CN112666273A - 一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法，属于血液检测技术领域。该方法是取预处理后的红细胞样本，先利用超高效液相色谱将甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、五聚谷氨酸甲氨蝶呤与红细胞基质进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，根据已经建立的校准曲线，计算甲氨蝶呤类药物的含量。本发明的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.5 min之内可完成分离和检测，可用于临床上甲氨蝶呤类物质的定量分析，为临床上甲氨蝶呤类物质的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Description

一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法

技术领域

本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法。

背景技术

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)主要用于治疗恶性肿瘤：小剂量或一般剂量用于治疗绒毛膜上皮细胞癌、急性淋巴白血病、乳腺癌和中枢神经瘤(鞘内注射)；大剂量治疗骨肉瘤、头颈部上皮样癌、非霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌等。大剂量的甲氨蝶呤在血浆中比较容易监测，但是小剂量的甲氨蝶呤在血浆中会被快速清除而很难被监测到。

MTX主要通过叶酸载体进入细胞内，在细胞中，被叶酸聚谷氨酸合成酶迅速转化合成甲氨蝶呤多聚谷氨酸。在竞争反应中，多聚谷氨酸被降解为聚合度从2-7个多种长度的多聚谷氨酸甲氨蝶呤。在低剂量的MTX治疗中，戊谷氨酸(MTXPG5)是检测到的最高的谷氨酸，而MTX的三谷氨酸形式(MTXPG3)在治疗中占主导地位。由于MTXPGn是MTX外排蛋白的底物，多谷氨酰化作用在细胞中保留了MTX。MTXPGn对叶酸和新嘌呤生物合成关键酶的抑制作用比MTX强几个数量级。因此，MTXPGn是评估MTX暴露和自身免疫性风湿病疗效的关键客观指标。对长链MTXPGs(MTXPG3)的激活不良或依从性差导致的暴露不足可能限制某些患者获得好的的临床反应，尽管与药代动力学无关的其他机制显然也与此相关。因此测定红细胞内MTXPGn水平和MTX的评估可以预测患者对治疗的反应，也可以用来评估患者对MTX治疗的依从性。

细胞内MTXPGn的浓度可以通过毛细管区带电泳和柱后光氧化高效液相色谱等分析技术来测定。总细胞内MTX也可以通过荧光偏振免疫测定或酶解后的聚谷氨酸，然后通过吸光度测量。然而，由于受到内源性叶酸或其他MTX相关化合物的干扰，这些技术是费时费力的，因此不适合用于患者的常规测量。

目前，甲氨蝶呤的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和流质联用法(LC-MS/MS)。HPLC-UV法专属性较差、灵敏度较低、样本用量大，且分析时间长，而LC-MS/MS法多采用液液萃取法处理血浆，操作繁琐和耗时。比如，专利CN 110320302 A公开了一种快速测定甲氨蝶呤浓度的方法，该方法虽然前处理简单，但只测定了甲氨蝶呤的浓度，未监测主要聚合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用超高效液相色谱串联质谱技术同时检测红细胞中甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、二聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate diglutamate,MTXPG2)、三聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate triglutamate,MTXPG3)、四聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate tetrag-lutamate,MTXPG4)、五聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexatepentaglutamate,MTXPG5)浓度的方法。该方法灵敏度高，同时监测红细胞中五种甲氨蝶呤类物质，特异性好，对临床监测具有十分重要参考意义。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法，取预处理后的红细胞样本，先利用超高效液相色谱将甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、五聚谷氨酸甲氨蝶呤与红细胞基质进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，根据已经建立的校准曲线，计算甲氨蝶呤类药物的含量；

所述标准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，所述内标物为MTX-d3。

进一步地，所述超高效液相色谱条件如下：

色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18，2.1×50mm，1.7μm；

流动相A为0.01～0.2％甲酸和1～10mM甲酸铵的混合水溶液，流动相B为甲醇；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，在0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由100～90：0～10匀速渐变至40:60；在2.5-2.51分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40：60渐变至2:98；在2.51-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98；在3.0-3.01分钟内流动相A和流动相B的体积比由2:98切换至98:2；在3.01-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比98：2保持不变；

流速为0.2～0.6mL/min，柱温为35～55℃，进样体积为1～20μL。

进一步地，所述流动相A为0.1％甲酸和5mM甲酸铵的混合水溶液。

进一步地，流动相A和流动相B的初始体积比为98：2，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为10μL。

进一步地，所述质谱条件如下：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为3.0kV；源温度为150℃；脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。

进一步地，所述预处理是向红细胞中加入内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液，氮吹和复溶后上机。

进一步地，所述预处理是取50μL样本于1.5mL离心管中，向其中加入20μL内标工作液，涡旋，再加入180μL预冷的蛋白沉淀剂，振荡后超声，取上清氮吹后加入复溶液复溶，然后取上清进样。

进一步地，所述内标工作液为5ng/mL甲氨蝶呤-d3的0.1％甲酸水溶液。

进一步地，所述蛋白沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为1：4。

进一步地，所述复溶液为0.3％氨水。

有益效果：本发明的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.5min之内完成红细胞中甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、二聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexatediglutamate,MTXPG2)、三聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate triglutamate,MTXPG3)、四聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate tetraglutamate,MTXPG4)、五聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate pentaglutamate,MTXPG5)的定量分析，为临床上甲氨蝶呤类物质的浓度监测提供简单快速的检测方法。

附图说明

图1为甲氨蝶呤类物质标准品的提取离子流谱图。

图2为红细胞中甲氨蝶呤类物质的提取离子流谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测红细胞中甲氨蝶呤类物质的方法，红细胞样本经预处理后，先利用超高效液相色谱将待测物与红细胞基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算红细胞中甲氨蝶呤类物质的含量。

所述甲氨蝶呤类物质分别为：甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、二聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate diglutamate,MTXPG2)、三聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexatetriglutamate,MTXPG3)、四聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate tetrag-lutamate,MTXPG4)、五聚谷氨酸甲氨蝶呤(methotrexate pentaglutamate,MTXPG5)；

上述甲氨蝶呤类物质使用的同位素内标物均为甲氨蝶呤-d3(MTX-d3)。

具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：水(含0.1％甲酸5mM甲酸铵)；

流动相B：甲醇；

色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，在0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由98：2匀速渐变至40:60；在2.5-2.51分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40：60渐变至2:98；在2.51-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98；在3.0-3.01分钟内流动相A和流动相B的体积比由2:98切换至98:2；在3.01-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比98：2保持不变；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为10μL。

(2)质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为3.0kV；源温度为150℃；脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。质谱源参数如表1所示：

表1质谱源参数

项目	参数
		毛细管电压(kV)	3.0
源温度(℃)	150
		脱溶剂气温度(℃)	400
脱溶剂气流速(L/hr)	800
		锥孔气流速(L/hr)	150

各个目标物的质谱参数见表2。

表2甲氨蝶呤类物质检测质谱参数

化合物	母离子	子离子	去簇电压(V)	碰撞电压(V)
					MTX	455.20	308.21	20	20
MTX-d3	458.23	311.22	20	20
					MTXPG2	584.18	308.21	20	26
MTXPG3	713.18	308.19	28	32
					MTXPG4	842.30	308.20	70	40
MTXPG5	486.34	308.20	2	22

改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和甲酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测红细胞中甲氨蝶呤类物质的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5.5min之内完成甲氨蝶呤类物质的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.2％甲酸1～10mM甲酸铵水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸5mM甲酸铵水溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01％～0.2％甲酸1～10mM甲酸铵水溶液和甲醇作为流动相，色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用MTX-d3作为内标，由于其它待测物对应的同位素内标无法获得，通过考察基质效应，选择与之基质效应相同且结构相似的MTX-d3代替使用，同时也节约了成本。结果表明红细胞中甲氨蝶呤类物质的重现性和准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.2～0.6mL/min，优选为0.3mL/min。

进一步地，柱温为35～55℃，优选为40℃。

更进一步地，进样体积为1～20μL，优选为10μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测红细胞中甲氨蝶呤类物质时，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：水(含0.1％甲酸5mM甲酸铵)；

流动相B：甲醇；

色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，在0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由98：2匀速渐变至40:60；在2.5-2.51分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40：60渐变至2:98；在2.51-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98；在3.0-3.01分钟内流动相A和流动相B的体积比由2:98切换至98:2；在3.01-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比98：2保持不变；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为10μL。

(2)质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为3.0kV；源温度为150℃；脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h。

在一种方案中，经过预处理的红细胞按照如下方法制备：向红细胞中加入内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液，氮吹和复溶后上机；其中，蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液。

优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～1:5，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:4。

在一种优选方案中，经过预处理的红细胞按照如下方法制备：取50μL样本于1.5mL离心管中，向其中加入20μL内标工作液，然后涡旋数5s；加入180μL预冷后的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:1～1:5)，振荡5min，超声5min，14000rpm离心5min，每个样品取100μL上清，氮吹，加入80μL 0.3％氨水复溶(震荡3min，离心3min)，取60μL上清到进样瓶中，待上机。

在一种更优选方案中，经过预处理的红细胞按照如下方法制备：取50μL样本于1.5mL离心管中，向其中加入20μL内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL预冷后的甲醇：乙腈＝1:4(V/V)，振荡5min，超声5min，14000rpm离心5min，每个样品取100μL上清，氮吹，加入80μL 0.3％氨水复溶(震荡3min，离心3min)，取60μL上清到进样瓶中，待上机。

在一种方案中，内标工作液按照如下方法制备：

使用纯甲醇配制MTX-d3母液，浓度为1μg/mL，然后移取5μL MTX-d3母液，加入995μL 0.1％甲酸水溶液得到1mL内标工作液。

在一种方案中，混合标准溶液按照如下方法制备：

分别将甲氨蝶呤类物质配制成标准品母液，浓度分别为：MTX 1mg/mL、MTXPG22mg/mL、MTXPG3 2mg/mL、MTXPG4 2mg/mL、MTXPG5 2mg/mL，然后分别移取各1μL的MTX、MTXPG2、MTXPG3、MTXPG4和MTXPG5，再加入995μL 0.1％甲酸水溶液得到1mL混合标准溶液。

将上述混合标准溶液以空白红细胞配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：

取10μL混合标准品溶液加入至190μL空白红细胞中作为第一个高值浓度点；取5μL混合标准品溶液加入至195μL空白红细胞中得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白红细胞稀释得第七高值浓度点。

所述校准品溶液的七个浓度点为：

MTX：0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL和50ng/mL；

MTXPG2/MTXPG3/MTXPG4/MTXPG5：0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL；

每个浓度的校准品样本取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL内标工作液，然后涡旋5s；加入180μL预冷后的甲醇：乙腈＝1:4(V/V)，振荡5min，超声5min，14000rpm离心5min，每个样品取100μL上清，氮吹，加入80μL 0.3％氨水复溶(震荡3min，离心3min)，取60μL上清到进样瓶中，待上机。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明，然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

1.材料

方法学研究实验的样本来自于南京鼓楼医院2019年9月门诊收集的红细胞样本。

(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱***(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。

(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；MS级甲酸铵(Fisher，美国)；色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)(Waters公司)。

(3)质控品：含有甲氨蝶呤类物质分子的红细胞溶液，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表3所示。

表3质控品对应浓度(单位:ng/mL)

化合物ID	化合物	QC(L)	QC(M)	QC(H)
					1	MTX	0.25	2.5	20
2	MTXPG2	0.5	5	40
					3	MTXPG3	0.5	5	40
4	MTXPG4	0.5	5	40
					5	MTXPG5	0.5	5	40

2.方法

(1)色谱条件：流动相A：水(0.1％甲酸5mM甲酸铵)；流动相B：甲醇；色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；采用梯度洗脱的方式，流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为10μL。

(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；质谱源参数如表1所示，各个目标物的质谱参数见表2。

(3)标准品配制：

分别将甲氨蝶呤类物质配制成的标准品母液，浓度分别为：MTX 1mg/mL、MTXPG22mg/mL、MTXPG3 2mg/mL、MTXPG4 2mg/mL、MTXPG5 2mg/mL，然后分别移取MTX 1μL、MTXPG2 1μL、MTXPG3 1μL、MTXPG4 1μL、MTXPG5 1μL，加入995μL0.1％甲酸水溶液得到1mL混合标准溶液。

取10μL混合标准品溶液加入至190μL空白红细胞中作为第一个高值浓度点；取5μL混合标准品溶液加入至195μL空白红细胞中得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白红细胞稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白红细胞稀释得第七高值浓度点。

使用纯甲醇配制MTX-d3母液，浓度为1mg/mL，然后移取5μL，加入995μL0.1％甲酸水溶液得到1mL内标工作液。

(4)质控品的配制

低浓度质控品：将中浓度质控用混合红细胞稀释10倍，得低浓度质控样品；

中浓度质控品：取5μL混合标准溶液加入至1995μL空白红细胞中，得中浓度质控样品；

高浓度质控品：取20μL混合标准溶液加入至980μL空白红细胞中，得高浓度质控样品。

(5)样品处理

1)校准品前处理：每个浓度的校准品样本取50μL，加入20μL内标工作液，180μL预冷后蛋白沉淀剂，振荡5min，超声5min，14000rpm离心5min，每个样品取100μL上清，氮吹，加入80μL 0.3％氨水复溶(震荡3min，离心3min)，取60μL上清到进样瓶中，待上机。

2)红细胞样品前处理：每个样本取50μL，加入20μL内标工作液，180μL预冷后蛋白沉淀剂，振荡5min，超声5min，14000rpm离心5min，每个样品取100μL上清，氮吹，加入80μL0.3％氨水复溶(震荡3min，离心3min)，取60μL上清到进样瓶中，待上机。

3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后跟红细胞样品前处理方法一致，此处不再赘述。

四、方法验证

1.提取离子流谱图：甲氨蝶呤类物质的标准品和红细胞样品的目标峰峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为甲氨蝶呤类物质标准品提取离子流谱图，图2为红细胞中甲氨蝶呤类物质提取离子流谱图。

2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出红细胞中待测物的浓度。甲氨蝶呤类物质在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.995以上，满足定量要求，见表4。

表4甲氨蝶呤类物质线性回归方程及线性相关系数

3.最低定量限：最低定量限(LLOQ)作为标曲线性范围的最低点，也反映方法的灵敏度。因部分样本个体含量差异，对方法的灵敏度和特异性要求很高，本公司对方法进行优化和考察，目前LLOQ基本满足5种甲氨蝶呤类物质同时检测的灵敏度要求，具体见表5。

表5方法定量下限数据表

4.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白红细胞样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准溶液，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，甲氨蝶呤类物质的加标回收率在88.0％-107.0％之间，5次重复试验的RSD在1.26％-6.68％，统计结果见表6。

表6甲氨蝶呤类物质添加回收率结果

5.精密度考察：取无干扰空白红细胞样本，加入不同浓度甲氨蝶呤类物质标准溶液，得到低、中、高三个浓度红细胞样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定甲氨蝶呤类物质的浓度，批内精密度为1.19％-12.84％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.15％-13.87％，结果见表7。

表7批内、批间精密度试验结果

本发明采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体红细胞中的甲氨蝶呤类物质的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。

采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，甲氨蝶呤类物质的加标回收率为88.0％-107.0％之间，5次重复试验的RSD在1.26％-6.68％，准确度良好。

方法的重现性结果表明，甲氨蝶呤类物质的批内精密度为1.19％-12.84％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.15％-13.87％。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离，且建立的红细胞样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，红细胞用量仅50μL。

总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.5min之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上红细胞甲氨蝶呤类物质浓度的定量分析，为临床上甲氨蝶呤类物质浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。

Claims (10)

1.一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质浓度的方法，其特征在于：取预处理后的红细胞样本，先利用超高效液相色谱将甲氨蝶呤、二聚谷氨酸甲氨蝶呤、三聚谷氨酸甲氨蝶呤、四聚谷氨酸甲氨蝶呤、五聚谷氨酸甲氨蝶呤与红细胞基质进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，根据已经建立的校准曲线，计算甲氨蝶呤类药物的含量；

所述标准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，所述内标物为MTX-d3。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱条件如下：

色谱柱：ACQUITY UPLC CSH C18，2.1×50 mm，1.7 µm；

流动相A为0.01～0.2%甲酸和1～10mM甲酸铵的混合水溶液，流动相B为甲醇；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，在0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由100~90：0~10匀速渐变至40:60；在2.5-2.51分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40：60渐变至2:98；在2.51-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98；在3.0-3.01分钟内流动相A和流动相B的体积比由2:98切换至98:2；在3.01-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比98：2保持不变；

流速为0.2~0.6 mL/min，柱温为35~55℃，进样体积为1~20 µL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述流动相A为0.1%甲酸和5mM甲酸铵的混合水溶液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：流动相A和流动相B的初始体积比为98：2，流速为0.3 mL/min，柱温为40℃，进样体积为10 µL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述质谱条件如下：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为3.0 kV；源温度为150℃；脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为800 L/h，锥孔气流速为150 L/h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理是向红细胞中加入内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再涡旋离心后取上清液，氮吹和复溶后上机。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述预处理是取50 μL样本于1.5 mL离心管中，向其中加入20 μL内标工作液，涡旋，再加入180 µL预冷的蛋白沉淀剂，振荡后超声，取上清氮吹后加入复溶液复溶，然后取上清进样。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述内标工作液为5 ng/mL甲氨蝶呤-d3的0.1%甲酸水溶液。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液，甲醇和乙腈的体积比为1：4。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述复溶液为0.3%氨水。

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