辅料为SM缓冲液、海藻酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、葡萄糖中的一种或多种。优选的，所述杀菌组合物还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
具体地，所述噬菌体组合物的剂型为粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂或膏剂。
在第四方面，本发明还提供一种水体消毒剂，其有效成分上述的霍乱弧菌噬菌体；优选地，噬菌体的浓度为106PFU/ml以上。
进一步地，上述水体消毒剂还包括其他不同种类特定病原菌的噬菌体。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供一种新型霍乱弧菌噬菌体及其应用，该噬菌体对霍乱弧菌具有强烈的裂解作用，并且具有宽裂解谱，为工业化生产噬菌体及其用于环境消毒及噬菌体预防和治疗霍乱弧菌菌引起的南美白对虾白便病提供了噬菌体来源。
2、所述新型霍乱弧菌噬菌体便于进行工业生产，可通过宿主菌霍乱弧菌进行特异性繁殖。该噬菌体还用于制备安全有效的生物消毒剂，用于水体环境消毒从而治疗动物养殖环境污染；该噬菌体还可用于制备一种安全、无污染的新型药物，用于防治霍乱弧菌引起南美白对虾的白便病。
附图说明
图1为电镜下观察的噬菌体vB-VchS-PR02形态图；
图2为噬菌体vB-VchS-PR02的热稳定性结果；
图3为噬菌体vB-VchS-PR02的pH稳定性结果；
图4为噬菌体vB-VchS-PR02对R17杀灭效果时效图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1噬菌体的分离培养
(一)菌种的复苏培养和菌悬液的制备
挑取霍乱弧菌的冻存菌液在TCBS平板上三区划线，分离单菌落，37℃恒温箱中培养16～24h。挑取单菌落，接种盛有5ml2216E肉汤中，37℃空气振荡器中，170rpm振荡培养16h，得到单一的菌悬液。
(二)噬菌体的分离与纯化
取山东省滨州市某养殖虾池水样品放入盛有2216E肉汤的采样瓶中，每个采样瓶中按照0.5％的量加入各株霍乱弧菌，搅拌均匀后，于37℃的空气振荡器中，170rpm振荡培养过夜，10000rpm离心10min，0.22μm的细菌滤器过滤除菌。将滤液和宿主菌混合，37℃孵育5min，再将混合液加入到已融化好上层琼脂中，用手迅速搓动试管使之混匀，然后迅速倒入准备好的下层平板上，轻轻晃动使其分布均匀，待凝固后放入37℃的恒温箱中，6～8h后观察结果。若有噬菌体存在，则会在培养基上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。抠取单个噬菌斑，于1mlPBS中，37℃的空气振荡器中30min，11000rpm离心5min，取上清再用双层平板法得到单个的噬菌斑，如此重复3～5次直至得到大小、形态一致的噬菌斑。
实施例2噬菌体的生物学特征的测定
(一)透射电镜观察噬菌体的形态
取高于1×108PFU/ml噬菌体样品20μl滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。
电镜观察可见噬菌体的头部呈多面体结构，头部直径为60nm左右，尾部长约180～190nm，根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体的形态符合长尾噬菌体科的特征，属于长尾噬菌体科，命名为vB-VchS-PR02。
(二)噬菌体的热稳定性检测
将1×109PFU/ml的噬菌体vB-VchS-PR02增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。双层平板法测定噬菌体的效价。
结果可见噬菌体vB-VchS-PR02在40℃和50℃作用1h后基本保持原活性；60℃作用1h后仍保持在1.0×108PFU/ml以上；70℃的高温作用下，20min噬菌体基本失活。由此可见噬菌体vB-VchS-PR02的热稳定性较高。
(三)噬菌体的pH稳定性检测
取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的PBS 4.5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl 1×109PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果可见噬菌体vB-VchS-PR02在pH4～11范围内其效价几乎没变或略有降低，仍然在108PFU/ml以上，可见该噬菌体对pH的适应范围较广。
(四)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定
按照常规方法增殖霍乱弧菌噬菌体vB-VchS-PR02和宿主菌R17，测定噬菌体及宿主菌效价，并将噬菌体vB-VchS-PR02和宿主菌R17进行适当的稀释。按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001的比例各取100μl vB-VchS-PR02和R17加入到2216E肉汤中。于37℃，170rpm振荡培养至液体变澄清，记录摇清时间。11000r/min离心5min，双层平板法测定噬菌体的效价。
结果可见噬菌体的最佳感染复数是0.001，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为1×1010PFU/ml，在8个感染复数中噬菌体滴度最高。
(五)噬菌体的增殖和效价测定
各取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml 2216E肉汤中，37℃的空气振荡器中，170rpm培养3～4h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。用2216E肉汤按照10倍比稀释噬菌体增殖液，取一定比例的样品稀释液100μl与霍乱弧菌100μl混合均匀后，制备双层平板，每个稀释度分别做3个平行样。计数时，观察平板中的噬菌斑取30～300之间的平板来计数，计算效价。
结果可见，噬菌体vB-VchS-PR02在pH4～11范围内其效价几乎没变或略有降低，仍然在108PFU/ml以上，可见该噬菌体对pH的适应范围较广。
实施例3噬菌体裂解谱的测定和体外裂解试验
(一)噬菌体裂解谱的测定
采用铺双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液，选取40株分离自发病的山东滨州和江苏南通地区南美白对虾的肝胰腺的霍乱弧菌，分别为R01～R40，40株霍乱弧菌为非O1、非O139血清型。并且检测相关的毒力基因，通过PCR分别检测40株宿主菌肠毒素基因ctxh、肠毒素基因ctxB、外膜蛋白基因ompU、小带联结毒素基因zot、毒素调控蛋白基因toxR、古典生物型(Clas-sical biotype)毒素共调菌毛基因tcpA Class、埃尔托生物型(El Tor biotype)毒素共调菌毛基因tcpA ET、毒素共调菌毛基因tcpI、古典生物型溶血素基因hlyA Class、埃尔托生物型溶血素基因hlyA ET、热稳定肠毒素基因stn/sto等毒力相关基因。
裂解谱检测方法：分别取100ml的菌悬液与100ml vB-VchS-PR02噬菌体加入到已融化好且冷却到50℃左右的上层琼脂中，用手迅速搓动试管，使之混匀，然后迅速倒入准备好的下层2216E营养琼脂平板上，轻轻晃动使其分布均匀，置于37℃的恒温箱中培养，观察是否出现噬菌体斑，裂解谱见下表1。
表1噬菌体vB-VchS-PR02的裂解谱
Figure BDA0002408574550000071
Figure BDA0002408574550000081
Figure BDA0002408574550000091
注：+：裂解，噬菌斑透亮；-：不裂解。
实验结果显示：针对临床分离的40株霍乱弧菌，噬菌体vB-VchS-PR02能够裂解其中的30株霍乱弧菌，噬菌体vB-VchS-PR02的裂解率达75％。
(二)vB-VchS-PR02对宿主菌R17体外裂解试验(OD值法)
按照一定的比例加入宿主菌R17和噬菌体vB-VchS-PR02，宿主菌的终浓度为1×108CFU/ml，噬菌体的终浓度分别为1×109PFU/ml，1×108PFU/ml，1×107PFU/ml、1×106PFU/ml，对照组加入与噬菌体相同量的无菌2216E肉汤，菌液和噬菌体混合后在37℃，170rpm的摇床内振荡培养。每隔一定的时间测定OD值直至混合液变清亮，涂布平板法测定作用一定时间后各组菌的残留量。
结果可见vB-VchS-PR02对R17的裂解效果很好，4个不同浓度的噬菌体对R17的裂解效率都可以达到99％以上，只是时间长短不同，但是4h以内都能够达到最好的杀灭效果。
实施例4噬菌体在南美白对虾肝胰腺中的动力学
(一)通过拌料饲喂方式给噬菌体在对虾肝胰腺中的动力学
选择3g的健康南美白对虾，试验前取实验虾缸里的水样与对虾的肝胰腺，测定噬菌体，确认无噬菌体vB-VchS-PR02存在时，每缸20只虾饲喂10g拌有5μl109PFU/ml的vB-VchS-PR02的饲料。隔一定时间测定肝胰腺噬菌体的含量。
结果显示，饲喂前肝胰腺中无噬菌体vB-VchS-PR02，噬菌体vB-VchS-PR02拌料饲喂后，对虾的肝胰腺可以检测到噬菌体，最高效价可以达到104PFU/ml。
(二)噬菌体水体消毒实验中的动力学
使水体的霍乱弧菌的终浓度为1×106CFU/ml，加入MOI为1的霍乱弧菌噬菌体进行消毒。
结果显示，噬菌体vB-VchS-PR02消毒后6h即可使水体中的霍乱弧菌的浓度降低为1×103CFU/ml。
(三)噬菌体治疗霍乱弧菌感染南美白对虾死亡率变化
选择2～3g的健康南美白对虾，分成3组(空白对照组、攻毒组、治疗组)，每组15尾虾。实验前取同缸对虾肝胰腺，通过双层平板法测定肝胰腺中噬菌体效价，确认无噬菌体vB-VchS-PR02存在时，对攻毒组和治疗组进行注射致病性霍乱弧菌3.5×107CFU/只攻毒，治疗组攻毒3h后的对虾饲喂10g拌有5μl的109PFU/ml的vB-VchS-PR02的饲料，攻毒组只饲喂10g正常饲料，空白对照组不做任何处理。观察并记录对虾的死亡情况。
表2噬菌体对南美白对虾白便病的控制效果
Figure BDA0002408574550000101
表2的结果表明，空白对照组15尾虾无死亡现象，死亡率为0％；攻毒组死亡14尾虾，死亡率93％，治疗组死亡8尾虾，死亡率53％。与攻毒组相比，治疗组的死亡率明显下降，说明噬菌体对霍乱弧菌引起南美白对虾白便病的具有一定的控制效果。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.新型霍乱弧菌噬菌体，其特征在于，拉丁名为Vibrio cholerae phage，被命名为vB-VchS-PR02PR02，其保藏号为CGMCC NO.18861。
2.如权利要求1所述的新型霍乱弧菌噬菌体在防治霍乱弧菌感染疾病的药物、水体消毒剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病为南美白对虾白便综合症，所述药物可作为饲料添加剂添对南美白对虾进行给药。
4.一种用于防治由霍乱弧菌感染所导致的疾病的药物，其特征在于，其活性成分包括如权利要求1所述的新型霍乱弧菌噬菌体。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，还包括其他特定病原菌的噬菌体。
6.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分为如权利要求1所述的霍乱弧菌噬菌体；优选地，噬菌体的浓度为106PFU/ml以上。
7.根据权利要求6所述的水体消毒剂，还包括不同种类特定病原菌的噬菌体。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的新型霍乱弧菌噬菌体。
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