CN116925974A - 一株产细菌纤维素的菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一株产细菌纤维素的菌及其应用。所述的产细菌纤维素的菌，已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22145，分类命名为Komagataeibacter xylinus，菌株号为mm01，该菌株能高产细菌纤维素，并且在发酵过程中具备耐糠醛的能力。该菌株能够利用廉价易得的农林废弃物作为发酵原料，通过静态或动态培养高效生产细菌纤维素，不仅有效提高了细菌纤维素的生产效率，降低了细菌纤维素的生产成本，还可适用于工业化大规模制造细菌纤维素。

Description

一株产细菌纤维素的菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产细菌纤维素的菌及其应用。
背景技术
目前，已发现能够合成细菌纤维素微生物大多集中在好氧细菌的九个属，分别是醋杆菌属、根瘤菌属、假单胞菌属、八叠球菌属、无色杆菌属、气杆菌属、产碱菌属、固氮菌属和土壤杆菌。这些菌属都具有可合成细菌纤维素的完整体系。醋杆菌属是最早发现能合成细菌纤维素的菌株，也是目前已知合成细菌纤维素能力最强的的菌株。
细菌纤维素具有高化学纯度、高聚合度、高结晶度、高机械强度和杨氏模量，良好的抗张强度、亲水保水性、生物相容性等优点。因独特的性质被广乏应用于食品、纺织、化妆品、医药等领域，特别是在生物医学、药物载体、增稠剂和食品稳定剂等，市场需求极高，然而细菌纤维素合成成本高，产量低等问题是其规大模化生产和推广应用的瓶颈，研究表明，培养基成本占微生物发酵生产产品过程总成本的50-65％。因此，利用成本低廉，来源广泛的纤维素合成培养基以及筛选高产细菌纤维素的菌种是解决细菌纤维素生产的更关键。目前，醋杆菌具有利用的原料广泛，具有产纤维能力强等特点，是最具有潜力应用于工业化大批量生产的菌株。
近年来随着全球人口的不断增加和低成本生物合成的要求，利用富含纤维素、木质素的废弃物作为原料转化成微生物生长和发酵的碳源显得越来越重要，然而在木质素、纤维素的酸水解、蒸汽***和高温蒸煮预处理过程中会产生糠醛等发酵抑制剂，影响微生物生长，降低生产效率，因此获得在含有抑制剂的水解液中仍能高效产细菌纤维素的菌株极为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株高产细菌纤维素且耐受糠醛的菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述菌在产细菌纤维素中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株产细菌纤维素的菌，分类命名Komagataeibacter xylinus，菌株号为mm01，已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22145，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
其中，所述的产细菌纤维素的菌，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述的产细菌纤维素的菌，其耐受pH 3.0-7.0环境，耐受0-2.0g/L的糠醛浓度。
上述菌株Komagataeibacter xylinus mm01在发酵生产细菌纤维素中的应用也在本发明所保护的范围之内。
具体的，将含有菌株Komagataeibacter xylinus mm01的种子液接种于发酵培养基中进行动态发酵或静态发酵，获得含有细菌纤维素的发酵液。
其中，所述的接种，其接种量为8-12％v/v，优选的接种量为10％v/v。
其中，所述的动态发酵或静态发酵，其发酵条件为：26-32℃，初始pH 4.5-6.0，发酵培养5-9d，优选的发酵条件为：初始pH 5.5，30℃恒温环境下静置发酵培养5d。
其中，所述的发酵培养基，其配方为：10-30g/L碳源、10-25g/L氮源、1.0-2.5g/L无机盐，1.15g/L乙醇；
进一步的，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇中的任意一种，优选葡萄糖，优选的葡萄糖浓度为15g/L；
进一步的，所述的氮源为酪蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母粉、牛肉膏中的任意一种，优选大豆蛋白胨，优选的大豆蛋白浓度为15g/L；
进一步的，所述的无机盐为MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、ZnCl2中的任意一种，优选Na2HPO4，优选的Na2HPO4浓度为2.5g/L。
细菌纤维素的低成本绿色制造是实现其能得到广泛应用的关键。利用成本更低的农林废弃物作为发酵产品的底物是一种可持续发展的途径，不仅有助于实现充分高效利用废弃物，实现资源化利用，同时也降低发酵产细菌纤维素的成本。
糠醛类物质是在高温条件下产生的，这类物质会抑制微生物生长和代谢。因此，将农林废弃物的水解液作为发酵产品的原料用于发酵前往往会进行脱毒处理，然而脱毒过程不仅会造成水解液中总糖含量大量损失，而且脱毒过程步骤繁琐，耗费时间的同时也提高了生产成本。因此，筛选能够耐受糠醛、且能高效产细菌纤维素的菌株，并应用于实际生产中，对利用农林废弃物作为原料、降低细菌纤维素生产成本具有积极意义。
因此，上述菌株Komagataeibacter xylinus mm01在以农林废弃物为原料发酵生产细菌纤维素中的应用也在本发明所保护的范围之内。
具体的，将农林废弃物的水解液作为发酵原料进行动态或静态发酵，获得含有细菌纤维素的发酵液。
其中，所述的农林废弃物为甘蔗渣、稻壳、小麦秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、豆渣中的任意一种或几种的组合，优选玉米秸秆。其中，所述的农林废弃物水解液，其水解时间为30-100min，水解温度为140-180℃。
其中，所述的以农林废弃物水解液作为发酵原料的发酵培养基，其配方为：将农林废弃物水解液用氢氧化钙调整pH至4.5-6.0后，直接作为发酵培养基进行发酵。
其中，所述的发酵条件为：发酵温度26-32℃，初始pH 4.5-6.0，发酵培养5-9d。优选的发酵条件为：氢氧化钙调整pH至4.5-6.0后，30℃培养5天。
上述菌株Komagataeibacter xylinus mm01生产得到的细菌纤维素作为食品调节剂在食品加工领域中的应用也在本发明所保护的范围之内。
有益效果：
1、本发明所述的菌株Komagataeibacter xylinus mm01具备一定的耐糠醛能力，能够耐受2g/L的糠醛浓度，在以农林废弃物的水解液为发酵原料时，实现了以农林废弃物为原料的细菌纤维素的生产，是一种低成本的绿色制造，一种可持续发展的途径，不仅有助于实现充分高效利用废弃物，实现资源化利用，同时也降低发酵产细菌纤维素的成本。
2、本发明分离获得了一株产细菌纤维素的菌株Komagataeibacter xylinusmm01，该菌株相较于其它菌株，能够高产细菌纤维素，提高发酵效率的同时又缩短了产细菌纤维素的发酵周期。
3、本发明通过对产细菌纤维素的发酵培养基进行优化，使得所述的菌株Komagataeibacter xylinus mm01能够通过低成本的发酵培养基高产细菌纤维素。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1Komagataeibacter xylinus mm01的染色体图谱；
图2Komagataeibacter xylinus mm01的相关酶系家族；
图3GO数据库三大分类统计；
图4COG注释分类统计；
图5KEGG数据库注释统计；
图6不同碳源对不同菌株产细菌纤维素产量的影响；
图7葡萄糖浓度对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量的影响；
图8不同氮源对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量的影响；
图9氮源大豆蛋白胨的不同浓度对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量的影响；
图10不同无机盐对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量的影响；
图11无机盐Na2HPO4不同浓度对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量影响；
图12不同发酵温度对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量影响；
图13不同初始pH对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量影响；
图14不同发酵时间对Komagataeibacter xylinus mm01细菌纤维素产量影响；
图15不同产细菌纤维素的菌株在不含糠醛的发酵培养基中的生长能力；
图16不同产细菌纤维素的菌株耐受0.5g/L耐糠醛能力测试；
图17不同产细菌纤维素的菌株耐受1.0g/L耐糠醛能力测试；
图18不同产细菌纤维素的菌株耐受1.5g/L耐糠醛能力测试；
图19不同产细菌纤维素的菌株耐受2.0g/L耐糠醛能力测试；
图20不同产细菌纤维素的菌株耐受2.5g/L耐糠醛能力测试；
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的培养基配方如下：
(1)醋酸菌固体培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO4 2.7g/L，乙醇1.15g/L，琼脂20g/L。
(2)醋酸菌液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO42.7g/L，乙醇1.15g/L。
(3)发酵培养基：碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖或甘露醇)5-35g/L，氮源(酪蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母粉或牛肉膏)酵母粉5-35g/L，无机盐(MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、ZnCl2)0.5-3.0g/L，乙醇1.15g/L。
下述实施例中，所述的产细菌纤维素的醋酸菌菌株AS1、NLQ、CY-1、CE11来源于本实验室保藏。
实施例1菌株的分离鉴定及其全基因组测序
试验材料：实验室保藏的红茶菌(是酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的共生物，2019年4月19日来源于山东省济宁市)；
1、菌株的分离鉴定
(1)菌种的分离：吸取1mL红茶菌液，放入装有9mL生理盐水的离心管中，涡旋震荡充分后，立即吸取1mL悬液加入到装有9mL生理盐水的离心管中，重复该步骤，以获得10-5，10-6，10-7三个稀释梯度。各取以上三个梯度的稀释液100μL，分别涂布于醋酸菌固体培养基上，而后将平板转移到28℃培养箱中培养2天。将具有不同形态、大小的单菌落挑出、编号后，用接种环接种到醋酸菌液体种子培养基中，28℃培养48h后，甘油保藏。
(2)菌株mm01的鉴定：通过HeroGen试剂盒(创英生物，MDP)提取从醋酸菌固体培养基中分离得到的命名为菌株mm01的单菌基因组DNA，并以其为模板进行PCR扩增。将PCR未纯化产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将测序结果(如SEQ ID NO.1所示，为菌株mm01的16S rDNA序列)在NCBI的Genbank数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中比对，选择同源性较高的模式菌株16S rDNA序列，结果表明菌株mm01同源性最高的菌株是Komagataeibacter xylinus。
将菌株mm01送至保藏中心保藏，分类命名为Komagataeibacter xylinus，菌株号mm01，已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22145，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
其中，PCR扩增的引物对：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)；PCR扩增反应体系：总反应体系为20μL，包括2×HeroGenDirect-PCR Mix 10μL，Primer F(10μM)0.5μL，Primer R(10μM)0.5μL，Genomic DNA 0.5μL，ddH2O补至20μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；结束后，72℃延伸10min。
2、Komagataeibacter xylinus mm01的全基因组测序
一、实验方法
(1)DNA的提取：将Komagataeibacter xylinus mm01在醋酸菌液体培养基中于28℃培养48h后，10000rpm转速离心10min后收集菌体沉淀，液氮充分研磨；使用SDS裂解液进行裂解，加入适量的蛋白酶K和巯基乙醇，轻柔颠倒混匀后，冷却到室温并10000rpm离心3min取上清液，向上清液中加入氯仿/异戊醇(24:1v/v)抽提，并抽提2次；然后用异丙醇沉淀DNA，轻微颠倒混匀后10000rpm离心3min；再用75％乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇挥发完全后加入100μL无核酸酶水，得到Komagataeibacter xylinus mm01的DNA样品。
(2)全基因组测序及拼装：将经Nanodrop、Qbuit和电泳检测合格的DNA样品打断成350bp左右的片段，并用探针捕获环化引物两侧的序列，用于后续DNA文库的构建。采用二代+三代测序技术完成基因组的拼接，分别构建Illumina Novaseq 6000文库和Nanopore全基因文库，对获得的测序数据进行质控后利用生物信息学分析手段完成Komagataeibacterxylinus mm01的全基因组完成图绘制。使用fastp软件(https://github.com/OpenGene/fastp)对原始数据进行过滤，过滤标准如下：(1)截除Reads中的测序接头以及引物序列；(2)过滤掉平均质量值小于Q5的reads；(3)过滤掉N个数大于5的reads。经过上述一系列的质量控制之后得到的高质量Reads，即为Clean Data。全基因组测序由南京集思慧远生物科技有限公司完成。
(3)将预测基因和各功能数据库，包括GO(http://geneontology.org/)、COG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和CAZy等进行BLAST比对，再对BLAST结果过滤，对于每一条序列的BLAST结果，选取得分最高的比对结果(默认identity>＝40％，coverage>＝40％)进行注释。
二、实验结果
(1)全基因组测序：经Illumina HiSeq平台高通量测序得到Komagataeibacterxylinus mm01的全基因组有效序列长度为3640771bp，GC含量为63.25％，总共预测得到3185个开放阅读框，rRNA和tRNA分别有15和58个。此外，Komagataeibacter xylinus mm01还含有6个质粒。Komagataeibacter xylinus mm01染色体图谱如图1所示。
(2)CAZy注释结果：微生物对碳水化合物的水解是多种生物化学过程的结合，这些过程负责碳水化合物的形成、降解和转化。在这样的环境中，所使用的代谢途径和产生的代谢物完全由微生物群落的酶机制决定。通过碳水化合物酶相关的专业数据库CAZy获得的注释结果，分析Komagataeibacter xylinus mm01催化碳水化合物降解、修饰以及生物合成的相关酶系家族(图2)。发现，糖苷水解酶(GH)相关基因最多，为129个，是裂解糖苷、葡聚糖和糖缀合物中的糖苷键的酶。注释到糖基转移酶的相关基因数量为87个，这是一类催化糖基链合成的酶，通过糖基残基从供体底物转移到受体，它们在寡糖和多糖的生物合成途径以及蛋白质糖基化和有价值的天然产物的形成中发挥着关键作用。此外，还有辅酶相关基因22个，糖类酯解酶(CE)相关基因17个。
(3)GO、COG、KEGG数据库注释结果：根据GO数据库注释结果，Komagataeibacterxylinus mm01有2455个基因得到注释，并依照其功能分为三大类：是细胞组分(cellularcomponent)、生物过程(biological process)和分子功能(molecular function)。GO数据库三大分类统计结果如图3所示。COG注释中，数量最多的是一般功能预测基因(Generalfunction prediction only)，其次为氨基酸的运输和代谢(Amino acid transport andmetabolism)、复制、重组和修复(Replication,recombination and repair)和碳水化合物运输和代谢(carbohydrate transport and metabolism)(图4)。KEGG数据库注释中数量最多的是碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)(图5)。
以上结果表明，Komagataeibacter xylinus mm01基因功能与细胞代谢密切相关，参与了多种物质代谢途径转化，并有助于形成细菌纤维素。
实施例2不同菌株产细菌纤维素能力分析
一、实验方法：
(1)种子活化：将冰箱4℃保存的产细菌纤维素的醋酸菌菌株AS1、NLQ、CY-1、CE11和实施例1分离鉴定得到的Komagataeibacter xylinus mm01分别接种到醋酸菌固体培养基上，在28℃恒温培养24h至平板上长出新的菌落。
(2)扩大培养：将步骤(1)种子活化成功的各菌株分别用接种环挑取平板培养的菌株转接到装有醋酸菌液体种子培养基，于28℃下在150r/min的摇床中培养约12h；在600nm波长下测得OD值3.5左右，制成种子液，备用。
(3)发酵实验：碳源是组成培养基的主要成分之一，主要有两个功能：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和所必需的碳成分；二是为菌体合成目的产物提供所需的碳成分。大多数微生物都能利用糖类作为碳源，但由于各种微生物的生理特性不同，每一种微生物所能利用的碳源种类也有所不同。Komagataeibacter xylinus可利用多种碳源来合成纤维素。因此，本实施例在发酵实验时分别选取20g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇作为唯一碳源进行静态发酵。
按10％的接种量(v/v)将各菌株的种子液分别接种于经过灭菌处理的发酵培养基中(发酵培养基配方：碳源20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，Na2HPO4 2.7g/L，乙醇1.15g/L)，充分摇匀使种子液均匀分布于发酵培养基内。将培养容器置于28℃恒温环境下静置培养7天。然后提取、处理和测定培养7天后培养基中形成的细菌纤维素膜。
其中，细菌纤维素膜的提取、处理和测定方法如下：将培养基中的细菌纤维素膜用镊子取出后，用蒸馏水多次冲洗，除去表面培养基及杂质。再将膜放在蒸馏水中浸泡2天，然后将其放入浓度为0.1mol/L的NaOH溶液中煮沸40min，去除膜中的菌体和残留培养基，使膜呈乳白色半透明状，最后用去离子水多次冲洗，测pH值至中性。将细菌纤维素置于60℃烘箱中完全干燥后，膜变成一张白色薄膜，所得膜定义为细菌纤维素干膜。用电子天平对细菌纤维素膜进行称重，并计算细菌纤维素产量，计算公式如下：
二、实验结果
本实施例在发酵实验时分别选取20g/L的葡萄糖、蔗糖、果糖和甘露醇作为唯一碳源进行静态发酵，发酵培养7天后的细菌纤维素膜的颜色为浅黄色，且膜具有一定的柔韧性并富含水分。发酵7天后细菌纤维素产量如图6所示。
从图6可以看出，五种菌株(AS1、NLQ、CY-1、CE11和mm01)都能利用本实验所选的所有碳源，在不同碳源下发酵制备细菌纤维素的结果趋势尽管一致，但不同菌株对碳源的利用以及产细菌纤维素的能力不尽相同，细菌纤维素的产量差异较大。菌株mm01细菌纤维素产量最高为11.68g/L；其他碳源制备的细菌纤维素产量均低于3g/L，因此菌株mm01产细菌纤维素能力明显高于其它菌株，比其他菌株高3倍左右。另外，从图中可以发现葡萄糖是五种菌株产细菌纤维素的最佳碳源。
实施例3 Komagataeibacter xylinus mm01的发酵制备细菌纤维素条件优化
一、实验方法优化
(1)发酵培养基优化：分别配置不同葡萄糖浓度(5、10、15、20、25、30、35g/L)不同氮源(酪蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母粉、牛肉膏)、不同氮源浓度(5、10、15、20、25、30、35g/L)、不同无机盐(MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、ZnCl2)、不同无机盐浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/L)和1.15g/L乙醇制成优化的发酵培养基，按10％的接种量(v/v)将种子液接种于经过灭菌处理的优化的发酵培养基中，接种后充分摇匀，使得种子液均匀分布于培养基内。将培养容器置于28℃恒温环境下静置培养7天。
(2)发酵温度优化：按10％的接种量(v/v)，将种子液接种于经过灭菌处理的发酵培养基中，接种后充分摇匀，使得种子液均匀分布于培养基内。将培养容器置于不同温度(24、26、28、30、32、34℃)恒温环境下静置培养7天。
(3)初始pH值优化：按10％的接种量(v/v)，将种子液接种于经过灭菌处理的不同初始pH(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)的发酵培养基中，接种后充分摇匀，使得种子液均匀分布于培养基内。将培养容器置于30℃恒温环境下静置培养7天。
(4)发酵时间优化：按10％的接种量(v/v)，将种子液接种于经过灭菌处理的初始pH 6.0的发酵培养基中，接种后充分摇匀，使得种子均匀分布于培养基内。将培养容器置于30℃恒温环境下静置培养不同时间(3、4、5、6、7、8、9d)。
发酵培养制备得到的细菌纤维素膜，其提取、处理和测定方法同实施例2。
二、实验结果
(1)发酵培养基优化结果：
1)葡萄糖浓度优化：结果如图7所示，细菌纤维素产量随着葡萄糖浓度的增加而提高，但当浓度增加到一定程度时，产量反而降低，出现这一现象的原因可能是糖类作为碳源和能源促使菌体进行生长代谢，而纤维素作为次生代谢产物，只有当菌体生长到稳定期左右才可能会合成纤维素，因此细菌纤维素的产量随着碳源浓度的增加而提高；而当葡萄糖浓度较高时，大量的糖会分解产生代谢产物如葡萄糖酸则会显著降低培养液的pH，从而抑制菌体产细菌纤维素膜。当葡萄糖浓度为15g/L时，细菌纤维素产量达到最大值为12.70g/L。当葡萄糖浓度大于15g/L时，其产量逐渐降低。因此，最佳葡萄糖浓度为15g/L。
2)氮源种类优化：生物发酵普遍需要氮源作为能源物质提供生长所必须的养分，无机氮和有机氮在一定范围内时，纤维素的产量与细菌的生长量有很大关系，当细菌的生长量高时，纤维素的产量也较高。不同微生物生长所需要的氮源各不相同，因此实验想获得高产的结果，需要选用适合菌株Komagataeibacter xylinus mm01生长的氮源来进行细菌纤维素的合成。由图8可知，以大豆蛋白胨、酵母粉、酪蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏为氮源时，细菌纤维素产量较高，均达到5g/L以上，尤其当以大豆蛋白胨为氮源时，细菌纤维素产量最高为13.65g/L。由于酵母粉、酪蛋白胨和胰蛋白胨的生产成本较高，其价格分别高达1000元/kg、600元/kg和500元/kg，在实际生产中需要选用更经济合理的氮源物质；考虑以后的工业化成本，选择大豆蛋白胨作为后期实验氮源。
3)氮源浓度优化：如图9所示，以大豆蛋白胨作为氮源，随着氮源浓度的增加，细菌纤维素产量逐渐提高再降低。当大豆蛋白胨浓度为15g/L，纤维素产量最高为14.21g/L。
4)无机盐种类优化：无机盐是微生物生长的一个重要影响因素，故研究无机盐具有重要意义。在碳、氮源试验确定的优化发酵培养基中加入无机盐。实验结果如图10所示。无机盐ZnCl2、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4对纤维素产量均有促进作用，其中Na2HPO4促进作用最强，进一步选取Na2HPO4进行后续优化。
5)无机盐浓度优化：以Na2HPO4作为优选无机盐进行浓度优化，结果如图11所示，由发酵结果可知，当Na2HPO4浓度为2.5g/L，细菌纤维素产量达到最大为14.89g/L。
(2)发酵温度优化：温度对于菌体的生长和代谢是至关重要的，适宜的温度是保证菌体正常产生细菌纤维素的一个重要保证。由图12可知，温度对细菌纤维素产膜影响很大，菌株的最佳产膜温度为30℃，而且当温度低于30℃时，产膜量随温度的升高而升高，但当温度超过该值后，产膜量明显下降。当温度为30℃时，细菌纤维素产量最大为15.41g/L。
(3)初始pH值优化：在微生物的生长和细菌纤维素的合成中，pH值是一个重要的因素，它对菌体的生长和产物的积累有很大的影响。本实验中，初始pH值分别以NaOH和HCl调至所需pH，实验结果如图13所示，菌株Komagataeibacter xylinus mm01在pH值4.5-6.0范围内生长较好。最适产膜初始pH 5.5，此时细菌纤维素产量最大为18.67g/L，当低于或者高于该值时，产膜量明显降低，这可能是因为菌株Komagataeibacter xylinus mm01在生长代谢时往往会产酸，而长期的进化使得菌体适应了酸性的条件，所以酸性的条件更有利于其生长以及产膜，而碱性的条件则会使菌体难以生长。
(4)发酵时间优化：发酵时间对于菌体的生长和代谢也是至关重要的，适宜的发酵时间不仅可以提高生产细菌纤维素的效率，而且可以节约成本，增大产值。由图14可知，随着发酵时间的延长，细菌纤维素产量逐渐增加，在第5天达到平衡为19.85g/L，所以发酵时间选择5d较适宜。
综上，菌株Komagataeibacter xylinus mm01发酵制备细菌纤维素，其优化后的发酵培养基为：葡萄糖15g/L、大豆蛋白胨15g/L、Na2HPO4 2.5g/L和1.15g/L乙醇，初始pH 5.5，发酵温度30℃，发酵时间5d。
实施例4 Komagataeibacter xylinus mm01的糠醛耐受性
细菌纤维素的低成本绿色制造是实现其能得到广泛应用的关键。利用成本更低的农林废弃物作为发酵产品的底物是一种可持续发展的途径，不仅有助于实现充分高效利用废弃物，实现资源化利用，同时也降低发酵产细菌纤维素的成本。
糠醛类物质是在高温条件下产生的，这类物质会抑制微生物生长和代谢。因此，将农林废弃物的水解液作为发酵产品的原料用于发酵前往往会进行脱毒处理，然而脱毒过程不仅会造成水解液中总糖含量大量损失，而且脱毒过程步骤繁琐，耗费时间的同时也提高了生产成本。因此，筛选能够耐受糠醛、且能高效产细菌纤维素的菌株对利用农林废弃物作为原料、降低细菌纤维素生产成本具有积极意义。
一、菌株耐糠醛能力测试
比较产细菌纤维素的醋酸菌菌株AS1、NLQ、CY-1、CE11和实施例1分离鉴定得到的菌株Komagataeibacter xylinus mm01的耐糠醛能力。将冰箱4℃下保存的上述五种菌株分别接种到醋酸菌固体培养基中，在26℃恒温培养24h至平板上长出新的菌落，挑取单菌落分别接种到5mL醋酸菌液体种子培养基中，培养活化至生长对数期，用灭菌好的蒸馏水调整OD600为3.0，按3％(v/v)的接种量分别接入40mL含0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5g/L糠醛梯度的发酵培养基(发酵培养基为实施例3优化后的发酵培养基)中，30℃，150rpm，每隔数小时后取样测OD600值。
如图15所示，在不含糠醛的发酵培养基中，五种菌株的生长无显著差异，接种后较快地进入对数生长期，并都在24h左右到达稳定期，最大的OD600值约为3.9。而在糠醛的胁迫下，五种菌株需要一定的时间将糠醛还原成毒性更小的糠醇等物质，使得生长延滞期有了一定的增加，但是进入对数生长期后比生长速率会恢复到正常的水平。由图16-18可知，在含0.5g/L(图16)、1.0g/L(图17)、1.5g/L(图18)糠醛浓度的发酵培养基中，随着糠醛浓度的升高，五种菌株的生长延滞期也相应的延长，并且在OD600为3.6左右达到稳定期，与不含糠醛的发酵培养基中最大OD600值相比有所下降，而菌株Komagataeibacter xylinus mm01的生长延滞期在0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L糠醛浓度下，比其他菌株缩短了4h、8h、4h左右。如图19所示，在糠醛浓度为2.0g/L的发酵培养基中，菌株Komagataeibacter xylinus mm01的生长能力较其它菌株有明显的优势，在32h的OD600值为3.41，而其它菌株生长能力较弱。如图20所示，在糠醛浓度达到2.5g/L时，各菌株生长都受到了极大限制，但菌株Komagataeibacter xylinus mm01的OD600值仍然是五种菌株中最高的，这显示了菌株Komagataeibacter xylinus mm01耐受糠醛的能力较强，能够为后续的生产利用带来更多的经济价值。
二、不同水解时间和温度下玉米秸秆水解液的制备
采用发酵培养基生产细菌纤维素成本高，而农林废弃物来源广泛，如农业秸秆(玉米、小麦、水稻和高粱等)和甘蔗渣等，且成本低廉。农业秸秆中纤维素含量较高，通过水解、纯化、富集等技术可以得到发酵的单糖，成为生产细菌纤维素的碳源原料。然而，对农业秸秆水解过程中会产生糠醛等对微生物生长有抑制作用的物质，因此需要对水解液进行脱毒处理。采用活性炭吸附、离子交换、漆酶处理等脱毒方法会造成水解液中碳源损失严重和成本高等问题，因此筛选耐受糠醛等抑制物的微生物为细菌纤维素的低成本制备提供了可能。
本实施例以农林废弃物玉米秸秆为原料，玉米秸秆水解液的制备方法如下：玉米秸秆用粉碎机粉碎至200目，然后用去离子水浸泡并洗涤三次以除去污染物。将其放在通风处晾干。研究不同温度和时间对乙酸酸水解玉米秸秆水解液中总糖和糠醛的影响，取一定质量的秸秆粉末放入反应釜中，加入3％(w/v)乙酸，固液比为1:10。将反应液分别放入140℃、160℃和180℃分别水解30min、60min和100min，水解结束后除去滤渣，得到水解液。
结果如表1所示。水解反应会随着温度和时间的增加而变得剧烈，玉米秸秆中的纤维素和半纤维素会降解形成单糖，同时也会形成糠醛类物质。随着水解温度和时间的增加，总糖和糠醛含量增加。当水解温度为180℃，水解时间为60min时，总糖含量为31.29g/L，糠醛含量也达到2.47g/L。
表1温度和时间对玉米秸秆水解液中总糖和糠醛含量的影响
三、菌株Komagataeibacter xylinus mm01在玉米秸秆水解液中产细菌纤维素情况
将Komagataeibacter xylinus mm01按3％(v/v)接入上述不同水解温度和水解时间的玉米秸秆水解液中，用氢氧化钙调整pH至4.5-6.0，30℃培养5天，其在不同玉米秸秆水解液中细菌纤维素的产量如表2所示。当玉米秸秆水解温度为180℃，水解时间为100min时，尽管水解液中含有丰富的糖分，但糠醛含量达到3.89g/L，此时完全抑制了mm01的生长，无法产生细菌纤维素。当水解液中糠醛含量为0.56-1.84g/L时，mm01能正常产生细菌纤维素，产量为3.12-7.06g/L。
表2水解不同温度和时间的玉米秸秆水解液对细菌纤维素产量的影响
注：ND表示未检测到细菌纤维素的产生。
实施例5 Komagataeibacter xylinus mm01产细菌纤维素应用于肉肠加工
细菌纤维素肉肠配方：(下述实验组中％表示质量百分比)
实验组1：肥肉7.5％，细菌纤维素7.5％，味精0.2％，五香粉0.1％，水33.6％，瘦猪肉40％，大豆分离蛋白5％，食盐3％，胡椒粉0.1％，白糖3％。
实验组2：肥肉15％，细菌纤维素0％，味精0.2％，五香粉0.1％，水33.6％，瘦猪肉40％，大豆分离蛋白5％，食盐3％，胡椒粉0.1％，白糖3％。
实验组3：肥肉0％，细菌纤维素15％，味精0.2％，五香粉0.1％，水33.6％，瘦猪肉40％，大豆分离蛋白5％，食盐3％，胡椒粉0.1％，白糖3％。
根据GB/T 22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》，选取15名经过食品感官专业训练的人员，对肉肠进行感官评价，从肉肠的颜色、气味、口感、组织状态等方面进行评价。通过对添加细菌纤维素的肉肠进行感官评定发现(见表3)，添加了7.5％细菌纤维素的肉肠(实验组1)在颜色、气味、口感、组织状态方面与实验组2的肉肠没有明显差别。添加了15％细菌纤维素的肉肠(实验组3)在颜色、气味、口感方面与实验组2的肉肠没有明显差别，但是在组织状态方面有一些细微差别，比如切片略显松散。以上结果表明，使用细菌纤维素可一部分替代，甚至完全代替肉肠中的肥肉，最大限度降低了肉肠的热量。而肉肠中没有脂肪所带来的组织状态方面的不足，后期则可以通过卡拉胶等胶体配合细菌纤维素使用而得到改善，使肉肠的口感更好。
表3肉肠感官评定
实验组1 实验组2 实验组3
咀嚼感 强 强 强
肠体弹性 一般 一般 一般
切片空洞 无空洞 无空洞 略有空洞
切片松散程度 紧密 紧密 略松散
切片性 切面整齐 切面整齐 稍有破裂
气味 肉香味，无异味 肉香味 肉香味，无异味
色泽 微白色 微白色 微白色
本发明提供了一株产细菌纤维素的菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一株产细菌纤维素的菌，分类命名Komagataeibacter xylinus，菌株号为mm01，已于2021年04月09日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22145。
2.根据权利要求1所述的菌，其特征在于，所述的产细菌纤维素的菌，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的菌，其特征在于，所述的产细菌纤维素的菌，其耐受pH 3.0-7.0环境，耐受0-2.0g/L的糠醛浓度。
4.权利要求1-3任意一项所述的菌在发酵生产细菌纤维素中的应用。
5.权利要求1-3任意一项所述的菌在以农林废弃物水解液为原料发酵生产细菌纤维素中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将含有菌的种子液接种于发酵培养基中进行动态发酵或静态发酵，获得含有细菌纤维素的发酵液。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的接种，其接种量为8-12％v/v；所述的动态发酵或静态发酵，其发酵条件为：26-32℃，初始pH 4.5-6.0，发酵培养5-9d，优选的发酵条件为：初始pH 5.5，30℃恒温环境下静置发酵培养5d。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基，其配方为：10-30g/L碳源、10-25g/L氮源、1.0-2.5g/L无机盐，1.15g/L乙醇；
其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇中的任意一种，优选葡萄糖，优选的葡萄糖浓度为15g/L；
所述的氮源为酪蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、酵母粉、牛肉膏中的任意一种，优选大豆蛋白胨，优选的大豆蛋白浓度为15g/L；
所述的无机盐为MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、ZnCl2中的任意一种，优选Na2HPO4，优选的Na2HPO4浓度为2.5g/L。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的农林废弃物为甘蔗渣、稻壳、小麦秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、豆渣中的任意一种或几种的组合。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的农林废弃物水解液，其水解时间为30-100min，水解温度为140-180℃。
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