CN113049705B - 一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法 - Google Patents

一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC‑MS/MS检测方法，将待测样品禾谷镰刀菌进行前处理制成含有T6P和Tre样品溶液，样品液经色谱柱进行洗脱分离，利用UPLC‑MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量；选取了氨基柱和T3色谱柱适合T6P和Tre两种化合物UPLC‑MS/MS检测，分别建立利用两种色谱柱同时检测禾谷镰刀菌中T6P和Tre的方法，发现氨基柱的灵敏度高，T3色谱柱的回收率高、稳定性好。并利用两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH‑1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g，Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g。

Description

一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法
技术领域
本发明涉及UPLC-MS/MS检测方法领域，尤其是涉及一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法。
背景技术
禾谷镰刀菌(F.graminearum)是小麦、玉米等农作物中最常见的病原菌，该菌致病，不仅导致农作物产量下降，同时产呕吐毒素，严重影响了农产品的品质和安全性。海藻糖的生物合成途径对真菌的致病力有至关重要的作用，据报道禾谷镰刀菌中敲除海藻糖合成途径相关基因，禾谷镰刀菌将丧失海藻糖合成能力，继而无法产孢，呕吐毒素合成能力下降86％。
T6P，6-磷酸海藻糖是Tre，海藻糖生物合成的中间体，是植物和真菌中必不可少的信号代谢物，对T6P和Tre在禾谷镰刀菌中进行定量，可以为禾谷镰刀菌生长和产毒防控的海藻糖合成途径研究提供支撑。
Tre属于糖类化合物，目前有较为成熟的检测方法。T6P属于酸性强糖，在微生物中含量极低，目前主要采用GC-MS和LC-MS两种方法检测，但是存在以下缺点：GC-MS需要衍生反应，前处理复杂，检测时间长，LC-MS检测时间短，样品前处理简单，但主要采用单级杆质谱扫描，母离子定性定量，假阳性概率较大。此外，由于T6P强酸性质，为强极性难保留和分离的化合物，对色谱柱要求较高，据报道Dionex IonPac AS11-HC column(250×2.0mm,particle size9μm)、SIELC Primesep SB column(4.6×150mm，5μm)、waters Acquity BEHamide column(3.0×100mm,1.7μm)和ZIC-HILIC HPLC column(2.1×150mm,3.5μm)均可用于检测磷酸糖，除waters Acquity BEH amide column可以达到较大的分离度，具有较好的分离效果，其他色谱柱但均存在分离度低、色谱响应值低、色谱柱使用寿命短等问题。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术中所存在的问题，本发明提出了一种具有较好分离度，灵敏度高，回收率高，稳定性好的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法。
技术方案：为达以上目的，本发明采取以下技术方案：
一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量；
所述色谱柱选取Phenomenexluna
Figure BDA0002984263080000025
Figure BDA0002984263080000022
(100×2mm，3μm)色谱柱或watersAcquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm，1.7μm)色谱柱。
更进一步的，待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：
将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中，在28℃，140rpm条件下培养7天，过滤去除菌丝后，离心浓缩成为1×105个/mL孢子液备用；将孢子液接种于马铃薯液体培养基中，每瓶接种1mL，28℃，140rpm震荡培养7d后，过滤取菌丝，采用去离子水清洗3次后，烘干，－20℃储存待测；
准确称取菌丝样品0.04g于15mL离心管中，加入4mL去离子水，浸泡1h后，采用高速匀浆机匀浆，加入4mL甲醇后，－80℃冷冻，在超声波清洗机超声解冻破壁30min，离心，取上清液，待测。
更进一步的，质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa)；电喷雾电压(IonsprayVoltage)：－4500Kpa；离子源温度(Temperature)：450℃；雾化气压力(Ion Source Gas1)：65Kpa；加热辅助气压力(Ion Source Gas2)：65Kpa；驻留时间：40ms。
更进一步的，当检测对象为T6P时，DP为-110，CE为-35，-35。
更进一步的，当检测对象为Tre时，DP为-95，CE为-19，-25。
更进一步的，所述色谱柱为Phenomenexluna
Figure BDA0002984263080000026
Figure BDA0002984263080000024
(100×2mm，3μm)色谱柱时，UPLC优化条件如下：
流动相A：万分之一氨水；
流动相B：乙腈；
梯度：70％A等度洗脱；
流速：0.4mL/min。
更进一步的，所述色谱柱为waters Acquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm，1.7μm)色谱柱时，UPLC优化条件如下：
流动相A：5mM乙酸铵(包含万分之一氨水)；
流动相B：乙腈；
梯度：0-3min 99％A、3-5min 10％A、5-8min 99％；
流速：0.25mL/min。
更进一步的，T6P标准谱图的获取方法具体如下：
称取T6P标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析，并制作标准曲线和谱图。
更进一步的，Tre标准谱图的获取方法具体如下：
称取Tre标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析，并制作标准曲线和谱图。
有益效果：本发明与现有技术相比，具备以下优点：
(1)选用的色谱柱具有较好的分离度，灵敏度高，回收率高，稳定性好。
(2)前处理方法简单，高效，进一步提高了分离效果。
附图说明
图1为T6P标准溶液的MRM色谱图显示的两种不同色谱柱的响应强度对比示意图；
图2为Tre标准溶液的MRM色谱图显示的两种不同色谱柱的响应强度对比示意图；
图3为T3色谱柱检测时氨水对T6P响应值的影响对比色谱示意图；
图4为氨基柱分离T6P的标准曲线示意图；
图5为T3色谱柱分离T6P的标准曲线示意图；
图6为氨基柱分离Tre的标准曲线示意图；
图7为T3色谱柱分离Tre的标准曲线示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
本发明实施例中使用的仪器和试剂来源如下：
Agilent 1290型UPLC***，ABsciex 4500质谱检测器；
电子天平：XP105DR型——赛多利斯科学仪器有限公司；
AWL-020I-P型超纯水***——艾科浦仪器有限公司；
KQ-250E型超声波清洗器——昆山禾创超声仪器有限公司；
H2050R型医用离心机——湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
DW-86L828J型超低温冰箱——海尔生物医疗股份有限公司；
涡旋混匀器——江苏海门其林贝尔仪器有限公司。
甲醇和乙腈为色谱纯，美国默克公司生产；乙酸铵为≥98％，德国CNW公司生产；T6P和Tre购置于sigma-aldrich贸易有限公司，质谱用水为屈臣氏蒸馏水。
实施例以及对比例中待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：
将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中，在28℃，140rpm条件下培养7天，过滤去除菌丝后，离心浓缩成为1×105个/mL孢子液备用；将孢子液接种于马铃薯液体培养基中，每瓶接种1mL，28℃，140rpm震荡培养7d后，过滤取菌丝，采用去离子水清洗3次后，烘干，－20℃储存待测；
准确称取菌丝样品0.04g于15mL离心管中，加入4mL去离子水，浸泡1h后，采用高速匀浆机匀浆，加入4mL甲醇后，－80℃冷冻，在超声波清洗机超声解冻破壁30min，离心，取上清液，待测。
实施例以及对比例中标准谱图和标准曲线获取方法如下：
其中T6P标准谱图的获取方法具体如下：
称取T6P标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析，并制作标准曲线和谱图。标准曲线具体请参考图4，图5所示。
其中Tre标准谱图的获取方法具体如下：
称取Tre标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析，并制作标准曲线和谱图。标准曲线具体请参考图5，图6所示。
通过标准曲线的绘制可以看出：
T6P和Tre通过氨基柱时，在4.25-250ug/L的线性范围内呈现良好的线性关系，通过T3柱时在31.25-1000ug/L的范围内呈现良好的线性关系；另外，通过氨基柱的检出限为1.25--5.10ug/L，远低于T3柱的15.62-12.75ug/L；定量限氨基柱为3.75-15.60ug/L，也低于T3柱的38.25-52.03ug/L，氨基柱的灵敏度高于T3柱，两种色谱柱的相关系数均在0.99以上，均符合实际分析的要求。
表1 T6P和Tre的标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限
Figure BDA0002984263080000041
实施例1：
禾谷镰刀菌中T6P的UPLC-MS/MS检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对T6P进行定量；
所述色谱柱选取Phenomenexluna
Figure BDA0002984263080000053
Figure BDA0002984263080000052
(100×2mm，3μm)色谱柱：UPLC优化条件如下：
流动相A：万分之一氨水；
流动相B：乙腈；
梯度：70％A等度洗脱；
流速：0.4mL/min。
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa)；电喷雾电压(Ionspray Voltage)：－4500Kpa；离子源温度(Temperature)：450℃；雾化气压力(Ion Source Gas1)：65Kpa；加热辅助气压力(Ion Source Gas2)：65Kpa；驻留时间：40ms。DP为-110，CE为-35，-35。
实施例2：
禾谷镰刀菌中T6P的UPLC-MS/MS检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对T6P进行定量；
所述色谱柱选取waters Acquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm，1.7μm)色谱柱：UPLC优化条件如下：
流动相A：5mM乙酸铵(包含万分之氨水)；
流动相B：乙腈；
梯度：0-3min 99％A、3-5min 10％A、5-8min 99％；
流速：0.25mL/min。
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa)；电喷雾电压(Ionspray Voltage)：－4500Kpa；离子源温度(Temperature)：450℃；雾化气压力(Ion Source Gas1)：65Kpa；加热辅助气压力(Ion Source Gas2)：65Kpa；驻留时间：40ms。DP为-110，CE为-35，-35。
实施例3：
禾谷镰刀菌中Tre的UPLC-MS/MS检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对Tre进行定量；
所述色谱柱选取Phenomenexluna
Figure BDA0002984263080000063
Figure BDA0002984263080000062
(100×2mm，3μm)色谱柱：UPLC优化条件如下：
流动相A：万分之一氨水；
流动相B：乙腈；
梯度：70％A等度洗脱；
流速：0.4mL/min。
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa)；电喷雾电压(Ionspray Voltage)：－4500Kpa；离子源温度(Temperature)：450℃；雾化气压力(Ion Source Gas1)：65Kpa；加热辅助气压力(Ion Source Gas2)：65Kpa；驻留时间：40ms；DP为-95，CE为-19，-25。
实施例4：
禾谷镰刀菌中Tre的UPLC-MS/MS检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对Tre进行定量；
所述色谱柱选取waters Acquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm，1.7μm)色谱柱：UPLC优化条件如下：
流动相A：5mM乙酸铵(包含万分之氨水)；
流动相B：乙腈；
梯度：0-3min 99％A、3-5min 10％A、5-8min 99％；
流速：0.25mL/min。
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa)；电喷雾电压(Ionspray Voltage)：－4500Kpa；离子源温度(Temperature)：450℃；雾化气压力(Ion Source Gas1)：65Kpa；加热辅助气压力(Ion Source Gas2)：65Kpa；驻留时间：40ms；DP为-95，CE为-19，-25。
对比例1-4：
对比例1-4的其他实施方式与实施例1-2相同，不同之处在于色谱柱的选择和优化条件不同，具体如表2所示：
表2实施例1-2以及对比例1-4T6P检测过程色谱柱的选择和UPLC条件优化
Figure BDA0002984263080000071
从表2可以看出：对比例1-4中采用HILIC和Cogent diamond Hydride时，强保留，未出峰；采用C18色谱柱时，T6P的保留较弱，T6P在2min左右无规则流出；waters AcquityBEH amide column检测柱压大，磷酸糖峰拖尾，色谱柱使用200针样品后，磷酸糖出现强保留，该色谱柱无法继续用于检测磷酸糖；而本申请实施例1和2分别使用的luna氨基硅胶柱和waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱，T6P的保留效果较好，50μg/L的T6P通过氨基柱检测响应强度约为3.5×104cps，而1000μg/L的T6P利用T3色谱柱时响应值只有1×104cps，T6P利用T3色谱柱检测响应强度远低于氨基柱，具体可参考图1的MRM色谱图所示，其中氨基柱T6P浓度为50μg/L，T3色谱柱T6P浓度为1000μg/L，虚线离子对为421.1/241.1，实线离子对421.1/79.1。
对比例5-8：
对比例5-8的其他实施方式与实施例3-4相同，不同之处在于色谱柱的选择和优化条件不同，具体如表3所示：
表3实施例3-4以及对比例1-4Tre检测过程色谱柱的选择和UPLC条件优化
Figure BDA0002984263080000081
从表3可以看出：除了C18柱，其他色谱柱均可实现Tre的分离。但是KinetexHilic、Cogent diamond Hydride和waters Acquity BEH amide column在T6P分离时出现强保留，这3种色谱柱无法实现T6P和Tre的同时检测。T3和NH2色谱柱可以实现T6P和Tre的同时检测。
具体可参考图2的MRM色谱图所示，其中Tre浓度为50μg/L，虚线离子对为341.0/178.8，实线离子对341.0/118.9。
此外，对实施例5和实施例1-2进行T3色谱柱检测T6P时优化实验对比如图3所示：实施例5中进行色谱柱优化条件时：在水相中加入万分之一氨水。发现T6P的响应提高了十倍，但是其响应值仍然远低于NH3柱。luna
Figure BDA0002984263080000082
柱效流失快，一根色谱柱检测磷酸糖平均寿命为200-300个样品，T3柱使用寿命长，响应值较低，因此应综合考虑检测成本、样品中T6P的含量，选择合适的色谱柱进行测定。图3中T6P浓度为1000μg/L，离子对421.1/79.1。
此外对实施例1-4的回收率和精密度进行测定。
准确称取禾谷镰刀菌40mg，添加一定浓度的标准品溶液后，每个浓度重复4次，计算该方法的回收率和相对标准偏差(RSD)，结果表明，利用氨基和T3两种色谱柱，在3个加标水平下，T6P的回收率分别为71.5％-85.7％和83.7％-95.6％，相对标准偏差为3.8％-6.2％和2.7％-3.3％；Tre的回收率分别为72.4％-82.3％和82.8％-84.8％，相对标准偏差4.5％-8.5％和2.8％-3.2％；与氨基柱比，3柱的回收率高，RSD低，说明T3柱的稳定性优于氨基柱。利用氨基和T3两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH-1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g，Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g，两种色谱柱检测禾谷镰刀菌pH-1中T6P和Tre含量无显著性差异，均可用于检测禾谷镰刀菌pH-1中T6P和Tre含量。
表4准确性和精密度实验结果
Figure BDA0002984263080000091
本发明公开的一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法选取了氨基柱和T3色谱柱适合T6P和Tre两种化合物UPLC-MS/MS检测，分别建立利用两种色谱柱同时检测禾谷镰刀菌中T6P和Tre的方法，发现氨基柱的灵敏度高，T3色谱柱的回收率高、稳定性好。利用两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH-1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g，Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g。

Claims (6)

1.一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于，样品禾谷镰刀菌进行前处理后制备样品溶液，样品溶液经色谱柱进行洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量；
所述色谱柱为Phenomenexluna ®NH2 100 Å，100×2mm，3μm，色谱柱时，UPLC优化条件如下：
流动相A：万分之一氨水；
流动相B：乙腈；
梯度：70%A等度洗脱；
流速：0.4mL/min；
或，
所述色谱柱为waters Acquity UPLC HSS T3 Column，100×3mm，1.7μm色谱柱时，UPLC优化条件如下：
流动相A：5mM乙酸铵，包含万分之一氨水；
流动相B：乙腈；
梯度：0-3min 99%A、3-5min 10%A、5-8min 99%；
流速：0.25mL/min；
待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：
将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中，在28℃，140rpm条件下培养7天，过滤去除菌丝后，离心浓缩成为1×105 个/mL孢子液备用；将孢子液接种于马铃薯液体培养基中，每瓶接种1mL，28℃，140rpm震荡培养7d后，过滤取菌丝，采用去离子水清洗3次后，烘干，－20℃储存待测；
准确称取菌丝样品0.04g于15mL离心管中，加入4mL去离子水，浸泡1h后，采用高速匀浆机匀浆，加入4mL甲醇后，－80℃冷冻，在超声波清洗机超声解冻破壁30min，离心，取上清液，待测。
2.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测气帘气压力Curtain Gas:40Kpa；电喷雾电压Ionspray Voltage：－4500 Kpa；离子源温度Temperature：450℃；雾化气压力Ion Source Gas1：65Kpa；加热辅助气压力Ion SourceGas2：65Kpa；驻留时间：40 ms。
3.根据权利要求1或2所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：当检测对象为T6P时，离子对为：421.2/241.1,421.2/139.1；DP为-110，CE为-35，-35。
4.根据权利要求1或2所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：当检测对象为Tre时，离子对为：341.0/178.8, 341.0/118.9；DP为-95，CE为-19，-25。
5.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：T6P标准谱图的获取方法具体如下：
称取T6P标准品于容量瓶种，利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容，然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析，并制作标准曲线和谱图。
6.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于：Tre标准谱图的获取方法具体如下：
称取Tre标准品于容量瓶种，利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容，然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析，并制作标准曲线和谱图。
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