CN108371710B

CN108371710B - 猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及制备方法

Info

Publication number: CN108371710B
Application number: CN201810089278.9A
Authority: CN
Inventors: 夏振强; 金宏丽; 石晶; 殷玉和; 赵健; 刘冰; 刘伟
Original assignee: Changchun Sr Biological Technology Co ltd
Current assignee: Changchun Sr Biological Technology Co ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: CN108371710A

Abstract

本发明提供了猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及制备方法，本发明的二联疫苗是利用杆状病毒/昆虫细胞表达***分别生产猫杯状病毒的病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒的病毒样颗粒，将前述两种病毒的病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，制备得到猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗。本发明的二联疫苗具有安全、高效、易生产、成本低等优点，对猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症具有良好的免疫预防效果。

Description

猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种用昆虫细胞-杆状病毒表达***生产猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗的方法。

背景技术

猫传染性鼻结膜炎是由猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)引起，临床上以鼻炎、结膜炎、急性口腔溃疡、肺炎和慢性胃炎为特征。目前认为，FCV呈世界性分布，并可能感染所有的猫科动物。猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopenia virus，FPV)引起，临床表现以患猫突发高热、呕吐、腹泻、脱水及循环血流中白细胞减少为特征。FPV主要感染猫科与鼬科等多种动物，尤其以6月龄以下幼小动物的发病率和死亡率更高，是猫科动物最重要的传染病。

为了猫免遭传染病的威胁，保持其身心健康，对其接种疫苗是关键。需要接种的核心疫苗包括的抗原有：FPV、FCV、猫传染性鼻气管炎病毒(Feline herpesvirus,FHV)、狂犬病病毒(Rabies,RABV)。目前，相关的国产疫苗有猫二联疫苗，包括FPV、RABV，但在网上、市场上均找不到关于此疫苗的具体信息，很可能是某科研单位的中试产品。市售疫苗均为进口疫苗，主要为猫三联疫苗，包括FPV、FCV、FHV。这些疫苗均为弱毒疫苗或灭活疫苗，而弱毒疫苗有潜在的安全隐患，灭活疫苗不能有效刺激机体产生细胞免疫等缺点。此外，病毒变异是导致当前疫苗免疫失败的主要原因。因此针对流行毒株制备新型、高效、安全的新型疫苗对猫传染病的防控具有重大意义。

本发明选用国内流行毒株，使用基因工程手段制备病毒样颗粒抗原，进行新型猫二联基因工程疫苗的制备，可同时预防猫传染性鼻结膜炎、猫泛白细胞减少症。由于病毒样颗粒形态和结构与天然病毒粒子相似，因此可有效的诱导机体产生细胞免疫和体液免疫；由于病毒样颗粒不含有核酸，不能自主复制，因此安全性更高。此外，还有易生产、效价高、成本低等优点，同时填补了国内关于猫疫苗研制、商品化的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及其制备方法。

本发明提供的一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗含有猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。

所述猫杯状病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如SEQ IDNO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

为了实现本发明目的，本发明利用昆虫细胞-杆状病毒表达***来生产猫杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。

本发明首先提供一种优化的猫杯状病毒VP1基因、一种优化的猫泛白细胞减少症病毒VP2基因，即根据昆虫细胞偏爱密码子进行优化的基因。优化后的猫杯状病毒VP1基因如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；优化后的猫泛白细胞减少症病毒VP2基因如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗的制备方法，包括制备猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒、将两种病毒样颗粒进行混合，添加防腐剂和佐剂，且混合前，猫杯状病毒病毒样颗粒含量不低于4mg/ml，猫泛白细胞减少症病毒血凝效价不低于1:2¹⁴。

所述猫杯状病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

具体地，本发明提供的一种猫杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对猫杯状病毒VP1基因、猫泛白细胞减少症病毒VP2基因进行优化，将优化的基因分别***到昆虫细胞表达载体中，转化DH10Bac感受态，提取重组杆状病毒基因组；(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按MOI＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即分别获得猫杯状病毒抗原、猫泛白细胞减少症病毒抗原；(3)将猫杯状病毒抗原反复冻融1次后收获上清，即获得猫杯状病毒病毒样颗粒；将猫泛白细胞减少症病毒抗原使用裂解液处理细胞后收获上清，即获得猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。

在一个优选实施方案中，所述的一种猫杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒的制备方法，其中所述用于处理细胞的裂解液，为NaHCO₃溶液，更优先的是25mM浓度的NaHCO₃溶液。

本发明的另一目的是提供一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗，其中包含至少一种猫杯状病毒抗原和至少一种猫泛白细胞减少症病毒抗原。

为了实现本发明目的，本发明将上述制备的两种病毒样颗粒按一定比例混合，并辅以防腐剂和佐剂制备而成。其中，两种病毒样颗粒混合体积比例为1:1-5:1，优选比例为3:1，所述防腐剂为硫柳汞等，优选终浓度为0.005％；所述佐剂为磷酸铝等，优选终浓度为0.4％。

本发明的猫杯猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗为肌肉注射疫苗或皮下注射疫苗。

本发明进一步提供上述制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗在预防猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症中的应用。

本发明以杆状病毒作为表达载体，以Sf9细胞作为生物反应器，制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗具有滴度高、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，免疫后可诱导机体产生高水平的特异性抗体，对猫传染性鼻结膜炎、猫泛白细胞减少症具有良好的免疫预防效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中可表达猫杯状病毒VP1蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，A为病毒感染孔，B为正常细胞孔。

图2为本发明实施例1中可表达猫杯状病毒VP1蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的SDS-PAGE、Western Blot鉴定结果；其中，A为SDS-PAGE鉴定结果，泳道1为重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后沉淀，泳道2为重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获的抗原，泳道3为重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后上清，泳道4为F81细胞培养的细胞毒，泳道5为蛋白彩虹Marker，B为Western Blot鉴定结果，泳道1为重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后沉淀，泳道2为重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后上清，泳道3为F81细胞培养的细胞毒，泳道4为蛋白暴光Marker，泳道5为蛋白彩虹Marker。

图3为本发明实施例1中可表达猫杯状病毒VP1蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞收获抗原的电镜观察结果。

图4为本发明实施例1中制备的猫杯状病毒单克隆抗体间接免疫荧光检测结果；其中，A为表达猫杯状病毒VP1蛋白的重组杆状病毒感染的Sf9细胞，B为正常Sf9细胞，C为猫杯状病毒感染的F81细胞，D为正常F81细胞。

图5为本发明实施例1中制备的猫杯状病毒多克隆抗体间接免疫荧光检测结果；其中，A为表达猫杯状病毒VP1蛋白的重组杆状病毒感染的Sf9细胞，B为正常Sf9细胞，C为猫杯状病毒感染的F81细胞，D为正常F81细胞。

图6为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的重组杆状病毒VP1的重组杆状病毒感染Sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，A为病毒感染孔，B为正常细胞孔。

图7为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的SDS-PAGE、Western Blot鉴定结果；其中，A为SDS-PAGE鉴定结果，B为Western Blot鉴定结果。

图8为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞收获抗原的电镜观察结果。

图9为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白的重组杆状病毒感染Sf9细胞收获抗原的血凝检测结果；其中，A为序列优化后制备的抗原，B为序列未优化后制备的抗原。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1猫杯状病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

对FCV-JL2毒株提取RNA、反转录、PCR进行测序后，获得VP1序列，根据insect NEWII细胞偏爱性进行优化，密码子偏爱性指标由0.47调整至0.98，GC含量由42.6％调整至57.6％，并去除不利的顺式作用元件，去除mRNA易成颈-环区域等。将优化后序列送公司进行基因合成。对优化后的序列，使用引物扩增VP1基因，分别通过NotI-HindIII、SmaI-XhoI连入pFastBac Dual载体中，获得携带有双拷贝外源片段的转移载体。将转移载体转化DH10Bac感受态进行重组，获得携带有双拷贝外源片段的重组杆状病毒基因组Bacmid。将Bacmid转染Sf9细胞后，拯救获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染Sf9细胞，可产生明显的细胞病变，如体积增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多。对24孔板中已长单层的Sf9接种重组杆状病毒，48h后使用针对猫杯状病毒的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测，可见有特异性的绿色荧光，见图1的A图，表明可成功表达目的蛋白。

对重组杆状病毒以MOI＝0.1接毒量接种悬浮培养的Sf9细胞，接毒后4天收获抗原，对抗原冻融一次后，3000rpm 30min离心，分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，以F81细胞培养的细胞毒作为对照。结果可见，收获的VLPs有目的蛋白条带(图2A，第1-3泳道)，细胞毒对照泳道显示的粗条带为培养液中的血清成分，非目的蛋白。使用针对猫杯状病毒的单克隆抗体(购自MyBioSourc公司)进行Western Blot检测，可见VLPs样品泳道有特异性目的条带(图2B，第1-2泳道)，且冻融一次后，目的蛋白主要进入上清中。且收获的VLPs的目的蛋白明显多于细胞毒对照(图2B，第3泳道)。对抗原负染后，进行电镜观察，结果可见有直径38nm左右的病毒样颗粒，形态与天然病毒相似(图3)，表明表达的目的蛋白可成功组装成病毒样颗粒。

对重组杆状病毒以MOI＝0.1接毒量接种悬浮培养的Sf9细胞，接毒后4天收获抗原，冻融一次后，3000rpm 30min收获上清。经超速离心30000rpm 1.5h，获得的沉淀用PBS溶解。再经蔗糖梯度离心(蔗糖密度从上至下依次为：10％、20％、30％、40％)，收获10-20％之间条带的病毒，溶解于PBS中，再经30000rpm 1.5h，获得的沉淀用PBS溶解。用BCA法测定蛋白浓度后，免疫小鼠，制备单克隆抗体。最后筛选得到一株单克隆细胞株，为13#，浓度为2.5mg/ml，亚型为G2b。使用13#单抗分别对表达FCV-VP1的重组杆状病毒感染的Sf9细胞(图4的A、B图)、FCV活毒感染的F81细胞(图4的C、D图)进行间接免疫荧光染色，接种病毒孔均显示为绿色的阳性(图4的A、C图)，细胞对照孔为阴性(图4的B、D图)。

对FCV活毒感染F81细胞收获的病毒液冻融两次后，3000rpm30min收获上清。按1/50比例加入1.3M醋酸锌，4℃沉淀1h，10000rpm30min，用饱和EDTA悬浮沉淀，再经蔗糖梯度离心(蔗糖密度从上至下依次为：20％、30％、40％)，收获20-30％之间条带的病毒，溶解于PBS中，再经30000rpm 1.5h，获得的沉淀用PBS溶解。用BCA法测定蛋白浓度后，采用背部多点免疫兔，500ug/次，共免疫四次，制备多克隆抗体,浓度为9.8mg/ml。使用多克隆抗体分别对表达FCV-VP1的重组杆状病毒感染的Sf9细胞(图5的A、B图)、FCV活毒感染的F81细胞(图5的C、D图)进行间接免疫荧光染色，接种病毒孔均显示为绿色的阳性(图5A、C)，细胞对照孔为阴性(图5的B、D图)。

使用制备的13#单抗作为捕获抗体，包被ELISA板子，包被浓度为1ug/孔，再加入待检抗原(制备的VLPs)，再以制备的兔多抗10000倍稀释作为检测抗体，HRP-抗兔抗体20000倍稀释为二抗，用显色液进行显色，终止显色后使用酶标仪读取OD值。结果显示(表1)，经序列优化制备的重组杆状病毒表达的VLPs OD值高于序列未优化制备的重组杆状病毒表达的VLPs、F81细胞培养的细胞阳性毒，表明FCV VP1经序列优化后，显著改变了目的蛋白表达量，且比常规培养的细胞毒表达量高。

表1双抗体夹心Elisa结果

实施例2猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

对FPV毒株提取基因组进行测序后，获得VP2基因序列，根据insect NEW II细胞偏爱性进行优化，密码子偏爱性指标由0.37调整至0.87，GC含量由35.1％调整至53.0％。将优化后序列送公司进行基因合成。对优化后的序列，使用引物扩增VP2基因，分别通过NotI-HindIII、XhoI-NheI连入pFastBac Dual载体中，获得携带有双拷贝外源片段的转移载体。将转移载体转化DH10Bac感受态进行重组，获得携带有双拷贝外源片段的重组杆状病毒基因组Bacmid。将Bacmid转染Sf9细胞后，拯救获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染Sf9细胞，可产生明显的细胞病变，如体积增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多。对24孔板中已长单层的Sf9接种重组杆状病毒，48h后使用针对猫细小病毒的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测，可见有特异性的绿色荧光(图6的A)，表明可成功表达目的蛋白。

对重组杆状病毒以MOI＝0.1接毒量接种悬浮Sf9细胞，接毒后4天收获抗原，对抗原进行SDS-PAGE检测，结果可见有目的蛋白条带(图7的A图)。使用针对猫细小病毒的单克隆抗体针进行Western Blot检测，可见有特异性目的条带(图7的B图)。对抗原负染后，进行电镜观察，结果可见有直径20nm左右的病毒样颗粒，形态与天然病毒相似(图8)，表明表达的目的蛋白可成功组装成病毒样颗粒。使用15mM pH6.5PBS进行血凝效价的测定，经序列优化后收获的重组病毒表达的FPV抗原效价可达1:2¹⁸(图9的A图)，而未经序列优化后收获的重组病毒表达的FPV抗原效价仅能达1:2¹²(图9的B图)，结果表明，序列优化后，FPV VP2表达量明显增多，且能组装成有血凝活性的抗原。

实施例3猫免疫试验

将上述重组杆状病毒按MOI＝0.1分别接种悬浮Sf9细胞，培养4天后收获。将接种了FCV抗原的Sf9细胞冻融1次后，3000rpm离心30min，获得上清，即为含有FCV病毒样颗粒的收获液。使用BCA法测定蛋白浓度，为4.9mg/ml。将接种了FPV抗原的Sf9细胞直接3000rpm离心30min，弃上清，细胞用等体积25mM NaHCO₃悬浮，冰上作用30min，3000rpm离心30min，获得上清，即为含有FPV病毒样颗粒的收获液。使用猪血进行血凝效价的测定，HA为1:2¹⁶。

将上述制备的FCV病毒样颗粒、FPV病毒样颗粒按3:1体积混合，再按1/5比例加入20％铝胶佐剂(哈药六厂)、0.005％硫柳汞，制成猫二联疫苗。再按上述方法分别制备猫FCV疫苗、猫FPV疫苗。制备的疫苗均于4℃保存。

将8-9周龄幼猫(FCV中和抗体效价不高于1:4、FPV HI效价不高于1:4)分为4组，分别为免疫A组、免疫B组、免疫C组和对照组，3只/组，分别免疫猫二联疫苗、猫FCV疫苗、猫FPV疫苗和PBS，免疫剂量为1.0ml/只，首免后第4周加强免疫一次。免疫后每2周采血，分离血清，测定其FCV中和抗体效价、FPV血凝抑制抗体效价。

结果显示，免疫后2周，免疫A组均可刺激机体产生抗猫杯状病毒中和抗体(表2)和抗猫泛白细胞减少症病毒血凝抑制抗体(表3)，且加强免疫后抗体增加，并可持续至第8周。且免疫组与对照组饮食、精神状态、体温均正常，也无其他不良反应。此外，针对FPV的血凝抑制抗体效价而言，免疫A组与免疫C组的效果无显著差异，血凝抑制抗体效价最高时均可达到1:2¹¹。而针对FCV的中和抗体效价而言，免疫A组抗体效价比免疫B组高，免疫效果好，免疫A组的中和抗体效价最高可达1：39.81。说明两种病毒样颗粒混合后免疫，刺激机体产生的效价在原来单独使用的基础上，会进一步的提高。

表2FCV中和抗体效价(1：n)

表3FPV血凝抑制抗体效价(1：2ⁿ)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 长春西诺生物科技有限公司

<120> 猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgacg acggtagcgt gacagcccct gagcagggta cccctgtcgg tggtgtgatc 60

gctgaaccct ccagccagat ggctgctgcc gctgacatgg ccactggaaa gagcgtggac 120

agcgaatggg aagccttctt cagcttccac acaagcgtca actggagcac ttcagagacc 180

caaggcaaga tcctcttcaa gcagtctctg ggtcccctgc tgaaccccta cctggaacac 240

ctgagcaagc tctacgtcgc ttggtccggc agcgttgacg tgcgtttcag catcagcggt 300

agcggcgtct tcggaggcaa gctcgctgct atcgtcgtgc ccccaggtat cgaccccgtt 360

cagagcacat ccatgctcca atacccccac gtgctgttcg acgcccgtca ggttgaaccc 420

gtgatcttca gcatccctga cctcaggagc acactgtacc acctgatggc tgacactgac 480

accacctccc tggtcatcat ggtgtacaac gacctgatca acccatacgc taacgactcc 540

aacagctccg gctgtatcgt gaccgtggag acaaagcctg gtccagactt ccgcttccac 600

ctcctgaagc caccaggaag catgctgacc cacggttccg tgccatccga cctgatccct 660

aagtcttcct ctctgtggat cggcaaccgt cactggacag acatcacaga attcgtgatc 720

cgtcctttcg tgttccaggc caaccgtcac ttcgacttca accaggagac agccggttgg 780

tccacccctc gcttccgtcc tatgacagtg accgtctccc agaagaacgg tgagaagctg 840

ggcatcggtg tcgctaccga ctacatcgtt cccggcatcc ctgacggctg gcctgacacc 900

acaatccctg aggagctgac ccctgccggc gactacgcca tcacttctag caacggtaac 960

gacatcacaa ccctggccga ctacaacagc gctgacgtga tcaagaacaa cacaaacttc 1020

cgcggcatgt acatctgcgg ctccctgcag cgcgcctggg gtgacaagaa gatctccaac 1080

acagctttca tcacaatcgg agacgtggaa ggcagcaaga tcaagcctag ctctgtgatc 1140

agccaggcca agatcgctat cttccaggac aaccacgtca accacgacgt gcagacttcc 1200

gacatcacct acgctctgct gggttacacc ggtatcggtg aggaggccat cggcgctacc 1260

cgcgaccgcg tggctaggat ctccatcctg cctgaaaccg gtgctcgtgg cggcaaccac 1320

cctatcttct acaagaactc catgaagctg ggatacgtga tcaagagcat cgacgtgttc 1380

aacagccaga tcctccacac tagccgccag ctgagcctga acaactacct gctcgcccct 1440

gactccttcg ccgtgtaccg tatcacagac agcaacggta gctggttcga catcggtatc 1500

gaccacgacg gtttcagctt cgtgggtgtg agcaacatcc caaagctgga attccccctc 1560

acttcctcct acatgggtat ccagctggct aagatccgcc tggccagcaa catccgtagc 1620

atgatgacta agatctaa 1638

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Asp Asp Gly Ser Val Thr Ala Pro Glu Gln Gly Thr Pro Val

1 5 10 15

Gly Gly Val Ile Ala Glu Pro Ser Ser Gln Met Ala Ala Ala Ala Asp

20 25 30

Met Ala Thr Gly Lys Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser

35 40 45

Phe His Thr Ser Val Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile

50 55 60

Leu Phe Lys Gln Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Glu His

65 70 75 80

Leu Ser Lys Leu Tyr Val Ala Trp Ser Gly Ser Val Asp Val Arg Phe

85 90 95

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val

100 105 110

Val Pro Pro Gly Ile Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr

115 120 125

Pro His Val Leu Phe Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Ile Phe Ser

130 135 140

Ile Pro Asp Leu Arg Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ala Asp Thr Asp

145 150 155 160

Thr Thr Ser Leu Val Ile Met Val Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Asp Ser Asn Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys

180 185 190

Pro Gly Pro Asp Phe Arg Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met

195 200 205

Leu Thr His Gly Ser Val Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Leu Trp Ile Gly Asn Arg His Trp Thr Asp Ile Thr Glu Phe Val Ile

225 230 235 240

Arg Pro Phe Val Phe Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu

245 250 255

Thr Ala Gly Trp Ser Thr Pro Arg Phe Arg Pro Met Thr Val Thr Val

260 265 270

Ser Gln Lys Asn Gly Glu Lys Leu Gly Ile Gly Val Ala Thr Asp Tyr

275 280 285

Ile Val Pro Gly Ile Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Glu

290 295 300

Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala Ile Thr Ser Ser Asn Gly Asn

305 310 315 320

Asp Ile Thr Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ser Ala Asp Val Ile Lys Asn

325 330 335

Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr Ile Cys Gly Ser Leu Gln Arg Ala

340 345 350

Trp Gly Asp Lys Lys Ile Ser Asn Thr Ala Phe Ile Thr Ile Gly Asp

355 360 365

Val Glu Gly Ser Lys Ile Lys Pro Ser Ser Val Ile Ser Gln Ala Lys

370 375 380

Ile Ala Ile Phe Gln Asp Asn His Val Asn His Asp Val Gln Thr Ser

385 390 395 400

Asp Ile Thr Tyr Ala Leu Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Glu Ala

405 410 415

Ile Gly Ala Thr Arg Asp Arg Val Ala Arg Ile Ser Ile Leu Pro Glu

420 425 430

Thr Gly Ala Arg Gly Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn Ser Met

435 440 445

Lys Leu Gly Tyr Val Ile Lys Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser Gln Ile

450 455 460

Leu His Thr Ser Arg Gln Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Ala Pro

465 470 475 480

Asp Ser Phe Ala Val Tyr Arg Ile Thr Asp Ser Asn Gly Ser Trp Phe

485 490 495

Asp Ile Gly Ile Asp His Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Asn

500 505 510

Ile Pro Lys Leu Glu Phe Pro Leu Thr Ser Ser Tyr Met Gly Ile Gln

515 520 525

Leu Ala Lys Ile Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Met Met Thr Lys

530 535 540

Ile

545

<210> 3

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccgatg gagctgtgca accagatggt ggtcagccag ctgtccgtaa cgagagagct 60

acaggatctg gcaacggcag cggtggtggt ggcggcggcg gaagtggagg tgttggaatt 120

agcacaggaa cattcaacaa ccagactgaa ttcaagttcc tggagaacgg ttgggtggaa 180

attaccgcca atagctctcg tttggtccac ctcaacatgc ccgaaagtga gaactacaag 240

cgtgtggtcg ttaacaacat ggacaagaca gctgtgaagg gcaacatggc tctggacgac 300

acacatgttc agatcgtgac accttggtct ttggtcgacg ctaacgcttg gggcgtgtgg 360

ttcaatcccg gagattggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgaactgca cttggtctcc 420

ttcgaacaag aaatctttaa cgttgtcctg aagactgttt cagagtccgc tacacaaccc 480

ccaacaaagg tgtacaacaa cgatctcact gcctctctga tggttgctct ggacagcaac 540

aacacaatgc ccttcacccc tgccgccatg cgttcagaga cactcggatt ttacccatgg 600

aagcctacta tcccaacacc ttggaggtac tacttccaat gggataggac actcatccct 660

tcacacacag gcacctcagg aacacctact aacgtttacc acggcactga tcccgacgat 720

gttcaattct acaccattga gaactccgtg cccgtgcatc tcttgcgcac aggagacgag 780

ttcgccaccg gcaccttctt cttcgattgc aaaccctgtc gcctgaccca cacatggcaa 840

accaaccgtg ccctgggctt gccacctttc ctcaacagcc tgccacaatc cgagggtgct 900

actaacttcg gagatatcgg agtccagcaa gacaagcgcc gcggcgttac tcaaatgggc 960

aataccgact acatcactga agccactatc atgaggccag ctgaggttgg ctacagcgcc 1020

ccctactact cctttgaggc ctccactcag ggcccattca agaccccaat cgccgctggt 1080

aggggaggcg cccagactga cgaaaaccag gccgccgacg gagatcccag atacgccttc 1140

ggacgccagc acggtcagaa gactaccact accggtgaaa cccctgagcg ttttacttat 1200

atcgctcacc aagacaccgg tcgctatccc gaaggtgact ggatccagaa catcaacttc 1260

aatctgcctg tgactaacga caacgtgctc ctccccacag acccaatcgg tggcaagacc 1320

ggtatcaatt acaccaatat ttttaatacc tacggtcctt tgacagctct caataacgtc 1380

ccacctgtct accctaacgg ccagatctgg gacaaagaat tcgacaccga tttgaagcca 1440

cgcctccacg tgaacgcccc tttcgtgtgt cagaacaact gccctggtca actgttcgtg 1500

aaggtcgctc ccaacctgac caacgaatac gaccccgacg cttcagccaa tatgagccgc 1560

atcgtcactt acagcgactt ctggtggaag ggtaaactcg tgtttaaggc taagctgcgt 1620

gcctcacaca cttggaaccc aattcaacag atgtctatca acgttgacaa ccagttcaac 1680

tacgtcccca ataacatcgg agccatgaag atcgtttacg agaagtctca gctcgctcct 1740

cgtaaactgt actaa 1755

<210> 4

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg

1 5 10 15

Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln

35 40 45

Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn

50 55 60

Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys

65 70 75 80

Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met

85 90 95

Ala Leu Asp Asp Thr His Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val

100 105 110

Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu

115 120 125

Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu

130 135 140

Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro

145 150 155 160

Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala

165 170 175

Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp

195 200 205

Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly

210 215 220

Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Val Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp

225 230 235 240

Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg

245 250 255

Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro

260 265 270

Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ala Thr Asn Phe Gly

290 295 300

Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly

305 310 315 320

Asn Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val

325 330 335

Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro

340 345 350

Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu

355 360 365

Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His

370 375 380

Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr

385 390 395 400

Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln

405 410 415

Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro

420 425 430

Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe

435 440 445

Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr

450 455 460

Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro

465 470 475 480

Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly

485 490 495

Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro

500 505 510

Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp

515 520 525

Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr

530 535 540

Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn

545 550 555 560

Tyr Val Pro Asn Asn Ile Gly Ala Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser

565 570 575

Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr

580

Claims

1.一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，含有猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒；

所述猫杯状病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒中，猫泛白细胞减少症病毒的基因序列如SEQID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

其中，疫苗制备时：首先制备猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒，然后将两种病毒样颗粒进行混合，再添加防腐剂和佐剂，混合前猫杯状病毒病毒样颗粒含量不低于4mg/ml，猫泛白细胞减少症病毒血凝效价不低于1:2¹⁴。

2.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，疫苗制备时，两种病毒样颗粒混合体积比例为1:1-5:1。

3.如权利要求1所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，疫苗制备时，添加硫柳汞用作防腐剂，添加磷酸铝用作佐剂。

4.如权利要求1-3任一所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒通过以下方法制备得到：

(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对猫杯状病毒VP1基因、猫泛白细胞减少症病毒VP2基因进行优化，将优化的猫杯状病毒VP1基因和猫泛白细胞减少症病毒VP2基因分别***到昆虫细胞表达载体中，转化DH10Bac感受态，提取重组杆状病毒基因组；所述优化的猫杯状病毒VP1基因和猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、3所示；

(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按MOI＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即分别获得猫杯状病毒抗原、猫泛白细胞减少症病毒抗原；

(3)将猫杯状病毒抗原反复冻融1次后收获上清，即获得猫杯状病毒病毒样颗粒；将猫泛白细胞减少症病毒抗原使用裂解液处理细胞后收获上清，即获得猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。

5.如权利要求4所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，步骤(3)所述裂解液为25mM浓度的NaHCO₃溶液。

6.如权利要求1-3任一所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞，终浓度为0.005％。

7.如权利要求1-3任一所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗，其特征在于，所述佐剂为磷酸铝，终浓度为0.4％。

8.权利要求1-7任一所述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗的制备方法，其特征在于，包括制备猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒、将两种病毒样颗粒进行混合，添加防腐剂和佐剂，且混合前，猫杯状病毒病毒样颗粒含量不低于4mg/ml，猫泛白细胞减少症病毒血凝效价不低于1:2¹⁴。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述猫杯状病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒中，猫泛白细胞减少症病毒的基因序列如SEQID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。