CN114456240B - 一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗，其中包含有用于重组表达非洲猪瘟病毒抗原蛋白的基因工程乳酸乳球菌，所述的抗原蛋白是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的ASFV p30蛋白、氨基酸序列为SEQID NO:3的ASFV p54蛋白或氨基酸序列为SEQ ID NO:5的ASFV p72蛋白。所述的抗原蛋白连接有大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB基因蛋白。本发明的非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，刺激机体产生黏膜反应，通过血液循环，进而刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。

Description

一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，是目前已知的唯一具有DNA基因组的虫媒病毒。发病猪主要表现为体温升高、皮肤黏膜广泛性出血、妊娠母猪流产等。非洲猪瘟致死率高达100％，给养猪业带来了严重危害。
ASF与其他动物疫病不同，自1921年首次爆发至今已有100余年。当下，对非洲猪瘟的预防措施主要是强化监管力度、加强消毒灭源及做好生物安全防护措施，一旦暴发只能全群扑杀以期彻底根除，对养猪业而言损失极大。目前市场上仍然缺乏有效的疫苗，其中灭活疫苗不能抵御ASF强毒株的攻击，不能提供有效的免疫保护力，故而不能作为今后研究的重点方向；而减毒活疫苗仍存在生物安全方面存在隐患，疫苗接种后的安全性、有效性等有待进一步评估。
而基因工程疫苗，成本低、在安全性、鉴别诊断等方面优势明显，研究更多的ASFV保护性抗原或免疫佐剂，刺激机体产生免疫应答效力是当前研制ASFV亚单位疫苗的关键，因而ASFV亚单位疫苗研究潜力较大。目前对于非洲猪瘟的活载体疫苗的研究仍在探索中，而载体及保护性抗原的选择和设定以及佐剂的优化是研究的重点方向；
口服黏膜免疫不仅在黏膜组织产生免疫应答，还可以引起全身体液免疫应答，使用简便安全，是目前疫苗研发的重要方向。而消化道中复杂的微环境是影响口服黏膜免疫的关键因素，利用乳酸乳球菌表达***研制的口服疫苗，具有易通过黏膜吸收、无副作用的特点，通过胃肠黏膜进行抗原递呈，可以经过不同的免疫通路产生良好的免疫效果。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗，即一种安全无毒，并能刺激机体产生黏膜免疫应答的非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗。
本发明首先提供一种能够用于制备非洲猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗的抗原蛋白，所述的抗原蛋白是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的ASFV p30蛋白、氨基酸序列为SEQ IDNO:3的ASFV p54蛋白或氨基酸序列为SEQ ID NO:5的ASFV p72蛋白；
其中编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1的ASFV p30蛋白的基因，其序列为SEQ IDNO:2；
编码氨基酸序列为SEQ ID NO:3的ASFV p54蛋白的基因，其序列为SEQ ID NO:4；
编码氨基酸序列为SEQ ID NO:5的ASFV p72蛋白的基因，其序列为SEQ ID NO:6；
更进一步的，所述的抗原蛋白连接有大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB基因蛋白；
其中连接有LTB的ASFV p30蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7；编码基因的序列为SEQ ID NO:8；
其中连接有LTB的ASFV p54蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:9；编码基因的序列为SEQ ID NO:10；
其中连接有LTB的ASFV p72蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:11；编码基因的序列为SEQ ID NO:12；
本发明还提供一种基因工程乳酸乳球菌，所述的基因工程乳酸乳球菌中携带有用于编码上述抗原蛋白的重组表达载体；
作为实施例一种具体记载，所述表达载体为pMG36e表达载体。
本发明还提供一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗，其中抗原包含有上述的基因工程乳酸乳球菌。
本发明非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗可以口服，可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，刺激机体产生黏膜反应，通过血液循环，进而刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。为克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能，必须使用活的载体***来传递完整无损的抗原成分。以细菌病毒为活载体***可达到这一目的，乳酸乳球菌已作为多种病原的活载体***进行外源蛋白的递呈并取得良好效果，但在非洲猪瘟的疫苗研制中上未见报道。
附图说明
图1：PCR鉴定结果：泳道2MG1363/pMG36e-p30-His；泳道3MG1363/pMG36e-p54-His；泳道4MG1363/pMG36e-p72-His；泳道5MG1363/pMG36e-p54-LTB-His；泳道6MG1363/pMG36e-p72-LTB-His；泳道7MG1363/pMG36e-p30-LTB-His。
图2：SDS-PAGE及Western blot鉴定结果图：泳道2MG1363/pMG36e-p30-His；泳道3MG1363/pMG36e-p54-His
图3：SDS-PAGE及Western blot鉴定结果图：泳道2MG1363/pMG36e-p30-LTB-His。
图4：SDS-PAGE及Western blot鉴定结果图：泳道2MG1363/pMG36e-p54-LTB-His
图5：SDS-PAGE及Western blot鉴定结果图：泳道2MG1363/pMG36e-p72-His；泳道3MG1363/pMG36e-p72-LTB-His。
具体实施方式
本发明中使用的p30蛋白或称为p32蛋白，由ASFV ORF CP204L基因编码，大小为30KD的蛋白。p30蛋白的蛋白质功能为涉及病毒侵入。p30蛋白具有优良的抗原性，能诱导机体产生强烈的体液免疫反应，从而刺激动物机体产生中和抗体。由于细胞内早期大量表达，可以用它作为抗原检测ASFV抗体。
p54蛋白(由ASFV E183L基因编码，大小约为25KD的蛋白)。p54蛋白涉及病毒侵入，跨膜域，对病毒膜蛋白形成是必须的。其基因的转录在病毒感染的晚期并在感染过程中发挥重要作用。p54蛋白具有很好的抗原性，该病毒进入机体并刺激产生对抗这种蛋白质的抗体，因此具有一定的保护作用。
p72蛋白或称为VP73蛋白(由ASFV B646L基因编码，大小约为73.09KD的蛋白)。p72蛋白是病毒衣壳的重要组成成分，也是病毒二十面体的重要组成成分，产生于病毒感染后期，主要参与病毒侵入。该蛋白序列高度保守，抗原性好，常被用于ASFV血清学诊断。
在本发明中，为了提高p30、p54、p72蛋白在乳酸乳球菌中的重组表达量，对ASFVp30、p54、p72进行改造，改造后的SFV p30、p54、p72的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3。
同时为了进一步提供免疫效果，将具有良好抗原性的LTB基因连接在ASFV p30、p54、p72蛋白上。为简便鉴定蛋白表达，将6×His Tag的核苷酸序列连接在目的基因上，通过间接表达His标签法来表达目的蛋白。
在获得抗原蛋白的基础上，通过下述步骤来制备非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗。
1、表达载体构
合成携带SalI、HindIII酶切位点的p30-His、p54-His、p72-His及p30-LTB-His、p54-LTB-His、p72-LTB-His的基因片段，经测序鉴定正确后，用QuikCut SalI和QuikCutHindIII双酶切基因片段和pMG36e表达载体，经胶回收纯化后，进行16℃过夜连接并转化至JM109感受态细胞，挑阳性单克隆，经菌液PCR、测序鉴定正确的备用。
设计一对pMG36e表达载体的通用鉴别引物，以备后续鉴定用。
通用引物序列如下：
pMG36e F：5’-gcctcctcatcctcttcatc-3’
pMG36e R：5’-aatatcgtagcgccggggta-3’
2、乳酸乳球菌MG1363感受态的制备及转化；
用接种环挑取一满环乳酸乳球菌MG1363的菌液，划线于MRS琼脂培养基，从单菌落中挑菌接于5ml GM17溶液，在30℃静置培养24小时；次日按2％接种量转接到25ml SGM17G培养基中，30℃静置培养0D600＝0.8。离心收集菌体；用10ml洗涤液悬浮菌体，洗涤两次，最后用400μl洗涤液悬浮后即为感受态细胞；转化时取出离心管，放在冰上冰浴，然后在50μl感受态中加入质粒1μl，然后转接到电转杯中冰浴10分钟，EcolⅡ模式电击，迅速转接恢复培养基于30℃静置培养2小时后后取100μl培养液涂红霉素抗性平板，再在30℃培养过夜，次日检查转化子。
3、蛋白的诱导表达
挑取重组菌单菌落接入含红霉素的GM17培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，30℃静置培养48小时，次日按照1％接种量转接于新鲜含红霉素的GM17培养基中，30℃静置培养过夜，离心，用加入10ml PBS洗涤2次，用2ml PBS重悬菌体进行细胞破碎，然后加入2×上样缓冲液，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE蛋白检测试验：结果显示所表达的目的蛋白大约为MG1363/pMG36e-p30-His在22.8KD处表现出特异性条带(图2)、MG1363/pMG36e-p54-His在20.4KD处表现出特异性条带(图2)、MG1363/pMG36e-p72-His在14.8KD处表现出特异性条带(图5)及MG1363/pMG36e-p30-LTB-His在40.2KD处表现出特异性条带(图3)、MG1363/pMG36e-p54-LTB-His在38.8KD处表现出特异性条带(图4)、MG1363/pMG36e-p72-LTB-His在33.1KD处表现出特异性条带(图5)；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉封闭，以Anti-His Tag MonoclonalAntibody作为一抗，山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记的二抗与之反应，最后用HRP-DAB显色；Western blot鉴定重组蛋白具有与抗p30-His、p54-His、p72-His及p30-LTB-His、p54-LTB-His、p72-LTB-His发生反应，证明重组菌表达的外源蛋白具有良好的反应原性。
4、疫苗的制备。
将菌体浓度约为1.0×108CFU/mL菌液，利用冻干技术制备成冻干粉进行保存。取冻干粉加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：制备非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗
1、优化基因片段：
①根据ASFV p30(GenBank登录号：MN270980.1)、p54(GenBank登录号：MN393476.1)和p72(GenBank登录号：MN886930.1)的氨基酸序列，进行改造来获得氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的ASFV p30、p54、p72的抗原蛋白，以此作为宿主菌表达的目的蛋白。
②为增强其免疫效果，将具有消除毒性而保留佐剂活性功能，具有良好抗原性的LTB基因连接在ASFV p30、p54、p72上。
③为简便鉴定蛋白表达，将6×His Tag的核苷酸序列连接在目的基因上，通过间接表达His标签法来表达目的蛋白。
(2)表达载体构建
由公司构建携带SalI、HindIII酶切位点的p30-His、p54-His、p72-His及p30-LTB-His、p54-LTB-His、p72-LTB-His的基因片段，经鉴定正确后，用QuikCut SalI和QuikCutHindIII双酶切pMG36e表达载体，经胶回收纯化后，进行16℃过夜连接转化至JM109感受态细胞，挑阳性单克隆，菌液PCR鉴定及测序鉴定正确。
设计一对pMG36e表达载体的通用鉴别引物，以备后续鉴定用。
通用引物序列如下：
pMG36e F：5’-gcctcctcatcctcttcatc-3’
pMG36e R：5’-aatatcgtagcgccggggta-3’
用QuikCut SalI和QuikCut HindIII双切酶切开pMG36e和设计好的基因序列，进行连接转化，通过测序鉴定正确。
3、乳酸乳球菌MG1363感受态的制备及转化
用接种环挑取一满环乳酸乳球菌MG1363的菌液，划线于MRS琼脂培养基，从单菌落中挑菌接于5ml GM17溶液，在30℃静置培养24小时；次日按2％接种量转接到25ml SGM17G培养基中，30℃静置培养OD600＝0.8。离心收集菌体；用10ml洗涤液悬浮菌体，洗涤两次，最后用400μl洗涤液悬浮后即为感受态细胞；转化时取出离心管，放在冰上冰浴，然后在50μl感受态中加入质粒1μl，然后转接到电转杯中冰浴10分钟，EcolⅡ模式电击，迅速转接恢复培养基于30℃静置培养2小时后后取100μl培养液涂红霉素抗性平板，再在30℃培养过夜，次日检查转化子。
4、蛋白的诱导表达
挑取重组菌单菌落接入含红霉素的GM17培养基中，同时以携带空质粒菌株作为阴性对照，30℃静置培养48小时，次日按照1％接种量转接于新鲜含红霉素的GM17培养基中，30℃静置培养过夜，离心，用加入10ml PBS洗涤2次，用2ml PBS重悬菌体进行细胞破碎，然后加入2×上样缓冲液，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE蛋白检测试验：结果显示所表达的目的蛋白大约为MG1363/pMG36e-p30-His在22.8KD处表现出特异性条带、MG1363/pMG36e-p54-His在20.4KD处表现出特异性条带、MG1363/pMG36e-p72-His在14.8KD处表现出特异性条带及MG1363/pMG36e-p30-LTB-His在40.2KD处表现出特异性条带、pMG36e-p54-LTB-His在38.8KD处表现出特异性条带、MG1363、MG1363/pMG36e-p72-LTB-His在33.1KD处表现出特异性条带。；SDS-PAGE电泳结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉封闭，以Anti-His Tag Monoclonal Antibody作为一抗，山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记的二抗与之反应，最后用HRP-DAB显色；经Western blot鉴定，证明重组菌表达的外源蛋白具有良好的反应原性。
5、疫苗的制备
将菌体浓度约为1.0×108CFU/mL菌液，利用冻干技术制备成冻干粉进行保存。取冻干粉加入1ml的生理盐水，混合均匀，直接口服。
实施例2：组合口服疫苗对非靶动物的免疫效力试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物40只体重约2kg、雌性新西兰大白兔，购自青岛某公司。
1.1.2试验药品实验室制备的2批重组疫苗产品，稀释后检测活菌数为1.0×108/ml。
1.2试验方法
1.2.1免疫接种试验
40只体重约2kg、雌性新西兰大白兔，分为4组，每组10只，Vaccination groupwithout LTB：即联合免疫MG1363/pMG36e-p30-His，MG1363/pMG36e-p54-His，MG1363/pMG36e-p72-His组；Vaccination group with LTB：联合免疫MG1363/pMG36e-p30-LTB-His，MG1363/pMG36e-p54-LTB-His，MG1363/pMG36e-p72-LTB-His组；空载体对照组及PBS对照组，重组菌组每只大白兔口服组合重组菌3ml，约1.0×108/ml，空菌对照组口服空菌3ml，约1.0×108/ml。对照组口服3ml灭菌PBS。
免疫程序：免疫2次，每隔2周加强免疫一次，每次连续免疫3d，每天1次。
1.2.2样品采集与处理
血清样品：在大白兔初次免疫后第14天、加强免疫后第14天，分别按组采集大白兔耳静脉血，将收集到的血液样本倾斜放于4℃静置1h，3000rpm离心5min。吸取上层清澈的血清置于安静的离心管中，－80℃保存待检。
黏膜样品：在大白兔初次免疫后第14天、加强免疫后第14天，采取5cm长度的小肠充分溶解于0.01mol/L的PBS缓冲液中，4℃放置1.5小时，离心收集上清，－80℃保存待检。
1.2.3免疫大白兔肠粘膜sIgA测定
采用间接ELISA检测试剂盒进行检测。
1.2.4免疫大白兔IL-4水平检测
采用ELISA检测试剂盒进行检测。
1.2.5免疫大白兔IFN-γ水平检测
采用ELISA检测试剂盒进行检测。
2结果
由表1显示的实验数据可以分析出，组合口服疫苗在连续2次免疫大白兔后，产生了明显的sIgA抗体。抗体水平明显高于空载体对照和PBS对照(P﹤0.05)，Vaccinationgroup with LTB在加强免疫第14d，sIgA抗体水平达到最大值。
表1：实验大白兔肠粘膜sIgA抗体水平检测表
由表2显示的实验数据可以分析出，组合口服疫苗在连续2次免疫大白兔后，产生了明显的IL-4抗体。IL-4水平明显高于空载体对照和PBS对照(P﹤0.05)，Vaccinationgroup with LTB在加强免疫第14d，IL-4抗体水平达到最大值。
表2：实验大白兔IL-4水平检测表
由表3显示的实验数据可以分析出，组合口服疫苗在连续2次免疫大白兔后，产生了明显的IFN-γ抗体。IFN-γ水平明显高于空载体对照和PBS对照(P﹤0.05)，Vaccinationgroup without LTB在加强免疫第14d，IFN-γ抗体水平达到最大值。
表3：实验大白兔IFN-γ水平检测表
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Phe Ile Leu Ser Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe
1 5 10 15
Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser
20 25 30
Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val
35 40 45
Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val
50 55 60
Lys Ser Ala His Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala
65 70 75 80
Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr
85 90 95
Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Ser Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu
100 105 110
Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro
115 120 125
Ser Ser Glu Glu Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys
130 135 140
Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys
145 150 155 160
Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile His Gly Thr Pro Leu
165 170 175
Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu
180 185 190
Lys Lys Lys Val Asp His His His His His His
195 200
<210> 2
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gattttattt taagcttaaa tatatccatg aaaatggagg tcatcttcaa aacggattta 60
agatcatctt cacaagttgt gtttcatgcg ggtagcttgt ataattggtt ttctgttgag 120
attatcaata gcggtagaat tgttacgacc gctataaaaa cattgctcag tactgttaag 180
tatgatattg tgaaatctgc tcatatatat gcagggcaag ggtatactga acatcaggct 240
caagaagaat ggaatatgat tctgcatgtg ctgtttgaag aggagacaga atcctcagca 300
tcatcggaaa gcattcatga aaaaaatgat aatgaaacca atgaatgcac atcctccttt 360
gaaacattgt ttgagcaaga gccctcatca gaggaaccta aagactccaa gctgtatatg 420
cttgcacaaa agactgtgca acatattgaa caatatggaa aggcacctga ttttaacaag 480
gttattagag cacataactt tattcaaacc attcatggaa cccctctaaa ggaagaagaa 540
aaagaggtgg taagactcat ggtcattaaa cttttaaaaa aaaaagtcga ccatcatcac 600
catcaccat 609
<210> 3
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys
1 5 10 15
Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Val Tyr Thr
20 25 30
Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu
50 55 60
Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val
65 70 75 80
Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser
85 90 95
Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr
100 105 110
Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His
130 135 140
Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln
145 150 155 160
Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His
165 170 175
Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu Val Asp His His His His His His
180 185 190
<210> 4
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gattctgaat tttttcaacc ggtgtatccg cggcattatg gtgagtgttt gtcaccagtc 60
actacaccaa gcttcttctc cacacatgtg tatactattc tcattgctat cgtggtctta 120
gtcatcatta tcatcgttct aatctatcta ttctcttcaa gaaagaaaaa agctgctgct 180
attgaggagg aagatataca gtttataaat ccttatcaag atcagcagtg ggtagaagtc 240
actccacaac caggtacctc taaaccagct ggagcgacta cagcaagtgt aggcaagcca 300
gtcacgggca gaccggcaac aaacagacca gcaacaaaca aaccagttac ggacaacccg 360
gttacggaca gactagtcat ggcaactggc gggccggcgg ccgcacctgc ggccgcgagt 420
gctcctgctc atccggctga gccttacacg acagtcacta ctcagaacac tgcttcacaa 480
acaatgtcgg ctattgaaaa tttacgacaa agaaacacct atacgcataa agacctagaa 540
aactccttgg tcgaccatca tcaccatcac cat 573
<210> 5
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Glu Thr His Leu Val His Leu Ser Phe Asn Ala His Phe Lys Pro
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Gly Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp Asp Asn Gln Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Glu Asn Val Arg Phe Asp Val Asn Gly Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr Thr Leu Val Arg Lys Phe
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Pro Gly Lys Pro His Gln Ser Lys Pro Ile Leu Thr
65 70 75 80
Asp Glu Asn Asp Thr Gln Pro Gly Pro Gly Ile Thr Pro Ile Thr Asp
85 90 95
Ala Thr Tyr Leu Asp Ile Arg Arg Asn Val His Gly Pro Gly Lys Phe
100 105 110
Gly His Val Val Asn Ala Gly Pro Gly Thr Thr Ala Asp Leu Val Val
115 120 125
Ser Ala Ser Ala Ile Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ile Thr
130 135 140
<210> 6
<211> 425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagaaacac atttggttca tttaagcttt aatgcgcatt ttaagcctta tggcccgggc 60
cctcgcaacg gatatgactg ggacaaccaa acacctttag gcccgggcct ttatgaaaac 120
gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt 180
gtgcgcaaat tttgcatccc aggcccgggc aagccgcacc aaagcaaacc tattcttacc 240
gatgaaaatg atacgcagcc aggcccgggc attactccta ttacggacgc aacgtatctg 300
gacataagac gtaatgttca tggcccgggc aagttcggac atgttgttaa cgccggcccg 360
ggcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta agtcgaccat catcaccatc 420
accat 425
<210> 7
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Phe Ile Leu Ser Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe
1 5 10 15
Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser
20 25 30
Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val
35 40 45
Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val
50 55 60
Lys Ser Ala His Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala
65 70 75 80
Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr
85 90 95
Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Ser Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu
100 105 110
Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro
115 120 125
Ser Ser Glu Glu Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys
130 135 140
Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys
145 150 155 160
Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile His Gly Thr Pro Leu
165 170 175
Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu
180 185 190
Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr His Asn
210 215 220
Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser
225 230 235 240
Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala
245 250 255
Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys
260 265 270
Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr
275 280 285
Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn
290 295 300
Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Lys Gly Leu Gln Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Val Thr Arg Val Val Thr His Glu Met Ala His Ala Leu Gly Thr
325 330 335
Pro Ala Ala Asn Ile Ala Ser Arg Tyr Asp Gln Ser Thr Ile Ile Thr
340 345 350
Ile Thr
<210> 8
<211> 1064
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gattttattt taagcttaaa tatatccatg aaaatggagg tcatcttcaa aacggattta 60
agatcatctt cacaagttgt gtttcatgcg ggtagcttgt ataattggtt ttctgttgag 120
attatcaata gcggtagaat tgttacgacc gctataaaaa cattgctcag tactgttaag 180
tatgatattg tgaaatctgc tcatatatat gcagggcaag ggtatactga acatcaggct 240
caagaagaat ggaatatgat tctgcatgtg ctgtttgaag aggagacaga atcctcagca 300
tcatcggaaa gcattcatga aaaaaatgat aatgaaacca atgaatgcac atcctccttt 360
gaaacattgt ttgagcaaga gccctcatca gaggaaccta aagactccaa gctgtatatg 420
cttgcacaaa agactgtgca acatattgaa caatatggaa aggcacctga ttttaacaag 480
gttattagag cacataactt tattcaaacc attcatggaa cccctctaaa ggaagaagaa 540
aaagaggtgg taagactcat ggtcattaaa cttttaaaaa aaaaaggtgg cggtggctct 600
ggcggaggtg ggagcggcgg tggtggcagc gctcctcagt ctattacaga actatgttcg 660
gaatatcaca acacacaaat atatacgata aatgacaaga tactatcata tacggaatcg 720
atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt acatttaaga gcggcgcaac atttcaggtc 780
gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc caaaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac 840
acattaagaa tcacatatct gaccgagacc aaaattgata aattatgtgt atggaataat 900
aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt atggaaaaag gcctgcaggg tggtggtggt 960
ggtgtcacgc gtgtcgtcac gcacgagatg gcgcacgcgc tcggtacccc cgcggcgaac 1020
attgcgtcgc ggtacgacca gtcgaccatc atcaccatca ccat 1064
<210> 9
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys
1 5 10 15
Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Val Tyr Thr
20 25 30
Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu
50 55 60
Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val
65 70 75 80
Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser
85 90 95
Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr
100 105 110
Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His
130 135 140
Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln
145 150 155 160
Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His
165 170 175
Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser
195 200 205
Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser
210 215 220
Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe
225 230 235 240
Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile
245 250 255
Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile
260 265 270
Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn
275 280 285
Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Lys Gly Leu Gln
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Gly Val Thr Arg Val Val Thr His Glu Met Ala His
305 310 315 320
Ala Leu Gly Thr Pro Ala Ala Asn Ile Ala Ser Arg Tyr Asp Gln Ser
325 330 335
Thr Ile Ile Thr Ile Thr
340
<210> 10
<211> 1028
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gattctgaat tttttcaacc ggtgtatccg cggcattatg gtgagtgttt gtcaccagtc 60
actacaccaa gcttcttctc cacacatgtg tatactattc tcattgctat cgtggtctta 120
gtcatcatta tcatcgttct aatctatcta ttctcttcaa gaaagaaaaa agctgctgct 180
attgaggagg aagatataca gtttataaat ccttatcaag atcagcagtg ggtagaagtc 240
actccacaac caggtacctc taaaccagct ggagcgacta cagcaagtgt aggcaagcca 300
gtcacgggca gaccggcaac aaacagacca gcaacaaaca aaccagttac ggacaacccg 360
gttacggaca gactagtcat ggcaactggc gggccggcgg ccgcacctgc ggccgcgagt 420
gctcctgctc atccggctga gccttacacg acagtcacta ctcagaacac tgcttcacaa 480
acaatgtcgg ctattgaaaa tttacgacaa agaaacacct atacgcataa agacctagaa 540
aactccttgg gtggcggtgg ctctggcgga ggtgggagcg gcggtggtgg cagcgctcct 600
cagtctatta cagaactatg ttcggaatat cacaacacac aaatatatac gataaatgac 660
aagatactat catatacgga atcgatggca ggcaaaagag aaatggttat cattacattt 720
aagagcggcg caacatttca ggtcgaagtc ccgggcagtc aacatataga ctcccaaaaa 780
aaagccattg aaaggatgaa ggacacatta agaatcacat atctgaccga gaccaaaatt 840
gataaattat gtgtatggaa taataaaacc cccaattcaa ttgcggcaat cagtatggaa 900
aaaggcctgc agggtggtgg tggtggtgtc acgcgtgtcg tcacgcacga gatggcgcac 960
gcgctcggta cccccgcggc gaacattgcg tcgcggtacg accagtcgac catcatcacc 1020
atcaccat 1028
<210> 11
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Glu Thr His Leu Val His Leu Ser Phe Asn Ala His Phe Lys Pro
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Gly Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp Asp Asn Gln Thr Pro
20 25 30
Leu Gly Pro Gly Leu Tyr Glu Asn Val Arg Phe Asp Val Asn Gly Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr Thr Leu Val Arg Lys Phe
50 55 60
Cys Ile Pro Gly Pro Gly Lys Pro His Gln Ser Lys Pro Ile Leu Thr
65 70 75 80
Asp Glu Asn Asp Thr Gln Pro Gly Pro Gly Ile Thr Pro Ile Thr Asp
85 90 95
Ala Thr Tyr Leu Asp Ile Arg Arg Asn Val His Gly Pro Gly Lys Phe
100 105 110
Gly His Val Val Asn Ala Gly Pro Gly Thr Thr Ala Asp Leu Val Val
115 120 125
Ser Ala Ser Ala Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu
145 150 155 160
Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr
165 170 175
Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys
180 185 190
Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp
195 200 205
Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr
210 215 220
Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys
225 230 235 240
Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Lys Gly Leu Gln Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Val Thr Arg Val Val Thr His Glu Met Ala His Ala
260 265 270
Leu Gly Thr Pro Ala Ala Asn Ile Ala Ser Arg Tyr Asp Gln Ser Thr
275 280 285
Ile Ile Thr Ile Thr
290
<210> 12
<211> 881
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaagaaacac atttggttca tttaagcttt aatgcgcatt ttaagcctta tggcccgggc 60
cctcgcaacg gatatgactg ggacaaccaa acacctttag gcccgggcct ttatgaaaac 120
gtaagattcg atgtaaatgg aaattccctg gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt 180
gtgcgcaaat tttgcatccc aggcccgggc aagccgcacc aaagcaaacc tattcttacc 240
gatgaaaatg atacgcagcc aggcccgggc attactccta ttacggacgc aacgtatctg 300
gacataagac gtaatgttca tggcccgggc aagttcggac atgttgttaa cgccggcccg 360
ggcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta acggtggcgg tggctctggc 420
ggaggtggga gcggcggtgg tggcagcgct cctcagtcta ttacagaact atgttcggaa 480
tatcacaaca cacaaatata tacgataaat gacaagatac tatcatatac ggaatcgatg 540
gcaggcaaaa gagaaatggt tatcattaca tttaagagcg gcgcaacatt tcaggtcgaa 600
gtcccgggca gtcaacatat agactcccaa aaaaaagcca ttgaaaggat gaaggacaca 660
ttaagaatca catatctgac cgagaccaaa attgataaat tatgtgtatg gaataataaa 720
acccccaatt caattgcggc aatcagtatg gaaaaaggcc tgcagggtgg tggtggtggt 780
gtcacgcgtg tcgtcacgca cgagatggcg cacgcgctcg gtacccccgc ggcgaacatt 840
gcgtcgcggt acgaccagtc gaccatcatc accatcacca t 881

Claims (5)

1.一种非洲猪瘟病毒基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于，所述的亚单位口服疫苗的抗原包含有基因工程乳酸乳球菌，所述的基因工程乳酸乳球菌中携带有用于表达抗原蛋白的重组表达载体；所述的抗原蛋白是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的ASFV p30蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:3的ASFV p54蛋白和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的ASFV p72蛋白；且p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白分别连接有大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB基因蛋白；
其中连接有LTB的p30蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，连接有LTB的ASFV p54蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，连接有LTB的p72蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
2.如权利要求1所述的基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于，所述的连接有LTB的p30蛋白，其编码基因的序列为SEQ ID NO:8。
3.如权利要求1所述的基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于，所述的连接有LTB的ASFV p54蛋白，其编码基因的序列为SEQ ID NO:10。
4.如权利要求1所述的基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于，所述的连接有LTB的p72蛋白，其编码基因的序列为SEQ ID NO:12。
5.如权利要求1所述的基因工程亚单位口服疫苗，其特征在于，所述的重组表达载体为pMG36e表达载体。
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