CN113049705B - 一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法 - Google Patents
一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC‑MS/MS检测方法,将待测样品禾谷镰刀菌进行前处理制成含有T6P和Tre样品溶液,样品液经色谱柱进行洗脱分离,利用UPLC‑MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量;选取了氨基柱和T3色谱柱适合T6P和Tre两种化合物UPLC‑MS/MS检测,分别建立利用两种色谱柱同时检测禾谷镰刀菌中T6P和Tre的方法,发现氨基柱的灵敏度高,T3色谱柱的回收率高、稳定性好。并利用两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH‑1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g,Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g。
Description
技术领域
本发明涉及UPLC-MS/MS检测方法领域,尤其是涉及一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法。
背景技术
禾谷镰刀菌(F.graminearum)是小麦、玉米等农作物中最常见的病原菌,该菌致病,不仅导致农作物产量下降,同时产呕吐毒素,严重影响了农产品的品质和安全性。海藻糖的生物合成途径对真菌的致病力有至关重要的作用,据报道禾谷镰刀菌中敲除海藻糖合成途径相关基因,禾谷镰刀菌将丧失海藻糖合成能力,继而无法产孢,呕吐毒素合成能力下降86%。
T6P,6-磷酸海藻糖是Tre,海藻糖生物合成的中间体,是植物和真菌中必不可少的信号代谢物,对T6P和Tre在禾谷镰刀菌中进行定量,可以为禾谷镰刀菌生长和产毒防控的海藻糖合成途径研究提供支撑。
Tre属于糖类化合物,目前有较为成熟的检测方法。T6P属于酸性强糖,在微生物中含量极低,目前主要采用GC-MS和LC-MS两种方法检测,但是存在以下缺点:GC-MS需要衍生反应,前处理复杂,检测时间长,LC-MS检测时间短,样品前处理简单,但主要采用单级杆质谱扫描,母离子定性定量,假阳性概率较大。此外,由于T6P强酸性质,为强极性难保留和分离的化合物,对色谱柱要求较高,据报道Dionex IonPac AS11-HC column(250×2.0mm,particle size9μm)、SIELC Primesep SB column(4.6×150mm,5μm)、waters Acquity BEHamide column(3.0×100mm,1.7μm)和ZIC-HILIC HPLC column(2.1×150mm,3.5μm)均可用于检测磷酸糖,除waters Acquity BEH amide column可以达到较大的分离度,具有较好的分离效果,其他色谱柱但均存在分离度低、色谱响应值低、色谱柱使用寿命短等问题。
发明内容
发明目的:为了解决现有技术中所存在的问题,本发明提出了一种具有较好分离度,灵敏度高,回收率高,稳定性好的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法。
技术方案:为达以上目的,本发明采取以下技术方案:
一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,具体为:将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成,经色谱柱进行梯度洗脱分离,利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量;
更进一步的,待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下:
将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中,在28℃,140rpm条件下培养7天,过滤去除菌丝后,离心浓缩成为1×105个/mL孢子液备用;将孢子液接种于马铃薯液体培养基中,每瓶接种1mL,28℃,140rpm震荡培养7d后,过滤取菌丝,采用去离子水清洗3次后,烘干,-20℃储存待测;
准确称取菌丝样品0.04g于15mL离心管中,加入4mL去离子水,浸泡1h后,采用高速匀浆机匀浆,加入4mL甲醇后,-80℃冷冻,在超声波清洗机超声解冻破壁30min,离心,取上清液,待测。
更进一步的,质谱条件具体为:离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa);电喷雾电压(IonsprayVoltage):-4500Kpa;离子源温度(Temperature):450℃;雾化气压力(Ion Source Gas1):65Kpa;加热辅助气压力(Ion Source Gas2):65Kpa;驻留时间:40ms。
更进一步的,当检测对象为T6P时,DP为-110,CE为-35,-35。
更进一步的,当检测对象为Tre时,DP为-95,CE为-19,-25。
流动相A:万分之一氨水;
流动相B:乙腈;
梯度:70%A等度洗脱;
流速:0.4mL/min。
更进一步的,所述色谱柱为waters Acquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm,1.7μm)色谱柱时,UPLC优化条件如下:
流动相A:5mM乙酸铵(包含万分之一氨水);
流动相B:乙腈;
梯度:0-3min 99%A、3-5min 10%A、5-8min 99%;
流速:0.25mL/min。
更进一步的,T6P标准谱图的获取方法具体如下:
称取T6P标准品于容量瓶种,利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容,然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液,将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析,并制作标准曲线和谱图。
更进一步的,Tre标准谱图的获取方法具体如下:
称取Tre标准品于容量瓶种,利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容,然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液,将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析,并制作标准曲线和谱图。
有益效果:本发明与现有技术相比,具备以下优点:
(1)选用的色谱柱具有较好的分离度,灵敏度高,回收率高,稳定性好。
(2)前处理方法简单,高效,进一步提高了分离效果。
附图说明
图1为T6P标准溶液的MRM色谱图显示的两种不同色谱柱的响应强度对比示意图;
图2为Tre标准溶液的MRM色谱图显示的两种不同色谱柱的响应强度对比示意图;
图3为T3色谱柱检测时氨水对T6P响应值的影响对比色谱示意图;
图4为氨基柱分离T6P的标准曲线示意图;
图5为T3色谱柱分离T6P的标准曲线示意图;
图6为氨基柱分离Tre的标准曲线示意图;
图7为T3色谱柱分离Tre的标准曲线示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
本发明实施例中使用的仪器和试剂来源如下:
Agilent 1290型UPLC***,ABsciex 4500质谱检测器;
电子天平:XP105DR型——赛多利斯科学仪器有限公司;
AWL-020I-P型超纯水***——艾科浦仪器有限公司;
KQ-250E型超声波清洗器——昆山禾创超声仪器有限公司;
H2050R型医用离心机——湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;
DW-86L828J型超低温冰箱——海尔生物医疗股份有限公司;
涡旋混匀器——江苏海门其林贝尔仪器有限公司。
甲醇和乙腈为色谱纯,美国默克公司生产;乙酸铵为≥98%,德国CNW公司生产;T6P和Tre购置于sigma-aldrich贸易有限公司,质谱用水为屈臣氏蒸馏水。
实施例以及对比例中待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下:
将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中,在28℃,140rpm条件下培养7天,过滤去除菌丝后,离心浓缩成为1×105个/mL孢子液备用;将孢子液接种于马铃薯液体培养基中,每瓶接种1mL,28℃,140rpm震荡培养7d后,过滤取菌丝,采用去离子水清洗3次后,烘干,-20℃储存待测;
准确称取菌丝样品0.04g于15mL离心管中,加入4mL去离子水,浸泡1h后,采用高速匀浆机匀浆,加入4mL甲醇后,-80℃冷冻,在超声波清洗机超声解冻破壁30min,离心,取上清液,待测。
实施例以及对比例中标准谱图和标准曲线获取方法如下:
其中T6P标准谱图的获取方法具体如下:
称取T6P标准品于容量瓶种,利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容,然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液,将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析,并制作标准曲线和谱图。标准曲线具体请参考图4,图5所示。
其中Tre标准谱图的获取方法具体如下:
称取Tre标准品于容量瓶种,利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容,然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液,将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析,并制作标准曲线和谱图。标准曲线具体请参考图5,图6所示。
通过标准曲线的绘制可以看出:
T6P和Tre通过氨基柱时,在4.25-250ug/L的线性范围内呈现良好的线性关系,通过T3柱时在31.25-1000ug/L的范围内呈现良好的线性关系;另外,通过氨基柱的检出限为1.25--5.10ug/L,远低于T3柱的15.62-12.75ug/L;定量限氨基柱为3.75-15.60ug/L,也低于T3柱的38.25-52.03ug/L,氨基柱的灵敏度高于T3柱,两种色谱柱的相关系数均在0.99以上,均符合实际分析的要求。
表1 T6P和Tre的标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限
实施例1:
禾谷镰刀菌中T6P的UPLC-MS/MS检测方法,具体为:将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成,经色谱柱进行洗脱分离,利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程对T6P进行定量;
流动相A:万分之一氨水;
流动相B:乙腈;
梯度:70%A等度洗脱;
流速:0.4mL/min。
质谱条件具体为:离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa);电喷雾电压(Ionspray Voltage):-4500Kpa;离子源温度(Temperature):450℃;雾化气压力(Ion Source Gas1):65Kpa;加热辅助气压力(Ion Source Gas2):65Kpa;驻留时间:40ms。DP为-110,CE为-35,-35。
实施例2:
禾谷镰刀菌中T6P的UPLC-MS/MS检测方法,具体为:将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成,经色谱柱进行梯度洗脱分离,利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程对T6P进行定量;
所述色谱柱选取waters Acquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm,1.7μm)色谱柱:UPLC优化条件如下:
流动相A:5mM乙酸铵(包含万分之氨水);
流动相B:乙腈;
梯度:0-3min 99%A、3-5min 10%A、5-8min 99%;
流速:0.25mL/min。
质谱条件具体为:离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa);电喷雾电压(Ionspray Voltage):-4500Kpa;离子源温度(Temperature):450℃;雾化气压力(Ion Source Gas1):65Kpa;加热辅助气压力(Ion Source Gas2):65Kpa;驻留时间:40ms。DP为-110,CE为-35,-35。
实施例3:
禾谷镰刀菌中Tre的UPLC-MS/MS检测方法,具体为:将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成,经色谱柱进行洗脱分离,利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程对Tre进行定量;
流动相A:万分之一氨水;
流动相B:乙腈;
梯度:70%A等度洗脱;
流速:0.4mL/min。
质谱条件具体为:离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa);电喷雾电压(Ionspray Voltage):-4500Kpa;离子源温度(Temperature):450℃;雾化气压力(Ion Source Gas1):65Kpa;加热辅助气压力(Ion Source Gas2):65Kpa;驻留时间:40ms;DP为-95,CE为-19,-25。
实施例4:
禾谷镰刀菌中Tre的UPLC-MS/MS检测方法,具体为:将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成,经色谱柱进行梯度洗脱分离,利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程对Tre进行定量;
所述色谱柱选取waters Acquity UPLC HSS T3 Column(100×3mm,1.7μm)色谱柱:UPLC优化条件如下:
流动相A:5mM乙酸铵(包含万分之氨水);
流动相B:乙腈;
梯度:0-3min 99%A、3-5min 10%A、5-8min 99%;
流速:0.25mL/min。
质谱条件具体为:离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM多反应监测气帘气压力(Curtain Gas:40Kpa);电喷雾电压(Ionspray Voltage):-4500Kpa;离子源温度(Temperature):450℃;雾化气压力(Ion Source Gas1):65Kpa;加热辅助气压力(Ion Source Gas2):65Kpa;驻留时间:40ms;DP为-95,CE为-19,-25。
对比例1-4:
对比例1-4的其他实施方式与实施例1-2相同,不同之处在于色谱柱的选择和优化条件不同,具体如表2所示:
表2实施例1-2以及对比例1-4T6P检测过程色谱柱的选择和UPLC条件优化
从表2可以看出:对比例1-4中采用HILIC和Cogent diamond Hydride时,强保留,未出峰;采用C18色谱柱时,T6P的保留较弱,T6P在2min左右无规则流出;waters AcquityBEH amide column检测柱压大,磷酸糖峰拖尾,色谱柱使用200针样品后,磷酸糖出现强保留,该色谱柱无法继续用于检测磷酸糖;而本申请实施例1和2分别使用的luna氨基硅胶柱和waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱,T6P的保留效果较好,50μg/L的T6P通过氨基柱检测响应强度约为3.5×104cps,而1000μg/L的T6P利用T3色谱柱时响应值只有1×104cps,T6P利用T3色谱柱检测响应强度远低于氨基柱,具体可参考图1的MRM色谱图所示,其中氨基柱T6P浓度为50μg/L,T3色谱柱T6P浓度为1000μg/L,虚线离子对为421.1/241.1,实线离子对421.1/79.1。
对比例5-8:
对比例5-8的其他实施方式与实施例3-4相同,不同之处在于色谱柱的选择和优化条件不同,具体如表3所示:
表3实施例3-4以及对比例1-4Tre检测过程色谱柱的选择和UPLC条件优化
从表3可以看出:除了C18柱,其他色谱柱均可实现Tre的分离。但是KinetexHilic、Cogent diamond Hydride和waters Acquity BEH amide column在T6P分离时出现强保留,这3种色谱柱无法实现T6P和Tre的同时检测。T3和NH2色谱柱可以实现T6P和Tre的同时检测。
具体可参考图2的MRM色谱图所示,其中Tre浓度为50μg/L,虚线离子对为341.0/178.8,实线离子对341.0/118.9。
此外,对实施例5和实施例1-2进行T3色谱柱检测T6P时优化实验对比如图3所示:实施例5中进行色谱柱优化条件时:在水相中加入万分之一氨水。发现T6P的响应提高了十倍,但是其响应值仍然远低于NH3柱。luna柱效流失快,一根色谱柱检测磷酸糖平均寿命为200-300个样品,T3柱使用寿命长,响应值较低,因此应综合考虑检测成本、样品中T6P的含量,选择合适的色谱柱进行测定。图3中T6P浓度为1000μg/L,离子对421.1/79.1。
此外对实施例1-4的回收率和精密度进行测定。
准确称取禾谷镰刀菌40mg,添加一定浓度的标准品溶液后,每个浓度重复4次,计算该方法的回收率和相对标准偏差(RSD),结果表明,利用氨基和T3两种色谱柱,在3个加标水平下,T6P的回收率分别为71.5%-85.7%和83.7%-95.6%,相对标准偏差为3.8%-6.2%和2.7%-3.3%;Tre的回收率分别为72.4%-82.3%和82.8%-84.8%,相对标准偏差4.5%-8.5%和2.8%-3.2%;与氨基柱比,3柱的回收率高,RSD低,说明T3柱的稳定性优于氨基柱。利用氨基和T3两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH-1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g,Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g,两种色谱柱检测禾谷镰刀菌pH-1中T6P和Tre含量无显著性差异,均可用于检测禾谷镰刀菌pH-1中T6P和Tre含量。
表4准确性和精密度实验结果
本发明公开的一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法选取了氨基柱和T3色谱柱适合T6P和Tre两种化合物UPLC-MS/MS检测,分别建立利用两种色谱柱同时检测禾谷镰刀菌中T6P和Tre的方法,发现氨基柱的灵敏度高,T3色谱柱的回收率高、稳定性好。利用两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌pH-1中T6P含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g,Tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g。
Claims (6)
1.一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,其特征在于,样品禾谷镰刀菌进行前处理后制备样品溶液,样品溶液经色谱柱进行洗脱分离,利用UPLC-MS/MS的MRM模式采集数据,电喷雾离子源,负离子扫描方式下监测,将获得的待测样品谱图与标准谱图对比,保留时间相同的即为对应物质,通过标准曲线线性回归方程分别对T6P和Tre进行定量;
所述色谱柱为Phenomenexluna ®NH2 100 Å,100×2mm,3μm,色谱柱时,UPLC优化条件如下:
流动相A:万分之一氨水;
流动相B:乙腈;
梯度:70%A等度洗脱;
流速:0.4mL/min;
或,
所述色谱柱为waters Acquity UPLC HSS T3 Column,100×3mm,1.7μm色谱柱时,UPLC优化条件如下:
流动相A:5mM乙酸铵,包含万分之一氨水;
流动相B:乙腈;
梯度:0-3min 99%A、3-5min 10%A、5-8min 99%;
流速:0.25mL/min;
待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下:
将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中,在28℃,140rpm条件下培养7天,过滤去除菌丝后,离心浓缩成为1×105 个/mL孢子液备用;将孢子液接种于马铃薯液体培养基中,每瓶接种1mL,28℃,140rpm震荡培养7d后,过滤取菌丝,采用去离子水清洗3次后,烘干,-20℃储存待测;
准确称取菌丝样品0.04g于15mL离心管中,加入4mL去离子水,浸泡1h后,采用高速匀浆机匀浆,加入4mL甲醇后,-80℃冷冻,在超声波清洗机超声解冻破壁30min,离心,取上清液,待测。
2.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,其特征在于质谱条件具体为:离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;检测方式:MRM多反应监测气帘气压力Curtain Gas:40Kpa;电喷雾电压Ionspray Voltage:-4500 Kpa;离子源温度Temperature:450℃;雾化气压力Ion Source Gas1:65Kpa;加热辅助气压力Ion SourceGas2:65Kpa;驻留时间:40 ms。
3.根据权利要求1或2所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,其特征在于:当检测对象为T6P时,离子对为:421.2/241.1,421.2/139.1;DP为-110,CE为-35,-35。
4.根据权利要求1或2所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,其特征在于:当检测对象为Tre时,离子对为:341.0/178.8, 341.0/118.9;DP为-95,CE为-19,-25。
5.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,其特征在于:T6P标准谱图的获取方法具体如下:
称取T6P标准品于容量瓶种,利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容,然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液,将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析,并制作标准曲线和谱图。
6.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MS/MS检测方法,其特征在于:Tre标准谱图的获取方法具体如下:
称取Tre标准品于容量瓶种,利用体积分数为60%的乙腈溶解并定容,然后利用60%的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液,将不同浓度的标准工作溶液进行UPLC-MS/MS分析,并制作标准曲线和谱图。
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