CN113755505B - 治疗和/或预防非洲猪瘟病毒的疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种治疗和/或预防非洲猪瘟病毒的疫苗及其制备方法，涉及疫苗技术领域。本发明疫苗包括两种mRNA，核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2；本发明将两种mRNA同时转染至293T细胞中时mRNA可以正确翻译形成P72蛋白，两种mRNA使用LNP包裹后递送至体内可以使机体产生免疫反应。

Description

治疗和/或预防非洲猪瘟病毒的疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种治疗和/或预防非洲猪瘟病毒的疫苗及其制备方法。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的以高热、呼吸障碍和神经症状为主要特征的一种急性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科下唯一的种，是目前所发现的仅有的虫媒DNA病毒，主要依靠软体蜱科下钝缘蜱属的软壁虱进行传播。ASFV可感染不同年龄段的家猪和野猪，临床上最急性型和急性型ASF的死亡率高达100％，亚急性型的死亡率可降低30％～70％。ASFV的传播途径主要有直接接触感染动物或软蜱叮咬传播、也可通过污染过的泔水、饲料等食物传播、另外也能通过接触感染过的猪尸体或其产品进行传播。由于缺乏有效的手段对ASFV进行防控，ASFV每年给全球养殖业带来巨大的损失。
疫苗接种被认为是阻止非洲猪瘟病毒蔓延的有效手段。mRNA疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗后的第三代疫苗，具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、易规模化扩大等特点。但现在市场上暂无有效的疫苗可以有效预防ASFV。随着mRNA疫苗的发展，阳性纳米脂质颗粒的出现为mRNA疫苗递送提供了新的可能。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种双链DNA病毒，拥有复杂的结构。非洲猪瘟病毒的基因组由两层衣壳和两层外膜保护，衣壳主要由病毒编码蛋白p72构成，据以往试验数据估计，p72占病毒颗粒总重33％左右，同时p72是被病毒感染猪血液中能检测到的主要抗原。此前基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的亚单位疫苗研究已有很多尝试，但没有获得良好结果，分析前期相关研究失败原因可能是没有使用正确折叠的p72蛋白。由于非洲猪瘟病毒感染家猪致死率近100％，对家猪饲养产业乃至民生经济都有重大的威胁，且非洲猪瘟爆发后，国内多个单位虽然开展了非洲猪瘟疫苗研究，包括亚单位疫苗、多肽疫苗和基因缺失疫苗等，但截至目前尚无有效的疫苗问世。因此，目前亟需研发出一种有效的疫苗和防疫手段控制及预防非洲猪瘟病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗和/或预防非洲猪瘟病毒的疫苗及其制备方法，该疫苗通过将编码ASFV抗原的两种mRNA组合，使得基因编码的P72蛋白能够在表达后正确折叠，将该mRNA组合递送至体内后可以机体产生免疫反应。
为了实现上述技术方案，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一目的在于提供一种mRNA序列，所述mRNA的核苷酸序列包括SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2。
本发明所述核苷酸序列SEQ ID NO.1为编码ASFV P72全长蛋白的编码区序列优化得到；核苷酸序列SEQ ID NO.2选自ASFV CAP80蛋白的编码区，该编码区能够辅助P72蛋白正确折叠。
进一步地，所述mRNA还包括如下元件：5’-帽结构、3’-聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR中的至少一种。
5’-帽结构要求为增加mRNA稳定性，避免mRNA被核酸外切酶降解；所述帽结构选自ARCA、m7G(5’)ppp中的一种，优选为m7G(5’)ppp；
所述3’-聚腺苷酸序列为50～200个A，优选为80～200个A。
5’UTR要求为调控mRNA翻译，所述5’UTR包括DNAH2 5’UTR和KOZAK序列；
优选地，所述DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；KOZAK序列如SEQ IDNO.4所示；
3’端聚腺苷酸序列可避免mRNA被核酸外切酶降解；3’UTR要求为调控mRNA翻译；3’UTR为血红蛋白HBA2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二目的在于提供一种非洲猪瘟病毒mRNA疫苗试剂，该疫苗试剂包括上述的mRNA序列。
进一步地，所述疫苗试剂包括脂质体，所述脂质体选自阳离子脂质体、非阳离子脂质体、阳离子脂质体纳米颗粒中的一种，优选为阳离子脂质体纳米颗粒；
所述阳离子脂质体纳米颗粒与mRNA的质量比为3:1～10:1，优选为4:1～8:1。
进一步地，所述阳离子脂质体纳米颗粒的组分包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质、聚乙二醇中的至少一种；优选地，所述阳离子脂质体纳米颗粒的组分包括可电离脂质45～55份、胆固醇25～35份、辅助脂质15～25份、聚乙二醇0.5～2份；更优选的，包括可电离脂质50份、胆固醇29份、辅助脂质20份、聚乙二醇1份。
进一步地，所述可电离脂质为DLin-MC3-DMA；所述辅助脂质为DSPC。
进一步地，所述疫苗试剂还包括佐剂；所述佐剂选自核酸、蛋白、脂多糖和小分子化合物中的至少一种，优选为蛋白，更优选为鱼精蛋白；
所述鱼精蛋白的用量为mRNA用量的0.01～0.1％，优选为0.05％。
本发明的第三目的在于提供一种疫苗试剂的制备方法，包括将上述mRNA与阳离子脂质纳米颗粒混合，得到所述疫苗；
优选地，所述制备方法包括：
(1)将可电离脂质、胆固醇、辅助脂质、聚乙二醇溶于有机溶液，得到有机相；
(2)将mRNA溶于缓冲液中，构成水相；
(3)将有机相与水相混匀得到混合液，用缓冲液将混合液稀释50～100倍后浓缩，将混合液中的溶媒替换为缓冲液，得到疫苗；
优选地，所述有机溶液包括C1～C4低碳醇，优选包括乙醇；
优选地，所述(2)中的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠溶液；
优选地，所述有机相的浓度为3～10mg/ml；
优选地，有机相与水相的体积比为按1：2～4；
优选地，混匀采用微流控设备，流速控制为>3mL/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明开发的疫苗可以使机体产生免疫反应，具有安全性高，易产业化的优点，无需使用细胞增殖病毒或重组蛋白等特点，在安全性和有效性等方面优于传统疫苗；且本发明mRNA疫苗的制备方法相较于之前的传统疫苗制作工艺更简单，降低了疫苗生产的工艺难度，研发快速，可以大规模进行生产，极大降低了生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为mRNA组成结构图；
图2为239T细胞真核表达优化后的P72蛋白免疫印迹图；
图3为293T细胞真核表达未优化的P72蛋白免疫印迹图。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所做出的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
实施例1编码ASFV抗原mRNA的体外转录合成
1、试剂来源
限制性核酸内切酶BtsaⅠ、EcoRV购自于宝生物工程(大连)有限公司，T7 HighYield Transcription Kit、Cap1 Capping System购自与近岸蛋白质科技有限公司，DH5α感受态细胞购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，DNA纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购置于天根生化科技(北京)有限公司，核苷酸片段合成及载体连接由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2、合成核苷酸片段及载体连接
将编码P72蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.6数据(其氨基酸序列为SEQ ID NO.7)导入DNAstar软件当中进行序列分析，并于NCBI的gene bank中获取的DNA序列，进行同源性分析，用MEGA7.0软件构建***发育进化树；通过ProtParam在线网站(https://www.expasy.org/)分析序列翻译后氨基酸构成与蛋白质的理化性质，分别通过SMART(http://smart.embl.de/)和Psipred在线网站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk.psipred)分析蛋白质的功能结构域与二级结构进行预测，通过在线网站Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id＝index)对其三级结构进行预测，分析后得到优化序列SEQ ID NO.1，优化后的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
将优化序列SEQ ID NO.1和编码CAP80蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2两端分别加上3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR，结构如图1所示。
3’端聚腺苷酸序列要求为避免mRNA被核酸外切酶降解；优选地，3’端聚腺苷酸序列为50-200个A，更优选为80-200个A；
5’UTR要求为调控mRNA翻译，包括DNAH2 5’UTR和KOZAK序列；DNAH2 5’UTR如SEQID NO.3所示；KOZAK序列如SEQ ID NO.4所示；
3’UTR要求为调控mRNA翻译；优选地，3’UTR为血红蛋白HBA2的3’UTR序列如SEQ IDNO.5所示。
将上述核苷酸序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并在5’端和3’分别加上酶切位点NheⅠ和AflⅡ的同源臂，然后使用同源重组的方法将上述合成的DNA片段连接至载体PVAX1上，分别命名为PVAX1-P72和PVAX1-CAP80，最后将两个质粒分别转化至DH5α感受态细胞中保存。
3、mRNA体外转录合成
将含有PVAX1-P72和PVAX1-CAP80质粒的大肠杆菌扩大培养后提取质粒；使用限制性核酸内切酶BtsaⅠ、EcoRV对提取的质粒进行酶切；对酶切后的产物使用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收得到完全线性化质粒。
首先使用T7 High Yield Transcription Kit对线性化质粒进行体外转录，具体操作步骤如下：依次加入以下各组分：10×Transcription Buffer 2μl；ATP/GTP/CTP/UTPMix Each各1.5μl；Template DNA Xμl(1μg)；Enzyme Mix 1μl；RNase Free Water Up to20μl。使用移液枪将以上各组分轻轻混匀，短暂离心后37℃孵育3小时。孵育完成后加入1μl的DNaseⅠ，37℃孵育15min，消化转录的DNA模板。
然后使用酚/氯仿纯化法纯化RNA,去除蛋白和大部分游离核苷酸，具体操作如下：a:加入160μl RNase Free Water将产物稀释至180μl；b：加入20μl 3M的醋酸铵(PH5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀；c:加入200μl的酚/氯仿混合液(1：1)进行抽提，室温10000rpm离心5min，将上层溶液(水相)转移至新的RNase Free EP管中；d：加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相；e：加入2倍体积的无水乙醇并混匀，－20℃孵育30min，4℃15000rpm离心15min；f：弃上清并加入500μl预冷的70％乙醇洗涤RNA沉淀，4℃15000rpm离心，弃上清；g：开盖干燥2min，加入50μl RNase Free Water溶解RNA沉淀；h：测浓度后－80℃保存。
最后使用Cap1 Capping System对mRNA进行加帽，具体操作步骤如下：使用RNaseFree Water将50μg mRNA稀释至67μl；然后将mRNA置于65℃加热10min，结束后冰上放置5min：接着依次加入以下各组分：Denatured RNA 67μl；10×Capping Reaction Buffer 10μl；10mM GTP 10μl；20mM SAM 2.5μl；Recombinant RNase Inhibitor(40U/μl)2.5μl；mRNACap2’-O-Methyltransferase(100U/μl)4μl；Vaccinia Capping Enzyme(10U/μl)4μl；37℃反应30min，完成加帽。
实施例2ASFV mRNA真核表达
1、试剂来源
实施例1中制备的mRNA，LipofectamineTM 3000购自于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，ASFV阳性血清购自于青岛瑞尔生物技术有限公司，HRP标记的兔抗猪IgG、高灵敏ECL发光试剂购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
2、ASFV mRNA转染293T细胞操作步骤
将可以稳定生长的239T细胞选择六孔板进行铺板，待细胞生长至60-70％时进行转染。首先将编码P72蛋白的mRNA与编码CAP80蛋白的mRNA按质量分数2比1的比例进行混匀；然后按照lip3000的说明书进行转染。首先配制A液和B液；A液：200μL的Opti-MEM稀释4μg mRNA；B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。在A、B液混合液静置的这20min时，对六孔板进行清洗，吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。待A、B混合液静置完成后，加入转染试剂到每个孔中，6h后更换成完全培养基，继续培养48h。
3、免疫印迹检测ASFV P72蛋白
在细胞转染培养后48h对转染细胞进行总蛋白提取，然后加入6×loading buffer后沸水浴5min进行进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶电转移，使蛋白转移到醋酸纤维素膜上；用1％BSA室温封闭60min，PBST洗涤3次；用ASFV阳性血清孵育60min，TBST洗涤3次；加入HRP标记的兔抗猪IgG，室温孵育60min，TBST洗涤3次；用增强的化学发光试剂盒(ECL)显色并扫描拍照。结果如图2，3所示，表明该mRNA组合可以成功在真核细胞中表达，且具有反应原性。通过图2，3的对比可以看出优化后的P72蛋白mRNA表达更好，没有非特异性条带产生。
实施例3LNP-mRNA疫苗制作
1、试剂来源
实施例1中制作的mRNA，DLin-MC3-DMA、胆固醇、DSPC、聚乙二醇购自于艾伟拓(上海)医药科技有限公司，鱼精蛋白购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，无水乙醇，柠檬酸铵缓冲液。
2、疫苗制备的操作过程
将可电离脂质(DLin-MC3-DMA)、胆固醇、辅助脂质(DSPC)、聚乙二醇按照50％、29％、20％、1％的比例溶于无水乙醇中，总浓度在5-7mg/ml，构成有机相；将编码ASFV P72蛋白的mRNA和编码ASFV CAP80蛋白的mRNA按质量分数1：2的比例混匀再加入0.05％的鱼精蛋白混匀，以0.8-1.2mg/ml的总浓度溶于柠檬酸钠缓冲液中，构成水相；将有机相与水相按1：4的比例，以大于3ml/min的速度使用微流控设备混匀得到LNP-mRNA混合液；将LNP-mRNA混合液使用柠檬酸铵缓冲液将混合液稀释50-100倍，将混合液中的溶媒替换为缓冲液，最后将混合液浓缩至浓度为2mg/ml得到mRNA疫苗。
实施例4LNP-mRNA疫苗免疫小鼠后的效果评估
1、试剂来源
实施例3中制作的疫苗，HRP标记的兔抗鼠IgG、HRP显色底物TMB、2％硫酸终止液购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
2、LNP-mRNA疫苗免疫小鼠
选取7周龄balb/c小鼠雌性、雄性各15只；各选取10只作为免疫组，其中5只免疫未优化的P72蛋白mRNA，5只免疫优化后的P72蛋白mRNA；剩下10只作为空白对照组。对免疫组的小鼠腿部肌肉注射实施例3中的mRNA疫苗各100μl，对空白对照组的小鼠同样采取腿部注射的方式注射100μl的柠檬酸铵缓冲液；在初次免疫3周后，采用同样的方式，同样的剂量进行加强免疫。
3、酶联免疫吸附实验(ELISA)测定小鼠特异性抗体效价
在加强免疫后10天，对小鼠进行尾静脉采血，分离血清后，采用间接ELISA的方法对小鼠进行特异性抗体效价测定。具体操作步骤如下：
将293T细胞表达的两种ASFV P72蛋白分别包被空白酶标板，4℃过夜包被夜；PBST洗涤3次，每孔加入1％BSA37℃封闭2h，PBST洗涤3次，每孔加入100μl梯度稀释的mRNA疫苗免疫血清，37℃作用60min，轻轻震荡；PBST洗涤3次，加入100μl HRP标记的兔抗鼠IgG(1:1000稀释)，37℃作用60min，轻轻震荡；PBST洗涤3次，加入HRP显色底物TMB 100μl，室温15min避光反应；加入100μl 2％的硫酸终止液；OD450检测吸光度，结果如表1，2所示。
表1未优化P72蛋白mRNA免疫小鼠后的抗体检测结果
Figure BDA0003290805540000081
备注：S/N：S为Sample(样本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，通常采用S/N≥2.1为阳性判定标准。
结果显示，免疫未优化P72蛋白的mRNA疫苗小鼠，不存在性别的差异，所有的小鼠稀释2000倍都为阳性(S/N≥2.1)；而对照未免疫的小鼠，OD450值≤0.2，均为阴性(S/N≤2.1)。研究结果表明，本发明制备的mRNA疫苗，具有很好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性保护抗体。
表2优化后mRNA免疫小鼠后的抗体检测结果
Figure BDA0003290805540000082
Figure BDA0003290805540000091
备注：S/N：S为Sample(样本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，通常采用S/N≥2.1为阳性判定标准。
表2的结果显示，免疫优化后P72蛋白的mRNA疫苗小鼠，同样不存在性别的差异，所有的小鼠稀释2000倍都为阳性(S/N≥2.1)；且不同稀释度的S/N值，均高于未优化的P72，可见，采用序列优化，能提高目标蛋白的表达，提升mRNA疫苗的免疫效果。
综上，通过表1和表2的对比可以看出，优化后的P72蛋白mRNA免疫小鼠后的抗体效价显著高于未优化P72蛋白mRNA免疫小鼠后的抗体效价，说明优化后的P72蛋白mRNA在小鼠的体内拥有更高的表达量，免疫原性优于未优化的P72蛋白。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
<110>绵阳市游仙区创新科技产业技术研究院
<120>治疗和/或预防非洲猪瘟病毒的疫苗及其制备方法
<130>  2021
<160>  8
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1941
<212>  DNA
<213>优化ASFV P72
<400>  1
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tccgtagtga aagggtatgt aagagctgca gaactttgat ggaaatttat cgataagatt 300
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tcttatgtcc agatacgttg cgtccgtaat aggggtaata tcttgtttac ctgctgtttg 1080
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ttggttgtcc cagtcatatc cgttgcgagg aaacgtttga agctgaccat gggcccccat 1560
ctgggatgag ccctgaatcg gagcatcctg ccaggaggaa tgacatgcgc ccaatatatg 1620
gtggcctacc atatcatgga aaaagtctcc gtactgggga ataccaaagg taagcttgtt 1680
gcccaatgtg ggggtacccg tatgtggacg tactttattg tattcaaacc ctattgggac 1740
ataaggctta aaatgtgcgt taaaatgcac catatgtgtt tcttcgattt gactcaaagt 1800
gggttcgggg tcgggtttcc cataactttt gttaacattt ttaatgttag agatcctgct 1860
attaagcaag tcttgggcca aaatgatctt gtcggccttc ccatcgttag caataagaca 1920
aaaagctcctcctgatgccat   1941
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<211>  1593
<212>  DNA
<213>  CAP80
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ttgcttaatt ttttcttcgc agtcgtctat aaaatcatac tctcgagctt ttttgatatt 240
tccagatgct ttttctaggt tttttagctc cttaaaggaa agcagtccct taatcccgct 300
atccgtgtga aaggttgaat tatagatgga gagccccgga gcatccgggc cagtttcttg 360
tatatttttt gcttttttgt ggtaaatagt atttcgtaaa atctcttttc ctatctttag 420
gtcttcctca tgacggtcca aaatccgttt tattatttca ttattttgat taaaataatt 480
gtagcgctct ctgttggcct taaagcttcc caggagtgtc cagttgccta attgaatgga 540
tgaaacctct gagaaaatct ggtctttata tttataataa aattcatcaa ccttttgttg 600
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1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn
            20                  25                  30
Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr
        35                  40                  45
Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe
    50                  55                  60
Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His
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Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln
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Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ala Gln Met
        115                 120                 125
Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp
    130                 135                 140
Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro
145                 150                 155                 160
Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu
                165                 170                 175
Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg
            180                 185                 190
Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr
        195                 200                 205
Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr
    210                 215                 220
Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro
                245                 250                 255
Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn
            260                 265                 270
Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln
        275                 280                 285
Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu
    290                 295                 300
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Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp
                325                 330                 335
Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe
            340                 345                 350
Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val
        355                 360                 365
Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Ile Arg Gln Ser Arg Phe Ile Pro Gly
    370                 375                 380
Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly
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Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn
                405                 410                 415
Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg
            420                 425                 430
Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn
        435                 440                 445
Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu
    450                 455                 460
Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn
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Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala
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Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp
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Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val
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Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala
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His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser
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Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp
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Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile
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Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val
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Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala
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Val Leu Arg Tyr Ser Thr
                645
<210>  8
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<212>  PRT
<213>优化ASFV P72
<400>  8
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Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn
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            420                 425                 430
Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn
        435                 440                 445
Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu
    450                 455                 460
Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn
465                 470                 475                 480
Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala
                485                 490                 495
Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Val Ser Phe Gln Asp Arg Asp
            500                 505                 510
Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Ile
        515                 520                 525
Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala
    530                 535                 540
His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser
545                 550                 555                 560
Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ser Ile Lys Thr Pro Asp Asp
                565                 570                 575
Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr
            580                 585                 590
Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile
        595                 600                 605
Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val
    610                 615                 620
Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala
625                 630                 635                 640
Val Leu Arg Tyr Ser Thr
                645

Claims (14)

1.一种mRNA序列组合物，其特征在于，所述mRNA的核苷酸序列为两端含有5’-帽结构、3’-聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR的元件的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的mRNA序列组合物，其特征在于，所述5’-帽结构选自ARCA、m7G(5’)ppp中的一种；所述3’-聚腺苷酸序列为50~200个A。
3.根据权利要求1所述的mRNA序列组合物，其特征在于，所述5’-帽结构为m7G(5’)ppp；所述3’-聚腺苷酸序列为80~200个A。
4.根据权利要求1所述的mRNA序列组合物，其特征在于，所述5’UTR包括DNAH2 5’UTR和KOZAK序列。
5.根据权利要求4所述的mRNA序列组合物，其特征在于，所述DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；KOZAK序列如SEQ ID NO.4所示；
3’UTR为血红蛋白HBA2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种非洲猪瘟病毒mRNA疫苗试剂，其特征在于，包括如权利要求1~5任一项所述的mRNA序列组合物。
7.根据权利要求6所述的疫苗试剂，其特征在于，所述疫苗试剂包括脂质体，所述脂质体选自阳离子脂质体、非阳离子脂质体、阳离子脂质体纳米颗粒中的一种；
所述阳离子脂质体纳米颗粒与mRNA的质量比为3:1~10:1。
8.根据权利要求7所述的疫苗试剂，其特征在于，所述阳离子脂质体纳米颗粒的组分包括可电离脂质、胆固醇、辅助脂质、聚乙二醇中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的疫苗试剂，其特征在于，所述阳离子脂质体纳米颗粒的组分包括可电离脂质45~55份、胆固醇25~35份、辅助脂质15~25份、聚乙二醇0.5~2份。
10.根据权利要求8所述的疫苗试剂，其特征在于，所述可电离脂质为DLin-MC3-DMA；所述辅助脂质为DSPC。
11.根据权利要求6所述的疫苗试剂，其特征在于，所述疫苗试剂还包括佐剂；所述佐剂选自核酸、蛋白、脂多糖和小分子化合物中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的疫苗试剂，其特征在于，所述佐剂为鱼精蛋白；所述鱼精蛋白的用量为mRNA用量的0.01~0.1%。
13.权利要求6~12任一项所述疫苗试剂的制备方法，其特征在于，包括将mRNA与阳离子脂质纳米颗粒混合，得到所述疫苗。
14.根据权利要求13所述疫苗试剂的制备方法，其特征在于，包括：
（1）将可电离脂质、胆固醇、辅助脂质、聚乙二醇溶于有机溶液，得到有机相；
（2）将mRNA溶于缓冲液中，构成水相；
（3）将有机相与水相混匀得到混合液，用缓冲液将混合液稀释50~100倍后浓缩，将混合液中的溶媒替换为缓冲液，得到疫苗；
所述有机溶液包括C1~C4低碳醇；
所述（2）中的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠溶液；
所述有机相的浓度为3~10mg/ml；
有机相与水相的体积比为按1：2~4；
混匀采用微流控设备，流速控制为>3mL/min。
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