CN113039186A - 抗乙型肝炎病毒HBV的脲6,7-二氢-4H-吡唑并[1,5-a]吡嗪活性剂 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及新的抗病毒剂。具体来说，本发明涉及可以抑制由乙型肝炎病毒(HBV)编码的蛋白质或干扰HBV复制周期的功能的化合物、包含此类化合物的组合物、抑制HBV病毒复制的方法、治疗或预防HBV感染的方法以及制造所述化合物的方法和中间体。

Description

抗乙型肝炎病毒HBV的脲6,7-二氢-4H-吡唑并[1,5-a]吡嗪活 性剂

技术领域

本发明总体上涉及新的抗病毒剂。具体来说，本发明涉及可以抑制由乙型肝炎病毒(HBV)编码的蛋白质或干扰HBV复制周期的功能的化合物、包含此类化合物的组合物、抑制HBV病毒复制的方法、治疗或预防HBV感染的方法以及制造所述化合物的方法。

背景技术

慢性HBV感染是严重的全球性健康问题，影响了超过5％的世界人口(全球超过3.5亿人，美国125万人)。尽管可以使用预防性HBV疫苗，但由于在发展中国家的大多数地区未达最佳标准的治疗选择和持续不断的新感染率，慢性HBV感染的负担仍然是重大的尚未解决的世界性医学问题。当前的治疗不提供治愈，并且限于仅仅两类药剂(干扰素α和病毒聚合酶的核苷类似物/抑制剂)；耐药性、低效能和耐受性问题限制了它们的影响。

HBV的低治愈率至少部分归因于使用单一抗病毒剂很难实现病毒产生的完全抑制这一事实，以及被感染的肝细胞的细胞核中共价闭合环状DNA(cccDNA)的存在和持久存留。然而，HBV DNA的持久抑制减缓肝脏疾病的进展，并有助于预防肝细胞癌(HCC)。

当前用于HBV感染的患者的疗法的目的在于将血清HBV DNA降低到低的或不可检测的水平，并最终减少或阻止肝硬化和HCC的发生。

HBV是嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的一种有包膜的部分双链DNA(dsDNA)病毒。HBV衣壳蛋白(HBV-CP)在HBV复制中发挥必不可少的作用。HBV-CP的主要生物学功能是充当结构蛋白，以包裹前基因组RNA并形成不成熟的衣壳粒子，所述衣壳粒子自发地从细胞质中许多拷贝的衣壳蛋白二聚体自组装。

HBV-CP还通过其C-端磷酸化位点的不同磷酸化状态来调控病毒DNA合成。另外，HBV-CP还可能利用位于HBV-CP的C-端区的富含精氨酸的结构域中的核定位信号，来促进病毒的松弛的环状基因组的核易位。

在细胞核中，作为病毒cccDNA微型染色体的组分，HBV-CP可以在cccDNA微型染色体的功能中发挥结构和调控作用。HBV-CP还与内质网(ER)中的病毒大包膜蛋白相互作用，并触发完整病毒粒子从肝细胞的释放。

与HBV-CP相关的抗HBV化合物已有报道。例如，已显示包括名为AT-61和AT-130的化合物在内的苯基丙烯酰胺衍生物(Feld J.等，Antiviral Res.2007,76,168)和来自于Valeant的一类的噻唑烷-4-酮(WO2006/033995)抑制前基因组RNA(pgRNA)包装。

F.Hoffmann-LA Roche AG已公开了用于HBV疗法的一系列3-取代的四氢-吡唑并[1,5-a]吡嗪(WO2016/113273、WO2017/198744、WO2018/011162、WO2018/011160、WO2018/011163)。

在基于组织培养的筛选中发现了杂芳基二氢嘧啶类化合物(HAP)(Weber等，Antiviral Res.2002,54,69)。这些HAP类似物充当合成的别构活化剂，并且能够诱导导致HBV-CP降解的异常衣壳形成(WO99/54326、WO 00/58302、WO 01/45712、WO 01/6840)。也已描述了其他HAP类似物(J.Med.Chem.2016,59(16),7651-7666)。

来自于F.Hoffman-La Roche的HAP的一个亚类也显示出对抗HBV的活性(WO2014/184328、WO2015/132276和WO2016/146598)。来自于Sunshine Lake Pharma的相似亚类也显示出对抗HBV的活性(WO2015/144093)。其他HAP也已显示出具有对抗HBV的活性(WO2013/102655，Bioorg.Med.Chem.2017,25(3)pp.1042-1056)，并且来自于Enanta Therapeutics的相似亚类显示出类似的活性(WO2017/011552)。来自于Medshine Discovery的另一个亚类显示出类似的活性(WO2017/076286)。另一个亚类(Janssen Pharma)显示出类似的活性(WO2013/102655)。

哒嗪酮和三嗪酮的一个亚类(F.Hoffman-La Roche)也显示出对抗HBV的活性(WO2016/023877)，四氢吡啶并吡啶的一个亚类也是如此(WO2016/177655)。来自于Roche的三环4-吡啶酮-3-甲酸衍生物的一个亚类也显示出类似的抗HBV活性(WO2017/013046)。

来自于Novira Therapeutics(现在是Johnson&Johnson Inc.的一部分)的氨磺酰基-芳基酰胺的一个亚类也显示出对抗HBV的活性(WO2013/006394、WO2013/096744、WO2014/165128、WO2014/184365、WO2015/109130、WO2016/089990、WO2016/109663、WO2016/109684、WO2016/109689、WO2017/059059)。硫醚-芳基酰胺的相似亚类(也来自于NoviraTherapeutics)显示出对抗HBV的活性(WO2016/089990)。另外，芳基-氮杂环庚烷的一个亚类(也来自于Novira Therapeutics)显示出对抗HBV的活性(WO2015/073774)。来自于Enanta Therapeutics的芳基酰胺的一个亚类显示出对抗HBV的活性(WO2017/015451)。

也已显示来自于Janssen Pharma的氨磺酰基衍生物具有对抗HBV的活性(WO2014/033167；WO2014/033170；WO2017001655；J.Med.Chem,2018,61(14)6247-6260)。

也来自于Janssen Pharma的乙二酸单酰胺取代的吡咯酰胺衍生物的一个亚类也已被显示具有对抗HBV的活性(WO2015/011281)。类似的一类乙二酸单酰胺取代的吡咯酰胺(Gilead Sciences)也已被描述(WO2018/039531)。

来自于Enanta Therapeutics的氨磺酰基-和草酰基-杂联芳基的一个亚类也显示出对抗HBV的活性(WO2016/161268、WO2016/183266、WO2017/015451、WO2017/136403&US20170253609)。

来自于Assembly Biosciences的苯胺-嘧啶的一个亚类也显示出对抗HBV的活性(WO2015/057945、WO2015/172128)。来自于Assembly Biosciences的稠合三环的一个亚类(二苯并-硫氮杂环庚酮、二苯并-二氮杂环庚酮、二苯并-氧氮杂环庚酮)显示出对抗HBV的活性(WO2015/138895、WO2017/048950)。

Assembly Biosciences已描述了一系列环状磺酰胺作为HBV-CP功能的调节剂(WO2018/160878)。

Arbutus Biopharma已公开了用于HBV疗法的一系列苯甲酰胺(WO2018/052967、WO2018/172852)。

还已显示，小分子双-ANS充当分子“楔”并干扰正常衣壳蛋白的几何形状和衣壳形成(Zlotnick A等，J.Virol.2002,4848)。

直接作用于HBV的抗病毒药可能遇到的问题是毒性、诱变性、缺乏选择性、功效差、生物利用度差、溶解度低和合成困难。因此，对可以克服这些缺点中的至少一个或具有附加的优点例如效力提高或安全窗口增加的用于治疗、改善或预防HBV的其他抑制剂，存在着需求。

将此类治疗剂作为单一疗法或与其他HBV治疗或辅助治疗联合给药到HBV感染的患者，将导致病毒负荷显著降低、预后改善、疾病进展减小和/或血清转化率提高。

发明内容

本文提供了可用于在需要的对象中治疗或预防HBV感染的化合物以及在它们的制备中有用的中间体。本发明的主题内容是一种式I的化合物：

其中

-R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次；

-R2是H或甲基；

-R^a和R^b独立地选自C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C3-C6-环烷基、C3-C7-杂环烷基、C2-C6-羟基烷基和C2-C6-烷基-O-C1-C6-烷基，其任选地被各自独立地选自OH、卤素、羧基、C3-C7-杂环烷基、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-羟基烷基、C1-C6-烷基-O-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-O-C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷基-S-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-SO₂-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基和杂芳基的1、2或3个基团取代，其中芳基或杂芳基任选地被各自独立地选自卤素和C1-C6-烷基的1、2或3个基团取代；

-R^a和R^b任选地相连以形成C3-C7-杂环烷基环或由2或3个C3-C7环构成的杂螺环***，其任选地被选自OH、卤素、羧基、OCF₃、OCHF₂和C≡N的1、2或3个基团取代。

在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种根据式I所述的化合物，其中R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次。

在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种根据式I所述的化合物，其中R2选自H和甲基。

在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种根据式I所述的化合物，其中R^a和R^b独立地选自C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C3-C6-环烷基、C3-C7-杂环烷基、C2-C6-羟基烷基、C2-C6-烷基-O-C1-C6-烷基，其任选地被各自独立地选自OH、卤素、羧基、C3-C7-杂环烷基、C1-C6-烷基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-羟基烷基、C1-C6-烷基-O-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-O-C1-C6-卤代烷基、C1-C6-烷基-S-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-SO₂-C1-C6-烷基、C1-C6-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基和杂芳基的1、2或3个基团取代，其中芳基或杂芳基任选地被各自独立地选自卤素和C1-C6-烷基的1、2或3个基团取代。

在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种根据式I所述的化合物，其中R^a和R^b任选地相连以形成C3-C7-杂环烷基环或由2或3个C3-C7环构成的杂螺环***，其任选地被选自OH、卤素、羧基、OCF₃、OCHF₂和C≡N的1、2或3个基团取代。

本发明的一个实施方式是一种根据本发明所述的式I的化合物或其可药用盐，用于在对象中预防或治疗HBV感染。

本发明的一个实施方式是一种药物组合物，其包含根据本发明所述的式I的化合物或其可药用盐以及可药用载体。

本发明的一个实施方式是一种在需要的个体中治疗HBV感染的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据本发明所述的式I的化合物或其可药用盐。

本发明的另一个实施方式是一种根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐，其用于在需要的对象中预防或治疗HBV感染，

其中

-R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次；

-R2是H或甲基；

-R3是C1-C4烷基，所述C1-C4-烷基是未取代的或被氘、OH或卤素取代一次、两次或三次；

-R4选自C1-C2-烷基-O-C1-C4-烷基、C1-C2-羟基烷基、C1-C2-烷基-O-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-NH-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-S-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-SO₂-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基和杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被卤素或C1-C6烷基取代一次、两次或三次；

-R3和R4任选地相连以形成5、6或7员杂环，其中所述杂环是未取代的或被卤素、OH、羧基、OCF₃、OCHF₂或C≡N取代一次、两次或三次；

-X是O、CH₂或NR5；

-m是0、1、2或3；

-R5是H或C1-C4-烷基。

在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R2是H或甲基。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R3是C1-C4烷基，所述C1-C4-烷基是未取代的或被卤素或OH取代一次、两次或三次。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R4是C1-C2-烷基-O-C1-C4-烷基、C1-C2-羟基烷基、C1-C2-烷基-O-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-NH-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-S-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-SO₂-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基或杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被卤素或C1-C6烷基取代一次、两次或三次。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中X是O、CH₂或NR5。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R5是H或C1-C4-烷基。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中m是0、1、2或3。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R3和R4任选地相连以形成5、6或7员碳环或杂环，所述碳环或杂环是未取代的或被卤素、羧基、OH、OCF₃、OCHF₂或C≡N取代一次、两次或三次。

本发明的一个实施方式是一种根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐，其用于在对象中预防或治疗HBV感染。

本发明的一个实施方式是一种药物组合物，其包含根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐以及可药用载体。

本发明的一个实施方式是一种在需要的个体中治疗HBV感染的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐。

本发明的另一个实施方式是一种根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐，其用于在需要的对象中预防或治疗HBV感染，

其中

-R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次；

-R2是H或甲基；

-R3是C1-C4烷基，所述C1-C4-烷基是未取代的或被氘或卤素取代一次、两次或三次；

-R4选自C1-C2-烷基-O-C1-C4-烷基、C1-C2-羟基烷基、C1-C2-烷基-O-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-S-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-SO₂-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基和杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被卤素或C1-C6烷基取代一次、两次或三次；

-R3和R4任选地相连以形成5、6或7员杂环，其中所述杂环是未取代的或被卤素、OH、羧基、OCF₃、OCHF₂或C≡N取代一次、两次或三次；

-X是O、CH₂或NR5；

-m是0、1或2

-R5是H或C1-C4-烷基。

在一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R2是H或甲基。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R3是C1-C4烷基，所述C1-C4-烷基是未取代的或被卤素取代一次、两次或三次。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R4是C1-C2-烷基-O-C1-C4-烷基、C1-C2-羟基烷基、C1-C2-烷基-O-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-S-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-SO₂-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基或杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被卤素或C1-C6烷基取代一次、两次或三次。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中X是O、CH₂或NR5。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R5是H或C1-C4-烷基。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中m是0、1或2。

在本发明的一个实施方式中，本发明的主题内容是一种式II的化合物，其中R3和R4任选地相连以形成5、6或7员碳环或杂环，所述碳环或杂环是未取代的或被卤素、羧基、OH、OCF₃、OCHF₂或C≡N取代一次、两次或三次。

本发明的一个实施方式是一种根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐，其用于在对象中预防或治疗HBV感染。

本发明的一个实施方式是一种药物组合物，其包含根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐以及可药用载体。

本发明的一个实施方式是一种在需要的个体中治疗HBV感染的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据本发明所述的式II的化合物或其可药用盐。

在某些实施方式中，本发明的化合物的剂量为约1mg至约2,500mg。在某些实施方式中，在本文中描述的组合物中使用的本发明的化合物的剂量小于约10,000mg，或小于约8,000mg，或小于约6,000mg，或小于约5,000mg，或小于约3,000mg，或小于约2,000mg，或小于约1,000mg，或小于约500mg，或小于约200mg，或小于约50mg。同样地，在某些实施方式中，本文中所描述的第二化合物(即用于HBV治疗的另一种药物)的剂量小于约1,000mg，或小于约800mg，或小于约600mg，或小于约500mg，或小于约400mg，或小于约300mg，或小于约200mg，或小于约100mg，或小于约50mg，或小于约40mg，或小于约30mg，或小于约25mg，或小于约20mg，或小于约15mg，或小于约10mg，或小于约5mg，或小于约2mg，或小于约1mg，或小于约0.5mg，及其任何和所有的全部或部分增量。所有前述剂量都是指每位患者的每日剂量。

通常，设想了抗病毒有效的每日量为约0.01至约50mg/kg或约0.01至约30mg/kg体重。将所需的剂量在一天内以适当的时间间隔作为2、3、4或更多个分药剂给药，可能是适当的。所述分药剂可以被配制成单位剂型，例如每个单位剂型含有约1至约500mg或约1至约300mg或约1至约100mg或约2至约50mg的活性成分。

本发明的化合物取决于它们的结构，可能作为盐、溶剂化物或水合物存在。因此，本发明也涵盖所述盐、溶剂化物或水合物及其相应的混合物。

本发明的化合物取决于它们的结构，可能以互变异构或立体异构形式(对映异构体、非对映异构体)存在。因此，本发明也涵盖所述互变异构体、对映异构体或非对映异构体及其相应的混合物。立体异构均一的组成成分可以以已知的方式从此类对映异构体和/或非对映异构体的混合物分离。

定义

下面列出的是用于描述本发明的各种不同术语的定义。这些定义适用于在整个本说明书和权利要求书中使用的所述术语，除非在特定情况下单独地或作为较大组的一部分另有限制。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文中使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和肽化学中的实验室程序是本领域中公知且常用的。

当在本文中使用时，没有具体数目的指称是指一个或超过一个(即至少一个)指称物。例如，“元件”意味着一个元件或超过一个元件。此外，术语“包括”的使用不是限制性的。

当在本文中使用时，术语“衣壳组装调节剂”是指破坏或加速或抑制或阻碍或延迟或减少或修改正常衣壳组装(例如在成熟期间)或正常衣壳解体(例如在侵染期间)或扰乱衣壳稳定性，从而诱导异常衣壳形态或异常衣壳功能的化合物。在一个实施方式中，衣壳组装调节剂加速衣壳组装或解体，从而诱导异常衣壳形态。在另一个实施方式中，衣壳组装调节剂与主要衣壳组装蛋白(HBV-CP)相互作用(例如结合到活性位点处，结合到别构位点处，或修改和/或阻碍折叠等)，从而破坏衣壳组装或解体。在又一个实施方式中，衣壳组装调节剂引起HBV-CP的结构或功能的扰乱(例如HBV-CP组装、解体、结合到底物、折叠成适合的构象等的能力，其减弱病毒的侵染性和/或对病毒来说致死)。

当在本文中使用时，术语“治疗”被定义为向患者施用或给药治疗剂、即本发明的化合物(单独地或与另一种药剂相组合)，或向从具有HBV感染、HBV感染的症状或发生HBV感染的可能性的患者分离的组织或细胞系施用或给药治疗剂(例如用于诊断或离体应用)，其目的在于治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响所述HBV感染、HBV感染的症状或发发生HBV感染的可能性。此类治疗可以在从药物基因组学领域获得的知识的基础上具体定制或修改。

当在本文中使用时，术语“预防”意味着在没有障碍或疾病的情况下没有障碍或疾病的发展，或者在已存在障碍或疾病的发展的情况下没有所述障碍或疾病的进一步发展。还考虑到了阻止与所述障碍或疾病相关的某些或所有症状的能力。

当在本文中使用时，术语“患者”、“个体”或“对象”是指人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括例如家畜和宠物例如绵羊、牛、猪、猫和鼠类哺乳动物。优选地，所述患者、对象或个体是人类。

当在本文中使用时，术语“有效量”、“药物有效量”和“治疗有效量”是指药剂的无毒但足以提供所需生物学结果的量。该结果可能是疾病的体征、症状或病因的减轻和/或缓解，或生物***的任何其他所需改变。在任何个体病例中适合的治疗量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。

当在本文中使用时，术语“可药用的”是指不废除化合物的生物活性或性质，并且相对无毒的材料例如载体或稀释剂，即所述材料可以给药到个体，而不引起不想要的生物效应或不以有害的方式与包含它的组合物中的任何组分相互作用。

当在本文中使用时，术语“可药用盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中所述母体化合物通过将已有的酸或碱组成部分转变成其盐形式而被修饰。可药用盐的实例包括但不限于碱性残基例如胺的无机或有机酸盐、酸性残基例如羧酸的碱金属或有机盐等。本发明的可药用盐包括母体化合物的例如从无毒性无机或有机酸形成常规无毒性盐。本发明的可药用盐可以从含有碱性或酸性组成部分的母体化合物通过常规的化学方法来合成。通常，此类盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适合的碱或酸在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；通常优选的是非水性介质例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。适合的盐的名单可以在《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)第17版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985p.1418和Journal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)中找到，所述文献各自整体通过参考并入本文。

当在本文中使用时，术语“组合物”或“药物组合物”是指在本发明中有用的至少一种化合物与可药用载体的混合物。所述药物组合物便于所述化合物向患者或对象的给药。本领域中存在多种给药化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气溶胶、直肠、肠胃外、眼、肺和局部给药。

当在本文中使用时，术语“可药用载体”意味着制药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料，它们参与在本发明中有用的化合物在所述患者内或向所述患者的运载或运输，使其可以执行其目标功能。通常，将此类构建物从身体的一个器官或部位运载或运输到身体的另一个器官或部位。每种载体在与包括本发明中使用的化合物在内的剂型的其他成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以充当可药用载体的材料的一些实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄耆胶粉；麦芽、明胶、滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液，以及在药物剂型中使用的其他无毒相容性物质。

当在本文中使用时，“可药用载体”还包括与在本发明中有用的化合物的活性相容，并且对患者来说生理上可接受的任何和所有的包衣、抗细菌和抗真菌剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物也可并入到所述组合物中。“可药用载体”还可以包括在本发明中有用的化合物的可药用盐。可以包含在本发明的实践中使用的药物组合物中的其他附加成分在本领域中是已知的，并描述在例如通过参考并入本文的《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)(Genaro主编，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985)中。

当在本文中使用时，术语“取代的”意味着由原子或原子团代替氢作为附连到另一个基团的取代基。

当在本文中使用时，术语“包含”也涵盖选项“由……构成”。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意味着具有指定碳原子数(即C1-C6-烷基意味着1至6个碳原子)的直链或支链烃类，并包括直链和支链。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。此外，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分也可以意味着被C3-C5-碳环取代的C1-C3直链烃类。实例包括(环丙基)甲基、(环丁基)甲基和(环戊基)甲基。为避免疑问，在基团中存在两个烷基组成部分的情况下，所述烷基组成部分可以相同或不同。

当在本文中使用时，术语“烯基”是指源自于烃类组成部分的单价基团，其含有至少两个碳原子和至少一个E或Z立体化学的碳-碳双键。所述双键可以是或者可以不是附连到另一个基团的点。烯基(例如C2-C8-烯基)包括但不限于例如乙烯基、丙烯基、丙-1-烯-2-基、丁烯基、甲基-2-丁烯-1-基、庚烯基和辛烯基。为避免疑问，在基团中存在两个烯基组成部分的情况下，所述烷基组成部分可以相同或不同。

当在本文中使用时，C2-C6-炔基或组成部分是含有2至6个碳原子的直链或支链炔基或组成部分，例如含有2至4个碳原子的C2-C4炔基或组成部分。示例性炔基包括–C≡CH或-CH₂-C≡C以及1-和2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。为避免疑问，在基团中存在两个炔基组成部分的情况下，它们可以相同或不同。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则单独的或作为另一个取代基的一部分的术语“卤”或“卤素”意味着氟、氯、溴或碘原子，优选为氟、氯或溴，更优选为氟或氯。为避免疑问，在基团中存在两个卤素组成部分的情况下，它们可以相同或不同。

当在本文中使用时，C1-C6-烷氧基或C2-C6-烯基氧基通常是分别附连到氧原子的所述C1-C6-烷基(例如C1-C4烷基)或所述C2-C6-烯基(例如C2-C4烯基)。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则单独地或与其他术语相组合使用的术语“芳基”意味着含有一个或多个环(通常为1、2或3个环)的碳环芳香族***，其中这些环可以以侧基方式附连在一起，例如联苯，或者可以稠合，例如萘。芳基的实例包括苯基、蒽基和萘基。优选的实例是苯基(例如C6-芳基)和联苯基(例如C12-芳基)。在某些实施方式中，芳基具有6至16个碳原子。在某些实施方式中，芳基具有6至12个碳原子(例如C6-C12-芳基)。在某些实施方式中，芳基具有6个碳原子(例如C6-芳基)。

当在本文中使用时，术语“杂芳基”和“杂芳族”是指具有芳香族特点的含有一个或多个环(通常为1、2或3个环)的杂环。杂芳基取代基可以由碳原子数定义，例如Cl-C9-杂芳基指示了杂芳基中含有的不包括杂原子数的碳原子数。例如，C1-C9-杂芳基将包含另外1至4个杂原子。多环杂芳基可以包括一个或多个部分饱和的环。杂芳基的非限制性实例包括：

杂芳基的其他非限制性实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如3-和5-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-***基、l,2,4-***基、1,3,4-***基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,3,4-噻二唑和1,3,4-噁二唑基。多环杂环和杂芳基的非限制性实例包括吲哚基(包括3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、吲哚啉基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(包括例如1-和5-异喹啉基)、1,2,3,4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基(包括例如2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-萘啶基、1,4-苯并二噁烷基、香豆基、二氢香豆基、1,5-萘啶基、苯并呋喃基(包括例如3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2,3-二氢苯并呋喃基、1,2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(包括例如3-、4-、5-、6-和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如2-苯并咪唑基)、苯并***基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯双烷基(pyrrolizidinyl)和喹嗪烷基(quinolizidinyl)。

当在本文中使用时，术语“卤代烷基”通常分别是其中任一个或多个碳原子被一个或多个如上所定义的卤素原子取代的烷基、烯基、烷氧基或烯氧基。卤代烷基包含单卤代烷基、二卤代烷基和多卤代烷基游离基。术语“卤代烷基”包括但不限于氟甲基、1-氟乙基、二氟甲基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、二氟甲氧基和三氟甲氧基。

当在本文中使用时，C1-C6-羟基烷基是被一个或多个羟基取代的所述C1-C6烷基。通常，它被1、2或3个羟基取代。优选地，它被单个羟基取代。

当在本文中使用时，C1-C6-氨基烷基是被一个或多个氨基取代的C1-C6烷基。通常，它被1、2或3个氨基取代。优选地，它被单个氨基取代。

当在本文中使用时，C1-C4-羧基烷基是被羧基取代的所述C1-C4烷基。

当在本文中使用时，C1-C4-甲酰胺基烷基是被取代或未取代的甲酰胺基团取代的所述C1-C4烷基。

当在本文中使用时，C1-C4-酰基磺酰胺基-烷基是被通式为C(＝O)NHSO₂CH₃或C(＝O)NHSO₂-c-Pr的酰基磺酰胺基团取代的所述C1-C4烷基。

当在本文中使用时，术语“环烷基”是指其中形成环的每个原子(即骨架原子)是碳原子的单环或多环非芳香基团。在一个实施方式中，所述环烷基是饱和或部分不饱和的。在另一个实施方式中，所述环烷基与芳香环稠合。环烷基包括具有3至10个环原子的基团(C3-C10-环烷基)、具有3至8个环原子的基团(C3-C8-环烷基)、具有3至7个环原子的基团(C3-C7-环烷基)和具有3至6个环原子的基团(C3-C6-环烷基)。环烷基的说明性实例包括但不限于下述组成部分：

单环环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。二环环烷基包括但不限于四氢萘基、茚满基和四氢并环戊二烯。多环环烷基包括金刚烷和降莰烷。术语环烷基包括“不饱和非芳香碳环基”或“非芳香不饱和碳环基”，两者均是指含有至少一个碳-碳双键或一个碳-碳叁键的本文中所定义的非芳香碳环。

当在本文中使用时，术语“螺环”是指含有两个或更多个环的任何化合物，其中所述环中的两个环具有一个共同的环碳。

当在本文中使用时，术语“杂环烷基”和“杂环基”是指含有一个或多个环(通常为1、2或3个环)的杂脂环基团，其含有1至4个各自选自氧、硫和氮的环杂原子。在一个实施方式中，每个杂环基在其环***中具有3至10个原子，前提是所述基团的环不含两个相邻的氧或硫原子。在一个实施方式中，每个杂环基具有稠合的双环环***，在所述环***中具有3至10个原子，同样地前提是所述基团的环不含两个相邻的氧或硫原子。在一个实施方式中，每个杂环基具有桥接的双环环***，在所述环***中具有3至10个原子，同样地前提是所述基团的环不含两个相邻的氧或硫原子。在一个实施方式中，每个杂环基具有螺双环环***，在所述环***中具有3至10个原子，同样地前提是所述基团的环不含两个相邻的氧或硫原子。杂环基取代基也可以由碳原子的数目定义，例如C2-C8-杂环基指示所述杂环基中含有的不包括杂原子数的碳原子数。例如，C2-C8-杂环基将包括另外的1至4个杂原子。在另一个实施方式中，所述杂环烷基与芳香环稠合。在另一个实施方式中，所述杂环烷基与杂芳基环稠合。在一个实施方式中，所述氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且所述氮原子可以任选地被季铵化。除非另有陈述，否则所述杂环***可以在提供稳定结构的任何杂原子或碳原子处附连。3-员杂环基的实例包括但不限于氮杂环丙烷。4-员杂环烷基的实例包括但不限于氮杂环丁烷和β-内酰胺。5-员杂环基的实例包括但不限于吡咯烷、噁唑烷和噻唑烷二酮。6-员杂环烷基的实例包括但不限于哌啶、吗啉、哌嗪、N-乙酰基哌嗪和N-乙酰基吗啉。

杂环基的其他非限制性实例是

杂环的实例包括单环基团例如氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、吡唑烷、咪唑啉、二氧杂环戊烷、环丁砜、2,3-二氢呋喃、2,5-二氢呋喃、四氢呋喃、噻吩烷、哌啶、1,2,3,6-四氢吡啶、1,4-二氢吡啶、哌嗪、吗啉、硫吗啉、吡喃、2,3-二氢吡喃、四氢吡喃、1,4-二氧杂环己烷、1,3-二氧杂环己烷、1,3-二氧杂环戊烷、高哌嗪、高哌啶、1,3-二氧杂环庚烷、47-二氢-l,3-二氧杂环庚烷和氧杂环庚烷。术语“C3-C7-杂环烷基”包括但不限于四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、3-氧杂双环[3.1.0]己-6-基、3-氮杂双环[3.1.0]己-6-基、四氢吡喃-4-基、四氢吡喃-3-基、四氢吡喃-2-基和氮杂环丁-3-基。

当在本文中使用时，术语“芳香”是指具有一个或多个多不饱和环并具有芳香族特点，即具有(4n+2)个离域π(pi)电子的碳环或杂环，其中n是整数。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则单独地或与其他术语相组合使用的术语“酰基”意味着通过羰基连接的烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则单独地或与其他术语相组合使用的术语“氨甲酰基”和“取代的氨甲酰基”意味着连接到氨基的羰基，所述氨基任选地被氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基单或双取代。在某些实施方式中，所述氮取代基被连接以形成如上所定义的杂环基环。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则术语“羧基”本身或作为另一个取代基的一部分意味着式C(＝O)OH的基团。

当在本文中使用时，除非另有陈述，否则术语“羧酸酯”本身或作为另一个取代基的一部分意味着式C(＝O)OX的基团，其中X选自C1-C6-烷基、C3-C7-环烷基和芳基。

当在本文中使用时，术语“前体药物”表示式I或式II的化合物的衍生物，其以某种形式给药，使得在给药后其在体内被代谢成也是式I或式II的活性代谢物。

各种不同形式的前体药物在本领域中是已知的。对于此类前体药物的实例，参见：《前体药物的设计》(Design of Prodrugs)，H.Bundgaard主编，(Elsevier，1985)；和Methods in Enzymology，Vol.42,p.309-396，K.Widder等主编，(Academic Press，1985)；《药物设计和开发教本》(A Textbook of Drug Design and Development)，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard主编，第5章“前体药物的设计和应用”(Design and Application ofProdrugs)，H.Bundgaard，p.1l3-191(1991)；H.Bundgaard，Advanced Drug DeliveryReviews 8,1-38(1992)；H.Bundgaard等，Journal of Pharmaceutical Sciences，77,285(1988)；和N.Kakeya等，Chem.Pharm.Bull.，32，692(1984)。

前体药物的实例包括式I或式II的化合物的可切割的酯类。含有羧基的本发明的化合物的可体内切割的酯是例如在人类或动物体内切割以产生母体酸的可药用酯。对于羧基来说，适合的可药用酯包括C1-C6烷基酯，例如甲基或乙基酯；C1-C6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基酯；C1-C6酰氧基甲基酯；酞酸酯；C3-C8环烷氧基羰基氧基C1-C6烷基酯，例如1-环己基羰基氧基乙基；1-3-二氧杂环戊烷-2-基甲基酯，例如5-甲基-1,3-二氧杂环戊烷-2-基甲基；C1-C6烷氧基羰基氧基乙基酯，例如1-甲氧基羰基氧基乙基；氨基羰基甲基酯及其单-或二-N-(C1-C6烷基)形式，例如N,N-二甲基氨基羰基甲基酯和N-乙基氨基羰基甲基酯；并且可以在本发明的化合物中的任何羧基处形成。

含有羟基的本发明的化合物的可体内切割的酯是例如在人类或动物体内切割以产生母体羟基的可药用酯。对于羟基来说，适合的可药用酯包括C1-C6-酰基酯，例如乙酰基酯；和苯甲酰基酯，其中苯基可以被氨基甲基或N-取代的单-或二-C1-C6烷基氨基甲基取代，例如4-氨基甲基苯甲酰基酯和4-N,N-二甲基氨基甲基苯甲酰基酯。

本发明的优选前体药物包括乙酰氧基和碳酸酯衍生物。例如，式I或式II的化合物的羟基可以作为-O-CORⁱ或-O-C(O)ORⁱ存在于前体药物中，其中Rⁱ是未取代或取代的Cl-C4烷基。所述烷基上的取代基如较早时所定义。优选地，Rⁱ中的烷基是未取代的，优选为甲基、乙基、异丙基或环丙基。

本发明的其他优选前体药物包括氨基酸衍生物。适合的氨基酸包括通过其C(O)OH基团连接到式I或式II的化合物的α-氨基酸。此类前体药物在体内切割，以产生带有羟基的式I或式II的化合物。因此，此类氨基酸基团优选地使用在式I或式II的最终需要羟基的位置处。因此，本发明的这个实施方式的示例性前体药物是带有式-OC(O)-CH(NH₂)Rⁱⁱ的基团的式I或式II的化合物，其中Rⁱⁱ是氨基酸侧链。优选的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸。所述氨基酸也可以被官能化，例如所述氨基可以被烷基化。适合的官能化的氨基酸是N,N-二甲基甘氨酸。优选地，所述氨基酸是缬氨酸。

本发明的其他优选前体药物包括氨基磷酸酯衍生物。各种不同形式的氨基磷酸酯前体药物在本领域中是已知的。对于此类前体药物的实例，参见Serpi等，Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.2013，第15章第15.5节，和Mehellou等，ChemMedChem,2009,4pp.1779-1791。适合的氨基磷酸酯包括通过其-OH基团连接到式I或式II的化合物的(苯氧基)-α-氨基酸。此类前体药物在体内切割以产生带有羟基的式I或式II的化合物。因此，此类氨基磷酸酯优选地使用在式I或式II的最终需要羟基的位置处。因此，本发明的这个实施方式的示例性前体药物是带有式-OP(O)(ORⁱⁱⁱ)R^iv的基团的式I或式II的化合物，其中Rⁱⁱⁱ是烷基、环烷基、芳基或杂芳基，并且R^iv是式–NH-CH(R^v)C(O)OR^vi的基团，其中R^v是氨基酸侧链，并且R^vi是烷基、环烷基、芳基或杂环基。优选的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和丝氨酸。优选地，所述氨基酸是丙氨酸。R^v优选为烷基，最优选为异丙基。

本发明的主题内容还涉及一种制备本发明的化合物的方法。因此，本发明的主题内容是一种制备根据本发明所述的式I的化合物的方法，所述方法包括将式III的化合物

R1-N＝C＝O

III

其中R1如上所定义，

与式IV的化合物

其中R2、R^a和R^b如上所定义，

进行反应。

具体实施方式

实施例

现在，参考下面的实施例来描述本发明。提供这些实施例仅仅是出于说明的目的，本发明不限于这些实施例，而是涵盖了作为本文中提供的教授的结果显而易见的所有变化形式。

HBV核心蛋白调节剂可以以多种方式制备。出于本申请的目的，反应路线1和2示出了用于它们的制备的主要路线。对于本领域的专业化学家来说，显然存在着也可实现这些中间体和实施例的制备的其他方法。

反应路线1：式I的化合物的合成

在步骤1中，使用文献中已知的方法(A.El-Faham,F.Albericio,Chem.Rev.2011,111,6557-6602)，例如使用HATU将反应路线1中描述的化合物1与胺偶联，给出具有通用结构2的化合物。在步骤2中，将反应路线1中化合物2的被画为Boc但不限于此的氮保护基团用例如HCl去保护(WO2018/011162，A.Isidro-Llobet等，Chem.Rev.,2009,109,2455-2504)，给出通用结构3的胺。在步骤3中，使用文献中公知的方法(Pearson,A.J.，Roush,W.R.，有机合成试剂手册，活化剂和保护基团(Handbook of Reagents for Organic Synthesis,Activating Agents and Protecting Groups))，例如使用异氰酸苯酯进行脲形成，产生式I的化合物。

反应路线2：式I的化合物的合成

在步骤1中，使用文献中公知的方法(Pearson,A.J.，Roush,W.R.，有机合成试剂手册，活化剂和保护基团(Handbook of Reagents for Organic Synthesis,ActivatingAgents and Protecting Groups))，例如使用异氰酸苯酯将反应路线2中描述的化合物1转化成通用结构2的脲。在步骤2中，使用文献中已知的方法，例如使用LiOH(WO2015/0133428)将化合物2的酯基水解，给出通用结构3的羧酸。在步骤3中，使用文献中已知的方法(A.El-Faham,F.Albericio,Chem.Rev.2011,111,6557-6602)例如使用HATU进行酰胺偶联，产生式I的化合物。

下面的实施例说明了本发明的某些特定化合物的制备和性质。

使用下述缩略语：

A-DNA碱基腺嘌呤

ACN–乙腈

Ar-氩气

BODIPY-FL-4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-对称引达省-3-丙酸(荧光染料)

Boc-叔丁氧基羰基

BnOH–苯甲醇

n-BuLi–正丁基锂

t-BuLi–叔丁基锂

C-DNA碱基胞嘧啶

CC₅₀-半最高细胞毒性浓度

CO₂-二氧化碳

CuCN-氰化亚铜(I)

DCE-二氯乙烷

DCM-二氯甲烷

Dess-Martin氧化剂-1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-苯并碘氧杂环戊-3(1H)-酮

DIPEA-二异丙基乙胺

DIPE-二异丙基醚

DMAP-4-二甲基氨基吡啶

DMF–N,N-二甲基甲酰胺

DMP-Dess-Martin氧化剂

DMSO-二甲基亚砜

DNA-脱氧核糖核酸

DPPA–二苯基磷酰基叠氮化物

DTT-二硫苏糖醇

EC₅₀-半最高有效浓度

EDCI-N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐

Et₂O-二***

EtOAc-乙酸乙酯

EtOH-乙醇

FL--用荧光素标记的5'末端

NEt₃-三乙胺

ELS-蒸发光散射

g-克

G-DNA碱基鸟嘌呤

HBV-乙型肝炎病毒

HATU-2-(1H-7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲

HCl-盐酸

HEPES-4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HOAt-1-羟基-7-氮杂苯并***

HOBt-1-羟基苯并***

HPLC–高效液相色谱

IC₅₀-半最高抑制浓度

LC640--使用荧光染料

Red 640的3'末端修饰

LC/MS-液相色谱/质谱术

LiAlH₄-氢化铝锂

LiOH-氢氧化锂

MeOH–甲醇

MeCN-乙腈

MgSO₄-硫酸镁

mg-毫克

min-分钟

mol-摩尔

mmol-毫摩尔

mL-毫升

MTBE–甲基叔丁基醚

N₂-氮气

Na₂CO₃-碳酸钠

NaHCO₃-碳酸氢钠

Na₂SO₄-硫酸钠

NdeI-识别CA^TATG位点的限制性酶

NEt₃-三乙胺

NaH-氢化钠

NaOH-氢氧化钠

NH₃-氨

NH₄Cl-氯化铵

NMR-核磁共振

PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR-聚合酶链反应

qPCR–定量PCR

Pd/C-碳载钯

-PH-3'末端磷酸修饰

pTSA-4-甲苯磺酸

Rt-保留时间

r.t.-室温

sat.-饱和水溶液

SDS-十二烷基硫酸钠

SI-选择性指数(＝CC₅₀/EC₅₀)

STAB-三乙酰氧基硼氢化钠

T-DNA碱基胸腺嘧啶

TBAF-四丁基氟化铵

TFA-三氟乙酸

THF-四氢呋喃

TLC-薄层层析

Tris-三(羟基甲基)-氨基甲烷

XhoI-识别C^TCGAG位点的限制性酶

化合物鉴定-NMR

对于许多化合物来说，使用装备有5mm反向三重共振探头的Bruker DPX400波谱仪记录NMR波谱，对于质子来说在400MHz下运行，对于碳来说在100MHz下运行。氘化溶剂是氯仿-d(氘代氯仿，CDCl₃)或d6-DMSO(氘代DMSO，d6-二甲基亚砜)。化学位移相对于用作内标的四甲基甲硅烷(TMS)以百万分率(ppm)为单位报告。

化合物鉴定–HPLC/MS

对于许多化合物来说，使用下述分析方法记录LC-MS波谱。

方法A

柱-反相Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，3.5微米)

流速-0.8mL/min，25摄氏度

洗脱剂A–95％乙腈+5％10mM碳酸铵水溶液(pH 9)

洗脱剂B–10mM碳酸铵水溶液(pH 9)

线性梯度t＝0min 5％A，t＝3.5min 98％A，t＝6min 98％A

方法A2

柱-反相Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，3.5微米)

流速-0.8mL/min，25摄氏度

洗脱剂A–95％乙腈+5％10mM碳酸铵水溶液(pH 9)

洗脱剂B–10mM碳酸铵水溶液(pH 9)

线性梯度t＝0min 5％A，t＝4.5min 98％A，t＝6min 98％A

方法B

柱-反相Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，3.5微米)

流速-0.8mL/min，35摄氏度

洗脱剂A–0.1％甲酸的乙腈溶液

洗脱剂B–0.1％甲酸水溶液

线性梯度t＝0min 5％A，t＝3.5min 98％A.t＝6min 98％A

方法B2

柱-反相Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，3.5微米)

流速-0.8mL/min，40摄氏度

洗脱剂A–0.1％甲酸的乙腈溶液

洗脱剂B–0.1％甲酸水溶液

线性梯度t＝0min 5％A，t＝4.5min 98％A.t＝6min 98％A

方法C

柱-反相Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，3.5微米)

流速-1mL/min，35摄氏度

洗脱剂A–0.1％甲酸的乙腈溶液

洗脱剂B–0.1％甲酸水溶液

线性梯度t＝0min 5％A，t＝1.6min 98％A.t＝3min 98％A

方法D

柱-Phenomenex Gemini NX C18(50x2.0mm，3.0微米)

流速-0.8mL/min，35摄氏度

洗脱剂A–95％乙腈+5％10mM碳酸氢铵水溶液

洗脱剂B–10mM碳酸氢铵水溶液，pH＝9.0

线性梯度t＝0min 5％A，t＝3.5min 98％A.t＝6min 98％A

方法E

柱-Phenomenex Gemini NX C18(50x2.0mm，3.0微米)

流速–0.8mL/min，25摄氏度

洗脱剂A–95％乙腈+5％10mM碳酸氢铵水溶液

洗脱剂B–10mM碳酸氢铵水溶液(pH 9)

线性梯度t＝0min 5％A，t＝3.5min 30％A，t＝7min 98％A，t＝10min 98％A

方法F

柱-Waters XSelect HSS C18(150x4.6mm，3.5微米)

流速–1.0mL/min，25摄氏度

洗脱剂A–0.1％TFA的乙腈溶液

洗脱剂B–0.1％TFA水溶液

线性梯度t＝0min 2％A，t＝1min 2％A，t＝15min 60％A，t＝20min60％A

方法G

柱-Zorbax SB-C18 1.8μm 4.6x15mm快速分离柱(PN 821975-932)

流速-3mL/min

洗脱剂A–0.1％甲酸的乙腈溶液

洗脱剂B–0.1％甲酸水溶液

线性梯度t＝0min 0％A，t＝1.8min 100％A

方法H

柱-Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，2.5微米)

流速–0.6mL/min

洗脱剂A–0.1％甲酸的乙腈溶液

洗脱剂B–0.1％甲酸水溶液

线性梯度t＝0min 5％A，t＝2.0min 98％A，t＝2.7min 98％A

方法J

柱-反相Waters Xselect CSH C18(50x2.1mm，2.5微米)

流速–0.6mL/min

洗脱剂A–100％乙腈

洗脱剂B–10mM碳酸氢铵水溶液(pH 7.9)

线性梯度t＝0min 5％A，t＝2.0min 98％A，t＝2.7min 98％A

6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷的制备

步骤1：向琥珀酸酐(100g，1000mmol)在甲苯(3000mL)中的溶液添加苯甲胺(107g，1000mmol)。将溶液在室温搅拌24h，然后使用Dean–Stark装置加热回流16小时。然后将混合物在减压下浓缩，给出1-苯甲基吡咯烷-2,5-二酮(170g，900mmol，90％得率)。

步骤2：在氩气气氛下，向1-苯甲基吡咯烷-2,5-二酮(114g，600mmol)和Ti(Oi-Pr)₄(170.5g，600mmol)在无水THF(2000mL)中的冷却(0℃)的混合物逐滴添加乙基溴化镁在THF中的3.4M溶液(1200mmol)。将混合物升温至室温并搅拌4h。然后逐滴添加BF₃.Et₂O(170g，1200mmol)并将溶液搅拌6h。将混合物冷却(0℃)，并添加3N盐酸(500mL)。将混合物用Et₂O萃取两次，并将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥并在减压下浓缩，给出4-苯甲基-4-氮杂螺[2.4]庚-5-酮(30.2g，150mmol，25％得率)。

步骤3：在氩气下向4-苯甲基-4-氮杂螺[2.4]庚-5-酮(34.2g，170mmol)在无水THF(1000mL)中的冷却(-78℃)的溶液添加THF中的LiHMDS(1.1M溶液，240mmol)。将混合物搅拌1h，然后逐滴添加N-氟苯磺酰胺(75.7g，240mmol)在THF(200mL)中的溶液。将混合物升温至室温并搅拌6h。然后将混合物重新冷却(-78℃)并添加LiHMDS(在THF中的1.1M溶液，240mmol)。

将溶液搅拌1h，然后逐滴添加THF(200mL)中的N-氟苯磺酰胺(75.7g，240mmol)。将混合物升温至室温并搅拌6h。将混合物倾倒在NH₄Cl饱和溶液(300mL)中，并用Et₂O萃取两次。将合并的有机萃取物用盐水洗涤并在减压下浓缩。将产物通过柱层析进行纯化，提供4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚-5-酮(18g，75.9mmol，45％得率)。

步骤4：向BH₃.Me₂S(3.42g，45mmol)在THF(200mL)中的加温(40℃)的溶液逐滴添加4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚-5-酮(11.9g，50mmol)。将混合物在40℃搅拌24h，然后冷却至室温。逐滴添加水(50mL)，并将混合物用Et₂O萃取(2×200mL)。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，用HCl在二氧杂环己烷中的10％溶液(50mL)稀释并在减压下蒸发，给出4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷(3g，13.4mmol，27％得率)。

步骤5：将甲醇(500mL)中的4-苯甲基-6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷(2.68g，12mmol)和氢氧化钯(0.5g)在氢气气氛下在室温搅拌24h。将混合物过滤，然后将滤液在减压下浓缩，得到6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷(0.8g，6.01mmol，50％得率)。

7,7-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷的制备

步骤1：在30分钟内向1-苯甲基吡咯烷-2,3-二酮(8g，42.3mmol)在DCM(100mL)中的冷却(0℃)的溶液逐滴添加DAST(20.4g，127mmol)。将混合物在室温搅拌过夜，然后通过逐滴添加饱和NaHCO₃进行淬灭。分离有机层，并将水性级分用DCM萃取两次(2×50mL)。将合并的有机层在Na₂SO₄上干燥并在减压下浓缩，得到1-苯甲基-3,3-二氟吡咯烷-2-酮(26.0mmol，61％得率)，其不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤2：在氩气气氛下向粗品1-苯甲基-3,3-二氟吡咯烷-2-酮(5.5g，26mmol)和Ti(Oi-Pr)₄(23.4mL,78mmol)在THF(300mL)中的溶液逐滴添加EtMgBr在2-MeTHF中的3.4M溶液(45.8mL，156mmol)。在搅拌12h后，添加水(10mL)以获得白色沉淀物。将所述沉淀物用MTBE洗涤(3×50mL)。将合并的有机级分在Na₂SO₄上干燥，浓缩，并通过快速层析进行纯化(己烷-EtOAc 9:1)，得到作为浅黄色油状物的4-苯甲基-7,7-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷(1.3g，5.82mmol，22％得率)。

步骤3：将4-苯甲基-7,7-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷(0.55g，2.46mmol)溶解在CHCl₃(1mL)和MeOH(20mL)的溶液中，并添加Pd/C(0.2g，10％)。将该混合物在氢气气氛下搅拌5h，然后过滤。将滤液浓缩，给出7,7-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷(0.164g，1.23mmol，50％得率)。

1-[(二氟甲氧基)甲基]-N-甲基环丙-1-胺的合成

步骤1：在氢气气氛下向1-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)环丙烷-1-甲酸甲酯(1.05g，4.58mmol)在无水THF(5mL)中的溶液添加硼氢化锂(1.259mL，4M，在THF中，5.04mmol)。将混合物在rt搅拌4天。添加硫酸钠和水，将混合物在硫酸钠垫上过滤，将所述垫用二氯甲烷冲洗。将滤液浓缩，给出作为白色固体的(1-(羟基甲基)环丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.904g，95％得率)。

步骤2：向(1-(羟基甲基)环丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.100g，0.497mmol)和(溴二氟甲基)三甲基甲硅烷(0.155mL，0.994mmol)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液添加一滴乙酸钾(0.195g，1.987mmol)在水(0.5mL)中的溶液。将混合物搅拌40h。将混合物用二氯甲烷和水稀释，分离有机层并浓缩。通过快速层析进行纯化(庚烷中的20％乙酸乙酯)，给出作为无色油状物的N-{1[(二氟甲氧基)甲基]环丙基}-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(0.058g，46％得率)。

步骤3：向(1-((二氟甲氧基)甲基)环丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.058g，0.231mmol)添加二氧杂环己烷中的HCl(4M溶液，2mL，8.00mmol)。将混合物在rt搅拌30min，然后浓缩，得到所需产物，其不需进一步纯化直接使用。

LC-MS:m/z 152.2(M+H)+

3-{甲基[1-(吡啶-3-基)环丙基]氨甲酰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯的合成

步骤1：向1-(吡啶-3-基)环丙烷-1-甲酸盐酸盐(498.46mg，2.5mmol)在甲苯(30mL)与t-BuOH(10mL)的混合物中的溶液添加二苯基磷酰基叠氮化物(687.14mg，2.5mmol)和三乙胺(631.62mg，6.24mmol，870.0μl)。将反应混合物加热回流过夜。将反应混合物冷却并过滤。将滤液用水(3x10mL)洗涤，在Na₂SO₄上干燥并在真空中浓缩，给出作为浅棕色油状物的N-[1-(吡啶-3-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(250.0mg，95.0％纯度，1.01mmol，40.6％得率)。

步骤2：将氢化钠(154.24mg，6.43mmol)悬浮在无水DMF(5mL)中，然后冷却至0℃。逐滴添加N-[1-(吡啶-3-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(1.51g，6.43mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液。将得到的混合物搅拌，直至气体产生停止。在相同温度下逐滴添加碘代甲烷(1.0g，7.07mmol，440.0μl)；将得到的混合物升温至r.t.，然后搅拌过夜。在起始原料耗尽后(¹HNMR控制)，将反应混合物倾倒在水中。将得到的混合物用MTBE萃取两次(2x50mL)。将有机相合并，用水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩，给出N-甲基-N-[1-(吡啶-3-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(1.1g，4.43mmol，68.9％得率)。所述产物不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤3：向N-甲基-N-[1-(吡啶-3-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(1.1g，4.43mmol)在甲醇(10mL)中的溶液添加二氧杂环己烷中的4MHCl溶液(2mL)。将得到的溶液在25℃搅拌12h。在反应完成(通过¹H NMR或LCMS监测)，将反应混合物在减压下浓缩。将产物用MTBE研磨并通过过滤收集，然后在40℃真空干燥，给出N-甲基-1-(吡啶-3-基)环丙-1-胺二盐酸盐(900.0mg，95.0％纯度，3.87mmol，87.2％得率)。

步骤4：向N-甲基-1-(吡啶-3-基)环丙-1-胺二盐酸盐(398.89mg，1.8mmol)和5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(482.15mg，1.8mmol)在DMF(2mL)中的搅拌的溶液添加HATU(891.67mg，2.35mmol)和三乙胺(638.88mg，6.31mmol，880.0μl)。将混合物在r.t.搅拌过夜，然后倾倒在水中并用MTBE萃取(2x15mL)。将合并的有机级分用水洗涤三次，在无水硫酸钠上干燥，并在真空中除去溶剂。将粗产物通过HPLC进行纯化，给出3-甲基[1-(吡啶-3-基)环丙基]氨甲酰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(230.0mg，82.0％纯度，474.5μmol，26.3％得率)。

¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ1.41(m,2H),1.43(s,9H),1.56(m,2H),3.07(m,3H),3.82(m,2H),4.07(m,2H),4.75(m,2H),6.99(m,1H),7.37(m,1H),7.48(d,1H),8.31(s,1H),8.44(s,1H)。

LCMS:m/z 398.2

3-{甲基[1-(吡啶-4-基)环丙基]氨甲酰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯的合成

步骤1：将2-(吡啶-4-基)乙酸盐酸盐(5.0g，28.8mmol)溶解在MeOH(20mL)中，然后添加H₂SO₄(0.5mL)。将反应混合物在85℃加热过夜。除去MeOH以给出残留物，将其小心地用饱和NaHCO₃水溶液中和，然后用EtOAc萃取(3×100mL)。将有机萃取物合并，干燥并浓缩，给出作为黄色油状物的2-(吡啶-4-基)乙酸甲酯(4.0g，95.0％纯度，25.14mmol，87.3％得率)，其不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤2：将2-(吡啶-4-基)乙酸甲酯(4.0g，26.46mmol)溶解在DMF(5mL)中，并逐滴添加到氢化钠(825.52mg，34.4mmol)在DMF(5mL)中的冷却(0℃)的悬液。将得到的混合物在0℃搅拌30min，然后在相同温度下用1,2-二溴乙烷(6.46g，34.4mmol)处理。将反应混合物在r.t.搅拌12h。然后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用水和盐水洗涤。分离有机相，在Na₂SO₄上干燥并过滤；将滤液浓缩。将得到的油状物用己烷研磨，给出作为固体的1-(吡啶-4-基)环丙烷-1-甲酸甲酯(2.3g，12.98mmol，49.1％得率)。

步骤3：将1-(吡啶-4-基)环丙烷-1-甲酸甲酯(2.3g，12.98mmol)溶解在MeOH(20mL)中，向其添加氢氧化钠(778.67mg，19.47mmol)在水(20mL)中的溶液。将混合物在20℃搅拌20h。通过蒸发除去MeOH，并将水性残留物在冰冷却下用盐酸中和(至pH 7)。将混合物浓缩至干，将残留物用CHCl₃研磨三次，并将合并的滤液浓缩至干，给出1-(吡啶-4-基)环丙烷-1-甲酸盐酸盐(2.0g，10.02mmol，77.2％得率)。

步骤4：向1-(吡啶-4-基)环丙烷-1-甲酸(599.43mg，3.67mmol)在甲苯(30mL)与t-BuOH(10mL)的混合物中的溶液添加二苯基磷酰基叠氮化物(1.01g，3.67mmol)和三乙胺(929.28mg，9.18mmol，1.28mL)。将反应混合物回流过夜，然后冷却并过滤。将滤液用水洗涤(3x10mL)，在Na₂SO₄上干燥并浓缩，给出作为浅棕色油状物的N-[1-(吡啶-4-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(300.0mg，1.28mmol，34.9％得率)。所述产物不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤5：将氢化钠(94.22mg，3.93mmol)悬浮在DMF(5mL)中，然后冷却至0℃。然后逐滴添加N-[1-(吡啶-4-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(919.93mg，3.93mmol)在DMF(5mL)中的溶液。将得到的混合物搅拌直至气体产生停止。在相同温度下逐滴添加碘代甲烷(613.04mg，4.32mmol)；将得到的混合物升温至r.t.，然后搅拌过夜。在起始原料耗尽后(¹HNMR控制)，将反应混合物倾倒在水中。将混合物用MTBE(50mL)萃取两次。将有机相合并，用水洗涤，在硫酸钠上干燥并浓缩，给出N-甲基-N-[1-(吡啶-4-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(900.0mg，98.0％纯度，3.55mmol，90.5％得率)。所述产物不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤6：向N-甲基-N-[1-(吡啶-4-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(900.0mg，3.62mmol)在甲醇(10mL)中的溶液添加二氧杂环己烷中的4MHCl(2mL)，并将得到的溶液在25℃搅拌12h。在反应完成后(通过¹H NMR监测)，将反应混合物在减压下浓缩。将产物用MTBE处理并通过过滤收集，然后在40℃真空干燥，给出N-甲基-1-(吡啶-4-基)环丙-1-胺二盐酸盐(600.0mg，2.71mmol，74.9％得率)。

步骤7：向N-甲基-1-(吡啶-4-基)环丙-1-胺二盐酸盐(600.0mg，2.71mmol)和5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(724.91mg，2.71mmol)在DMF(5mL)中的搅拌的溶液添加HATU(1.34g，3.53mmol)和三乙胺(960.55mg，9.49mmol，1.32mL)。将混合物在r.t.搅拌过夜，然后倾倒在水中并用MTBE萃取(3x15mL)。将合并的有机级分用水洗涤三次，在无水硫酸钠上干燥并浓缩。将粗产物通过HPLC进行纯化，给出3-甲基[1-(吡啶-4-基)环丙基]氨甲酰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(169.0mg，425.19μmol，15.7％得率)。

¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ1.38(m,1H),1.44(s,9H),1.60(m,3H),3.03(m,3H),3.71(m,1H),3.84(m,1H),4.06(m,2H),4.75(m,2H),6.92(m,1H),7.07(m,2H),8.52(m,2H)。

LCMS:m/z 398.4

3-{甲基[1-(嘧啶-2-基)环丙基]氨甲酰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯的合成

步骤1：向1-(嘧啶-2-基)环丙-1-胺盐酸盐(996.43mg，5.81mmol)在无水DCM(30mL)中的冷却(0℃)的悬液添加二碳酸二叔丁酯(1.27g，5.81mmol)。然后逐滴添加三乙胺(646.14mg，6.39mmol，890.0μl)。将反应混合物在r.t搅拌过夜并用水(5mL)稀释。分离有机相，用水洗涤，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩，得到作为浅黄色固体的N-[1-(嘧啶-2-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(1.17g，4.97mmol，85.7％得率)。

步骤2：向n-[1-(嘧啶-2-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(499.99mg，2.13mmol)在无水DMF(4mL)中的搅拌的溶液添加氢化钠(127.49mg，5.31mmol)。将反应混合物在r.t搅拌1h，然后冷却至0℃。添加碘代甲烷(603.26mg，4.25mmol)。将混合物在r.t搅拌过夜。将混合物倾倒在盐水中；然后用EtOAc(2x10mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩，得到作为黄色固体的N-甲基-N-[1-(嘧啶-2-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(400.0mg，1.6mmol，75.5％得率)。

步骤3：向N-甲基-N-[1-(嘧啶-2-基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(400.0mg，1.6mmol)在无水DCM(5mL)中的搅拌的溶液添加二氧杂环己烷中的4M HCl(2mL，8mmol)。将反应混合物在r.t搅拌5h。将混合物浓缩，将残留物用己烷研磨并过滤出来，得到作为灰色固体的N-甲基-1-(嘧啶-2-基)环丙-1-胺盐酸盐(280.0mg，1.51mmol，94％得率)。

步骤4：向HATU(573.46mg，1.51mmol)和5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(403.11mg，1.51mmol)在DMF(3mL)中的冷却(0℃)的溶液相继逐滴添加N-甲基-1-(嘧啶-2-基)环丙-1-胺盐酸盐(280.0mg，1.51mmol)和N,N-二异丙基乙胺(779.69mg，6.03mmol)。将反应混合物在r.t.搅拌过夜并用盐水稀释。将混合物用EtOAc萃取(2x10mL)，将合并的有机相用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥并浓缩。将残留物通过HPLC进行纯化，给出作为黄色固体的3-甲基[1-(嘧啶-2-基)环丙基]氨甲酰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(332.9mg，835.47μmol，55.4％得率)。

¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ1.43(s,9H),1.57(m,2H),1.89(m,1H),3.31(m,2H),3.71(m,1H),3.83(m,2H),4.03(m,2H),4.12(m,1H),4.69(m,1H),4.78(m,1H),6.78(s,1H),7.36(t,1H),8.78(d,2H)。

LCMS:m/z 399.2

3-[(1-{[(2,2-二氟乙基)氨基]甲基}环丙基)(甲基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯的合成

步骤1：在r.t.下向N-[1-(羟基甲基)环丙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(2.25g，11.18mmol)在无水DCM(30mL)中的搅拌的溶液分部添加1,1,1-三(乙酰氧基)-1,1-二氢-1,2-苯并碘氧杂环戊-3(1H)-酮(4.74g，11.18mmol)。将反应混合物在r.t搅拌1h，然后冷却至0℃。然后逐滴添加氢氧化钠(2.01g，50.3mmol)在水(5mL)中的溶液，并将混合物在r.t搅拌15min。分离有机相，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩，得到作为黄色油状物的N-(1-甲酰基环丙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(2.2g，11.04mmol，98.8％得率)。

步骤2：向N-(1-甲酰基环丙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(2.2g，11.04mmol)在无水DCM(50mL)中的搅拌的溶液添加苯基甲胺(1.18g，11.04mmol)。将混合物在r.t搅拌5h。向冷却的反应混合物一次性添加双(乙酰氧基)硼氢基乙酸钠(7.02g，33.12mmol)并继续搅拌5h。将混合物冷却至0℃并添加15％NaOH水溶液(20mL)。将混合物搅拌30min并分离有机相，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩，得到作为黄色油状物的N-1-[(苯甲基氨基)甲基]环丙基-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(2.75g，85％得率)。

步骤3：向N-1-[(苯甲基氨基)甲基]环丙基-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(1.75g，6.02mmol)在无水乙腈(10mL)中的搅拌、冷却(0℃)的溶液添加碳酸钾(1.67g，12.05mmol)，然后逐滴添加三氟甲磺酸2,2-二氟乙基酯(1.68g，7.83mmol)。将反应混合物升温至r.t.并搅拌过夜。将混合物倾倒在水(30mL)中并用DCM(3x10mL)萃取。将合并的有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。将残留物通过快速柱层析在硅胶进行纯化，使用己烷-MTBE(4:1)作为洗脱剂，得到作为无色油状物的N-(1-[苯甲基(2,2-二氟乙基)氨基]甲基环丙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(900.0mg，2.54mmol，42.2％得率)。

步骤4：向N-(1-[苯甲基(2,2-二氟乙基)氨基]甲基环丙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(199.9mg，564.0μmol)在CH₂Cl₂(3mL)中的溶液添加二氧杂环己烷中的4M HCl(1mL)。将得到的溶液在r.t.搅拌12h，然后浓缩。将残留物用己烷研磨并通过过滤收集，给出作为白色固体的1-[苯甲基(2,2-二氟乙基)氨基]甲基-N-甲基环丙-1-胺二盐酸盐(156.0mg，95.1％得率)。

步骤5：向1-[苯甲基(2,2-二氟乙基)氨基]甲基-N-甲基环丙-1-胺二盐酸盐(155.96mg，476.58μmol)和[(二甲基氨基)(3H-[1,2,3]***并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亚甲基]二甲基铵六氟-λ5-磷酸盐(181.21mg，476.58μmol)在DMF(2mL)中的搅拌的溶液添加三乙胺(241.13mg，2.38mmol)。将混合物在r.t搅拌15mins。添加5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(127.38mg，476.58μmol)，并将反应在r.t.搅拌24h，然后用盐水稀释。将混合物用EtOAc(2x20mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩，得到作为棕色油状物的粗品3-[(1-[苯甲基(2,2-二氟乙基)氨基]甲基环丙基)(甲基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(200.0mg，397.15μmol，83.3％得率)，其不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤6：向3-[(1-[苯甲基(2,2-二氟乙基)氨基]甲基环丙基)(甲基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(200.0mg，397.15μmol)在MeOH(5mL)中的搅拌的溶液添加碳载钯(10％，0.05g)。将混合物在氢气(气球)下在r.t搅拌48h。将混合物用氮气吹扫，然后过滤，并将滤液浓缩。将残留物通过HPLC进行纯化，给出作为无色油状物的3-[(1-[(2,2二氟乙基)氨基]甲基环丙基)(甲基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(70.0mg，42.7％得率)。

¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ0.76(m,3H),1.43(s,9H),2.26(m,1H),2.90(m,4H),3.05(s,3H),3.80(s,2H),4.10(d,2H),4.71(s,2H),5.96(tt,1H),7.84(s,1H)。

LCMS:m/z 414.1

3-[甲基(1-{[(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基}环丙基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯的合成

步骤1：向N-1-[(苯甲基氨基)甲基]环丙基-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(537.25mg，1.85mmol)在无水乙腈(10mL)中的搅拌的溶液添加碳酸钾(767.06mg，5.55mmol)，然后是三氟甲磺酸2,2,2-三氟乙基酯(644.56mg，2.78mmol，400.0μl)。将反应混合物在80℃搅拌过夜。然后将混合物冷却，浓缩，并将得到的残留物溶解在DCM(10mL)中。将有机相用水(3mL)洗涤，在Na₂SO₄上干燥并浓缩。将残留物通过快速柱层析进行纯化(己烷-MTBE 10:1)，得到作为无色油状物的N-(1-[苯甲基(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基环丙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(410.0mg，1.1mmol，59.5％得率)。

步骤2：向N-(1-[苯甲基(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基环丙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(410.0mg，1.1mmol)在DCM(5mL)中的搅拌的溶液添加二氧杂环己烷中的4M HCl(3mL，12mmol)。将得到的混合物搅拌过夜，然后蒸发至干，给出作为黄色油状物的1-[苯甲基(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基-N-甲基环丙-1-胺二盐酸盐(330.0mg，955.88μmol，86.8％得率)。

步骤3：向HATU(381.96mg，1.0mmol)在DMF(3mL)中的溶液添加三乙胺(484.05mg，4.78mmol)和5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(255.71mg，956.72μmol)。将反应混合物在r.t搅拌30mins，然后添加1-[苯甲基(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基-N-甲基环丙-1-胺二盐酸盐(330.29mg，956.72μmol)在DMF(1mL)中的溶液。将反应混合物在r.t.搅拌过夜并倾倒在水(5mL)中。将混合物用EtOAc(2x5mL)萃取。将合并的有机相用水、aq.NaHCO₃洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩，得到作为棕色油状物的粗品3-[(1-[苯甲基(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基环丙基)(甲基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(600.0mg，77.0％纯度，885.78μmol，92.6％得率)，其其不需进一步纯化用于下一步骤中。

步骤4：向3-[(1-[苯甲基(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基环丙基)(甲基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(600.0mg，1.15mmol)在MeOH(10mL)中的搅拌的溶液添加碳载钯(10％，70mg)。将混合物在H₂(气球)下搅拌5天。将混合物过滤，浓缩，并通过HPLC进行纯化，给出作为棕色油状物的3-[甲基(1-[(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基环丙基)氨甲酰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(218.5mg，506.43μmol，44.1％得率)。

¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ0.76(s,3H),1.43(s,9H),2.65(m,1H),2.90(m,1H),3.11(m,3H),3.27(m,3H),3.80(m,2H),4.10(m,2H),4.71(m,2H),7.83(m,1H)。

LCMS:m/z 432.2

4-{4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-羰基}-8-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷的合成

步骤1：向5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(489.9mg，1.83mmol)和8-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷盐酸盐(300.0mg，1.83mmol)在DMF(5mL)中的搅拌的溶液添加HATU(906.01mg，2.38mmol)和三乙胺(649.15mg，6.42mmol，890.0μl)。将混合物在r.t.搅拌过夜，然后倾倒在水中并用MTBE(2x15mL)萃取。将合并的有机级分用水(20mL)洗涤三次，在Na₂SO₄上干燥并浓缩，给出3-8-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷-4-羰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(500.0mg，91.0％纯度，1.21mmol，65.9％得率)。

步骤2：向3-8-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷-4-羰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(500.0mg，1.33mmol)在MeOH(10mL)中的溶液添加二氧杂环己烷中的4MHCl(2mL，8mmol)。将得到的溶液搅拌12h，然后在减压下浓缩。将产物用MTBE(50mL)处理并通过过滤收集，然后在真空中在40℃干燥，给出4-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-羰基-8-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷盐酸盐(220.0mg，90.0％纯度，633.0μmol，54％得率)。

¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ0.90(m,4H),1.95(m,2H),3.50(m,3H),3.64(m,5H),4.37(m,2H),4.47(m,2H),7.77(s,1H),10.09(m,2H)。

LCMS:m/z 277.2

4-{4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-羰基}-7-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷的合成

步骤1：向5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(489.9mg，1.83mmol)和7-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷盐酸盐(300.0mg，1.83mmol)在DMF(5mL)中的搅拌的溶液添加HATU(906.01mg，2.38mmol)和三乙胺(649.15mg，6.42mmol，890.0μl)。将混合物在r.t.搅拌过夜，然后倾倒在水中并用MTBE(2x15mL)萃取。将合并的有机级分用水洗涤三次，在无水硫酸钠上干燥并浓缩，给出3-7-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷-4-羰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(350.0mg，95.0％纯度，883.25μmol，48.2％得率)。

步骤2：向3-7-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷-4-羰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(350.0mg，929.74μmol)在甲醇(10ml)中的溶液添加二氧杂环己烷中的4NHCl(2mL)，并将得到的溶液在25℃搅拌12h。在反应完成后(通过HNMR监测)，将反应混合物在减压下浓缩。将产物用MTBE处理，并通过过滤收集，然后在真空中在40℃干燥，给出4-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-羰基-7-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷盐酸盐(110.0mg，91.0％纯度，320.02μmol，34.4％得率)。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ0.87(m,4H),1.73(m,1H),3.71(m,5H),3.93(m,2H),4.39(m,2H),4.55(m,3H),7.82(m,1H)。

LCMS:m/z 277.2

3-{7-羟基-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-羰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯的合成

向5-[(叔丁氧基)羰基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3-甲酸(1.13g，4.22mmol)和三乙胺(1.07g，10.55mmol，1.47mL)在MeCN(20mL)中的溶液添加HATU(1.77g，4.64mmol)。将得到的混合物搅拌10min，然后添加4-氮杂螺[2.5]辛-7-醇盐酸盐(760.0mg，4.64mmol)并继续搅拌过夜。将反应混合物在EtOAc(50mL)与水(100mL)之间分配。将有机相用水(2x20mL)、盐水洗涤，在硫酸钠上干燥并在减压下浓缩。将产物通过HPLC进行纯化，给出3-7-羟基-4-氮杂螺[2.5]辛烷-4-羰基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酸叔丁酯(275.0mg，730.51μmol，17.3％得率)。

¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ0.56(m,2H),0.82(m,1H),0.92(m,1H),1.20(m,1H),1.43(s,9H),1.81(m,2H),3.75(m,1H),3.83(m,3H),4.11(m,4H),4.62(m,1H),4.71(m,1H),4.76(m,1H),7.70(s,1H)。

LCMS:m/z 377.2

实施例1

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(甲氧基甲基)环丙基]-N3,6-二甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A)3.16mins,m/z 450/452[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.05-7.80(m,1H),7.74(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.45-7.39(m,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),5.39-5.10(m,1H),4.98-4.78(m,1H),4.55-4.35(m,1H),4.27-4.19(m,1H),4.13(d,J＝12.9Hz,1H),3.65-3.45(m,2H),3.29(s,3H),3.23-2.87(m,3H),1.25-0.67(m,7H)。

实施例2

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-甲基-N3-{1-[(丙-2-基氧基)甲基]环丙基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法J)1.51mins,m/z 464/466[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(s,1H),7.99(s,1H),7.72(dd,J＝6.8,2.6Hz,1H),7.41(ddd,J＝9.0,4.3,2.6Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),4.85(m,2H),4.17(m,2H),4.13-3.68(m,2H),3.56(m,3H),3.04(m,3H),1.07(m,7H),0.81(m,3H)。

实施例3

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(乙氧基甲基)环丙基]-N3-甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法J)1.42mins,m/z 450/452[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(s,1H),7.95(s,1H),7.73(dd,J＝6.8,2.6Hz,1H),7.41(ddd,J＝9.1,4.3,2.6Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),4.85(m,2H),4.18(t,J＝5.5Hz,2H),3.98(m,2H),3.58(m,2H),3.46(q,J＝7.0Hz,2H),3.05(m,3H),1.10(m,4H),0.83(s,3H)。

实施例4

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-{1-[(二氟甲氧基)甲基]环丙基}-N3-甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法B)3.24mins,m/z 472/474[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H),7.82(s,1H),7.73(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.41(ddd,J＝9.0,4.4,2.6Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),6.71(t,J＝75.8Hz,1H),4.90-4.81(m,2H),4.21-4.14(m,2H),4.11-3.82(m,4H),3.20-2.98(m,3H),1.20-0.79(m,4H)。

实施例5

N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{6,6-二氟-4-氮杂螺[2.4]庚烷-4-羰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酰胺

Rt(方法J)1.47mins,m/z 454/456[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H),7.86(s,1H),7.75-7.69(m,1H),7.44-7.38(m,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),4.83(m,2H),4.27(t,J＝13.1Hz,2H),4.22-4.12(m,2H),3.98-3.87(m,2H),2.50-2.43(m,2H),1.92-1.84(m,2H),0.69-0.62(m,2H)。

实施例6

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-{1-[(二氟甲氧基)甲基]环丙基}-N3,6-二甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法B)3.37mins,m/z 486/488[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.02(s,1H),7.85(s,1H),7.74(dd,J＝6.9,2.5Hz,1H),7.45-7.38(m,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),6.71(t,J＝75.8Hz,1H),5.35-5.18(m,1H),4.94-4.82(m,1H),4.44(d,1H),4.24(dd,J＝12.8,4.3Hz,1H),4.17-3.95(m,3H),3.22-2.90(m,3H),1.12(d,J＝6.7Hz,3H),0.95(s,4H)。

实施例7

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-甲基-N3-[1-(吡啶-4-基)环丙基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A)2.95mins,m/z 469/471[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H),8.63-8.37(m,2H),8.00-7.68(m,1H),7.64-7.36(m,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),7.20-6.80(m,3H),5.07-4.74(m,2H),4.31-3.67(m,4H),3.23-2.94(m,3H),1.84-1.30(m,4H)。

实施例8

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-甲基-N3-[1-(嘧啶-2-基)环丙基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A)3mins,m/z 470/472[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(s,1H),8.84-8.63(m,2H),7.79-7.67(m,1H),7.46-7.24(m,3H),6.78(s,1H),5.00-4.76(m,2H),4.26-3.90(m,3H),3.84-3.68(m,1H),3.10(s,3H),1.96-1.80(m,1H),1.66-1.33(m,3H)。

实施例9

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-[1-(羟基甲基)环丙基]-N3-甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A)2.77mins,m/z 422/424[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(s,1H),8.17-7.76(m,1H),7.73(dd,J＝6.8,2.6Hz,1H),7.41(ddd,J＝9.1,4.4,2.6Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),5.32-4.92(m,1H),4.92-4.72(m,2H),4.24-4.12(m,2H),4.12-3.73(m,2H),3.72-3.53(m,2H),3.22-2.88(m,3H),1.21-0.60(m,4H)。

实施例10

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-(2-羟基乙基)-N3-[1-(羟基甲基)环丙基]-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法B)2.72mins,m/z 452/454[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H),7.92(s,1H),7.73(dd,J＝6.8,2.6Hz,1H),7.41(ddd,J＝9.1,4.4,2.6Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),5.18-5.01(m,1H),4.94-4.73(m,3H),4.22-3.39(m,10H),1.39-0.61(m,4H)。

实施例11

N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{8-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷-4-羰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酰胺

Rt(方法B)2.95mins,m/z 448/450[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08(s,1H),7.76-7.68(m,2H),7.42(ddd,J＝9.1,4.4,2.7Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),4.93-4.79(m,2H),4.23-4.14(m,2H),4.11-3.37(m,8H),2.01-1.91(m,2H),1.19-0.78(m,4H)。

实施例12

N-(3-氯-4-氟苯基)-3-{7-氧杂-4-氮杂螺[2.6]壬烷-4-羰基}-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-5-甲酰胺

Rt(方法B)2.95mins,m/z 448/450[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.09(s,1H),7.99-7.60(m,2H),7.42(ddd,J＝9.1,4.4,2.7Hz,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),4.97-4.76(m,2H),4.39-3.46(m,10H),2.06-1.21(m,2H),1.13-0.71(m,4H)。

实施例13

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-甲基-N3-(1-{[(2,2,2-三氟乙基)氨基]甲基}环丙基)-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A)3.22mins,m/z 503/505[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.09(s,1H),8.04-7.65(m,2H),7.49-7.38(m,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),4.99-4.72(m,2H),4.28-3.66(m,4H),3.30-2.55(m,8H),1.33-0.61(m,4H)。

实施例14

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-{1-[2-(二氟甲氧基)乙基]环丁基}-N3-甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A2)3.86mins,m/z 500/502[M+H]+

实施例15

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-{1-[2-(二氟甲氧基)乙基]环戊基}-N3-甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A2)4.01mins,m/z 514/516[M+H]+

实施例16

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-{4-[2-(二氟甲氧基)乙基]氧杂环己烷-4-基}-N3-甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A2)3.58mins,m/z 530/532[M+H]+

实施例17

N5-(3-氯-4-氟苯基)-N3-环丙基-N3,6-二甲基-4H,5H,6H,7H-吡唑并[1,5-a]吡嗪-3,5-二甲酰胺

Rt(方法A)3.11mins,m/z 406/408[M+H]+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(s,1H),8.00(s,1H),7.74(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.46-7.39(m,1H),7.31(t,J＝9.1Hz,1H),5.25(d,J＝18.3Hz,1H),4.93-4.84(m,1H),4.46(d,J＝18.3Hz,1H),4.25(dd,J＝12.9,4.4Hz,1H),4.14(d,J＝12.8Hz,1H),3.13-3.04(m,1H),2.96(s,3H),1.12(d,J＝6.8Hz,3H),0.84-0.75(m,2H),0.69-0.51(m,2H)。

生物化学衣壳组装测定法

组装效应物活性的筛选在由Zlotnick等(2007)发表的荧光淬灭测定法的基础上进行。将含有融合到第150位处的独一无二的半胱氨酸残基的149个氨基酸的N-端组装结构域的C-端截短的核心蛋白，使用pET表达***(Merck Chemicals,Darmstadt)在大肠杆菌中表达。核心二聚体蛋白的纯化使用一系列孔径排阻层析步骤来进行。简单来说，将来自于表达通过NdeI/XhoI克隆到表达质粒pET21b中的核心蛋白的编码序列的1L BL21(DE3)Rosetta2培养物的细胞团块，用本源裂解缓冲液(Qproteome细菌蛋白质制备试剂盒；Qiagen,Hilden)在冰上处理1h。在离心步骤后，将上清液在冰上搅拌2h期间用0.23g/ml的固体硫酸铵沉淀。在进一步离心后，将得到的沉淀溶解在缓冲液A(100mM Tris，pH 7.5；100mM NaCl；2mM DTT)中，随后装载到缓冲液A平衡的CaptoCore 700柱(GE HealthCare,Frankfurt)上。将含有组装的HBV衣壳的柱流过液针对缓冲液N(50mM NaHCO3 pH 9.6；5mMDTT)进行透析，然后添加尿素至终浓度为3M，在冰上1.5h，以将衣壳解离成核心二聚体。然后将所述蛋白质溶液装载到1LSephacryl S300柱上。在用缓冲液N洗脱后，含有核心二聚体的级分通过SDS-PAGE来鉴定，随后合并并针对50mM HEPES pH 7.5，5mM DTT进行透析。为了提高纯化的核心二聚体的组装能力，进行了第二轮组装和解体，其从添加5M NaCl开始，并包括上述孔径排阻层析步骤。从最后一个层析步骤，将含有核心二聚体的级分合并，并分成等分试样以1.5至2.0mg/ml之间的浓度储存在-80℃下。

在即将标记之前，通过以20mM的终浓度添加新鲜制备的DTT将所述核心蛋白还原。在冰上温育40min后，使用Sephadex G-25柱(GE HealthCare,Frankfurt)和50mM HEPES，pH7.5来除去储存缓冲液和DTT。为了进行标记，将1.6mg/ml核心蛋白在在4℃和暗处与终浓度为1mM的BODIPY-FL马来酰亚胺(Invitrogen,Karlsruhe)温育过夜。在标记后，通过使用Sephadex G-25柱的另一个脱盐步骤除去游离的染料。将标记的核心二聚体分成等分试样储存在4℃下。在二聚体状态下，标记的核心蛋白的荧光信号高，并且在核心二聚体组装成高分子衣壳结构期间被淬灭。所述筛选测定法在黑色384孔微量滴定板中，在10μl总测定体积中，使用50mM HEPES pH 7.5和1.0至2.0μM标记的核心蛋白来进行。每种筛选化合物从100μM、31.6μM或10μM的终浓度开始，使用0.5对数单位的连续稀释以8种不同浓度添加。在任何情况下，整个微量滴定板上的DMSO浓度为0.5％。组装反应通过注入NaCl至终浓度为300μM来开始，这将组装过程诱导到最大淬灭信号的大约25％。在反应开始后6min，使用Clariostar读板器(BMG Labtech,Ortenberg)，使用477nm的激发和525nm的发射来测量荧光信号。作为100％和0％的组装对照，使用含有2.5M和0M NaCl的HEPES缓冲液。实验进行三次，每次三份平行样。EC₅₀值使用Graph Pad Prism 6软件(GraphPad Software,La Jolla,USA)通过非线性回归分析来计算。

从HepAD38细胞的上清液确定HBV DNA

在稳定转染的细胞系HepAD38中分析了抗HBV活性，所述细胞系已被描述分泌高水平的HBV病毒粒子(Ladner等，1997)。简单来说，将HepAD38细胞在37℃、5％CO₂和95％湿度下在200μl维持培养基中培养，所述培养基是增补有50μg/ml青霉素/链霉素(Gibco,Karlsruhe)、2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech,Aidenbach)、400μg/ml G418(AppliChem,Darmstadt)和0.3μg/ml四环素的含有10％胎牛血清(PAN Biotech Aidenbach)的Dulbecco改良的Eagle培养基/营养物混合物F-12(Gibco,Karlsruhe)。将细胞每周一次以1:5的比率传代培养，但通常不传代超过10次。对于所述测定法来说，在96孔板的每个孔中将60,000个细胞接种在不含任何四环素的维持培养基中，并用测试化合物的连续半对数稀释液处理。为了将边缘效应降至最低，板的外侧36个孔不用，但装填有测定培养基。在每块测定板上，分别指派用于病毒对照的6个孔(未处理的HepAD38细胞)和用于细胞对照的6个孔(用0.3μg/ml四环素处理的HepAD38细胞)。此外，在每个实验中制备一块板，其被设置成具有参比抑制剂如BAY 41-4109、恩替卡韦和拉米夫定来代替筛选化合物。通常，实验进行三次，每次三份平行样。在第6天，在MagNa Pure LC仪器上使用MagNA Pure 96DNA和病毒NA小体积试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim)，按照制造商的说明书从100μl过滤的细胞培养上清液(AcroPrep Advance 96过滤板，0.45μM Supor膜，PALL GmbH,Dreieich)自动纯化HBV DNA。EC50值从HBV DNA的相对拷贝数计算。简单来说，将含有HBV DNA的100μl洗脱液中的5μl与1μM反义引物tgcagaggtgaagcgaagtgcaca、0.5μM正义引物gacgtcctttgtttacgtcccgtc、0.3μM杂交探针acggggcgcacctctctttacgcgg-FL和LC640-ctccccgtctgtgccttctcatctgc-PH(TIBMolBiol,Berlin)一起添加到PCR LC480 Probes Master试剂盒(Roche)，至终体积为12.5μl。在Light Cycler 480实时***(Roche Diagnostics,Mannheim)上使用下述方案进行PCR：95℃预温育1min，扩增：40个循环x(95℃10sec，60℃50，70℃1sec)，在40℃冷却10sec。病毒载量针对已知标准品，使用pCH-9/3091的HBV质粒DNA(Nassal等，1990,Cell63:1357–1363)和LightCycler 480SW 1.5软件(Roche Diagnostics,Mannheim)来定量，并且EC₅₀值使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.,La Jolla,USA)通过非线性回归来计算。

表1：生物化学和抗病毒活性

在表1中，“+++”表示EC₅₀<1μM；“++”表示1μM<EC₅₀<10μM；“+”表示EC₅₀<100μM(细胞活性测定法)

在表1中，“A”表示IC₅₀<5μM；“B”表示5μM<IC₅₀<10μM；“C”表示IC₅₀<100μM(组装测定法活性)

实施例	CC<sub>50</sub>(μM)	细胞活性	组装活性
				实施例1	>10	+++	A
实施例2	>10	+++	A
				实施例3	>10	+++	A
实施例4	>10	+++	A
				实施例5	>10	+++	A
实施例6	>10	+++	A
				实施例7	>10	+++	A
实施例8	>10	+++	A
				实施例9	>10	+++	A
实施例10	>10	+++	A
				实施例11	>10	+++	A
实施例12	>10	+++	A
				实施例13	>10	+++	A
实施例14	>10	+++	A
				实施例15	>10	+++	A
实施例16	>10	+++	A
				实施例17	>10	+++	A

细胞存活率测定法

使用AlamarBlue存活率测定法，在0.3μg/ml四环素(其阻断HBV基因组的表达)存在下评估HepAD38细胞中的细胞毒性。测定法条件和板布局与抗HBV测定法类似，但使用其他对照。在每块测定板上将含有未处理的HepAD38细胞的6个孔用作100％存活率对照，并将只装填有测定培养基的6个孔用作0％存活率对照。此外，在每个实验中使用从60μM的最终测定法浓度开始的环己酰亚胺的几何浓度系列作为阳性对照。在6天的温育期后，以1/11的稀释度向测定板的每个孔添加Alamar Blue Presto细胞存活率试剂(ThermoFisher,Dreieich)。在37℃温育30至45min后，使用Tecan Spectrafluor Plus读板器，分别使用550nm的激发滤光片和595nm的发射滤光片读取与活细胞的数目成正比的荧光信号。将数据归一化成未处理的对照(100％存活率)和测定培养基(0％存活率)的百分率，然后使用非线性回归和GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software,La Jolla,USA)计算CC50值。使用平均EC₅₀和CC₅₀值计算每种测试化合物的选择性指数(SI＝CC₅₀/EC₅₀)。

体内功效模型

HBV研究和抗病毒剂的临床前试验受限于所述病毒的狭窄物种和组织嗜性、缺少可用的感染模型以及由黑猩猩这种对HBV完全易感的唯一动物的使用带来的限制。可选的动物模型是基于使用与HBV相关的嗜肝DNA病毒，并且已在土拨鼠肝炎病毒(WHV)感染的土拨鼠或鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鸭或绒毛猴HBV(WM-HBV)感染的树鼩中测试了各种不同的抗病毒化合物(概述在Dandri等，2017,Best Pract Res Clin Gastroenterol 31,273-279中)。然而，代用病毒的使用具有几个限制。例如，亲缘关系最远的DHBV与HBV之间的序列同源性仅为约40％，这是HAP家族的核心蛋白组装修饰剂显得对DHBV和WHV无活性，但高效抑制HBV的原因(Campagna等，2013,J.Virol.87,6931-6942)。小鼠不被HBV感染，但主要工作聚焦于HBV复制和感染的小鼠模型的开发，例如人类HBV转基因的小鼠的产生(HBVtg小鼠)、小鼠中HBV基因组的流体动力学注射(HDI)或具有人源化肝脏和/或人源化免疫***的小鼠的产生，以及将基于含有HBV基因组的腺病毒(Ad-HBV)或腺相关病毒(AAV-HBV)的病毒载体静脉内注射到具有免疫能力的小鼠中(综述在Dandri等，2017,Best Pract ResClin Gastroenterol 31,273-279中)。使用完整HBV基因组转基因小鼠，可以证实鼠类肝细胞产生感染性HBV毒粒的能力(Guidotti等，1995,J.Virol.,69:6158-6169)。由于转基因小鼠对病毒蛋白具有免疫耐受性，并且在产HBV的小鼠中未观察到肝损伤，因此这些研究证实HBV本身不引起细胞病变。HBV转基因小鼠已被用于测试几种抗HBV药剂例如聚合酶抑制剂和核心蛋白组装修饰剂的功效(Weber等，2002,Antiviral Research 54 69–78；Julander等，2003,Antivir.Res.,59:155-161)，从而证明了HBV转基因小鼠非常适合于多种类型的体内临床前抗病毒测试。

正如在Paulsen等，2015,PLOSone,10:e0144383中所述，在2916/2917位置处带有移码突变(GC)的HBV转基因小鼠(Tg[HBV1.3fsX^-3’5’])可用于证实核心蛋白组装修饰剂的体内抗病毒活性。简单来说，在实验之前通过qPCR检查所述HBV转基因小鼠血清中的HBV特异性DNA(参见“从HepAD38细胞的上清液确定HBV DNA”一节)。每个治疗组由大约10周龄的5只雄性和5只雌性动物组成，滴度为每ml血清10⁷–10⁸个毒粒。将化合物在适合的介质例如2％DMSO/98％侵填体(0.5％甲基纤维素/99.5％PBS)或50％PEG400中配制成悬液，并每天1至3次口服给药到所述动物共10天。所述介质充当阴性对照，而在适合的介质中的1μg/kg恩替卡韦是阳性对照。使用异氟烷喷雾器，通过眼球后血液采样获得血液。为了收集末端心脏穿刺，在最后一次处理血液或器官后6小时，将小鼠用异氟烷麻醉，随后通过CO₂暴露处死。将眼球后(100–150μl)和心脏穿刺(400–500μl)血液样品分别收集到Microvette 300LH或Microvette 500LH中，然后通过离心(10min，2000g，4℃)分离血浆。获取肝组织并在液氮中速冻。所有样品在进一步使用之前储存在-80℃。按照制造商的说明书，从50μl血浆或25mg肝组织提取病毒DNA，并使用DNeasy 96血液和组织试剂盒(Qiagen,Hilden)洗脱在50μl AE缓冲液中(血浆)或使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen,Hilden)洗脱在320μl AE缓冲液中(肝组织)。使用LightCycler 480Probes Master PCR试剂盒(Roche,Mannheim)，按照制造商的说明书对洗脱的病毒DNA进行qPCR，以确定HBV拷贝数。使用的HBV特异性引物包括正向引物5’-CTG TAC CAA ACC TTC GGA CGG-3’、反向引物5’-AGG AGA AAC GGG CTG AGG C-3’和FAM标记的探针FAM-CCA TCA TCC TGG GCT TTC GGA AAA TT-BBQ。总体积为20μl的一个PCR反应样品含有5μl DNA洗脱液和15μl主混合物(包含0.3μM正向引物、0.3μM反向引物、0.15μM FAM标记的探针)。qPCR在Roche LightCycler1480上使用下述方案进行：在95℃预温育1min，扩增：(95℃10sec，60℃50sec，70℃1sec)x 45个循环，在40℃冷却10sec。标准曲线如上所述产生。所有样品测试两份平行样。所述测定法的检测极限为～50HBV DNA拷贝(使用250–2.5x10⁷拷贝数范围内的标准品)。结果被表示成HBV DNA拷贝/10μl血浆或HBV DNA拷贝/100ng总肝脏DNA(归一化至阴性对照)。

在多项研究中已显示，不仅转基因小鼠是证明新的化学实体的体内抗病毒活性的适合模型，而且HBV基因组在小鼠中的流体动力学注射的使用以及用HBV阳性患者血清感染的免疫缺陷的人类肝脏嵌合小鼠的使用，也已频繁地用于剖测靶向HBV的药物(Li等，2016,Hepat.Mon.16:e34420；Qiu等，2016,J.Med.Chem.59:7651-7666；Lutgehetmann等，2011,Gastroenterology,140:2074-2083)。此外，通过接种低剂量的含有HBV基因组的腺病毒(Huang等，2012,Gastroenterology 142:1447-1450)或腺相关病毒(AAV)载体(Dion等，2013,J Virol.87:5554-5563)，已在具有免疫能力的小鼠中成功地建立起慢性HBV感染。这个模型也可用于证实新的抗HBV药剂的体内抗病毒活性。

序列表

<110> 艾库里斯有限及两合公司(AiCuris GmbH & Co. KG)

<120> 抗乙型肝炎病毒HBV的脲6,7-二氢-4H-吡唑并[1,5-a]吡嗪活性剂

<130> SCT211772-60

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 1

ctgtaccaaa ccttcggacg g 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 2

aggagaaacg ggctgagg 18

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 3

ccatcatcct gggctttcgg aaaatt 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 4

tgcagaggtg aagcgaagtg caca 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 5

gacgtccttt gtttacgtcc cgtc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 6

acggggcgca cctctcttta cgcgg 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒

<400> 7

ctccccgtct gtgccttctc atctgc 26

Claims (8)

1.一种式II的化合物，

其中

-R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次；

-R2是H或甲基；

-R3是C1-C4烷基，所述C1-C4-烷基是未取代的或被氘、OH或卤素取代一次、两次或三次；

-R4选自C1-C2-烷基-O-C1-C4-烷基、C1-C2-羟基烷基、C1-C2-烷基-O-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-NH-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-S-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-SO₂-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基和芳基，其中芳基或杂芳基任选地被卤素或C1-C6烷基取代一次、两次或三次；

-R3和R4任选地相连以形成5、6或7员杂环，其中所述杂环是未取代的或被卤素、OH、羧基、OCF₃、OCHF₂或C≡N取代一次、两次或三次；

-X是O、CH₂或NR5；

-m是0、1、2或3；

-R5是H或C1-C4-烷基；

或其可药用盐，或式II的化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物，或式II的化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物。

2.根据权利要求1所述的式II的化合物，

其中

-R1是苯基或吡啶基，其任选地被卤素、C1-C4-烷基、C3-C6-环烷基、C1-C4-卤代烷基或C≡N取代一次、两次或三次；

-R2是H或甲基；

-R3是C1-C4烷基，所述C1-C4-烷基是未取代的或被氘或卤素取代一次、两次或三次；

-R4选自C1-C2-烷基-O-C1-C4-烷基、C1-C2-羟基烷基、C1-C2-烷基-O-C1-C4-卤代烷基、C1-C2-烷基-O-C3-C6-环烷基、C1-C2-烷基-S-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-SO₂-C1-C4-烷基、C1-C2-烷基-C≡N、C1-C2-烷基-C3-C7-杂环烷基、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C3-C7-环烷基)NH₂、C1-C2-烷基-O-C(＝O)(C1-C6-烷基)NH₂、芳基和杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被卤素或C1-C6烷基取代一次、两次或三次；

-R3和R4任选地相连以形成5、6或7员杂环，其中所述杂环是未取代的或被卤素、OH、羧基、OCF₃、OCHF₂或C≡N取代一次、两次或三次；

-X是O、CH₂或NR5；

-m是0、1或2

-R5是H或C1-C4-烷基；

或其可药用盐，或式II的化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物，或式II的化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的式II的化合物，其中芳基是C6-芳基和/或杂芳基是C1-C9-杂芳环，并且其中杂芳基和杂环烷基各自具有1至4个各自独立地选自N、O和S的杂原子，

或其可药用盐，或式II的化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物，或式II的化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的式II的化合物，

或其可药用盐，或式II的化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物，或式II的化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物，

其中所述前体药物选自酯、碳酸酯、乙酰氧基衍生物、氨基酸衍生物和氨基磷酸酯衍生物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物或其可药用盐或所述化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物或所述化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物，其用于在对象中预防或治疗HBV感染。

6.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的化合物或其可药用盐或所述化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物或所述化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物，以及可药用载体。

7.一种在需要的个体中治疗HBV感染的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据权利要求1至4中任一项所述的化合物或其可药用盐或所述化合物或其可药用盐的溶剂化物或水合物或所述化合物或其可药用盐或溶剂化物或水合物的前体药物。

8.用于制备根据权利要求1至4中任一项所述的式II的化合物的方法，所述方法包括将式III的化合物

R1-N＝C＝O

III

其中R1如权利要求1中所定义，

与式IV的化合物

其中R2、R3、R4、X和m如权利要求1至4中任一项中所定义，进行反应。