CN112674257A - 一种高降解黄曲霉毒素b1的生物方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物学技术领域，具体公开了一种高降解黄曲霉毒素B1的生物方法。具体为通过浑浊红球菌PD630的发酵液对黄曲霉毒素B1进行降解；所述浑浊红球菌PD630菌株保藏编号为DSMZ 44193。本发明首次应用浑浊红球菌PD630高效降解黄曲霉毒素，浑浊红球菌PD630通过产生胞外代谢物降解黄曲霉毒素B1，在AFB1终浓度为0.4μg/mL的培养基中，PD630菌株培养72h后对AFB1的降解率高达93％。其次浑浊红球菌可高密度培养，所得培养上清液具有良好的热稳定性，并且可以利用多种碳源，具有高基质耐受性，在应用上具有显著优势，无论是制备生物降解菌剂还是无菌酶制剂都具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物学技术领域，特别涉及一种高降解黄曲霉毒素B1的生物方法。
背景技术
黄曲霉毒素是一类霉菌产生的次级代谢产物，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生。它是一类结构相似的化合物，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、M1等。黄曲霉毒素主要污染花生、玉米等粮食谷物，对人和动物具有致癌、致畸和肝毒性作用。黄曲霉毒素B1(AFB1)被认为是现今食品与饲料中污染最为广泛且危害性最大的天然真菌毒素。
目前脱除AFB1的方法主要有物理法、化学法及生物法。物理法包括高温、辐射、吸附等，化学法包括氧化剂及碱处理等。这些方法虽然脱除率高，但是所需处理条件苛刻，容易造成食品中营养成分的丧失甚至由于处理剂的残留造成食品二次污染。生物法脱毒条件温和，具有高效特异性，不会对食品及饲料中的营养成分产生影响。目前，生物法脱除霉菌毒素已经成为的脱毒领域研究热点。
迄今为止，已经发现多种微生物对AFB1具有降解或者吸附作用。例如乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、链球菌、假单胞菌等。红球菌是一类革兰氏阳性菌，属于放线菌、诺卡氏菌科，可以降解如烷烃、苯类、乙腈等有毒有害物质。研究显示，红球菌属内不同菌种对AFB1的降解能力差异很大，并不是菌属内所有菌种都有降解活性(参考文献：1、邱孜博,汪荣,张杨,et al.红球菌及其生物降解作用研究进展[J].食品科学,2016,37(7):254-258.2、Risa A,Krifaton C,Kukolya,József,et al.Aflatoxin B1 and Zearalenone-DetoxifyingProfile of Rhodococcus Type Strains[J].Current Microbiology,2018.)。
浑浊红球菌PD630目前已经广泛用于研究脂质的生物合成和积累，是具有高价值的三酰基甘油生产菌株。其具有高基质耐受性，易适应各种生存环境，并且基因组测序和遗传操作***已经完善，具有较高研究价值和开发潜力。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种高降解黄曲霉毒素B1的生物方法。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，具体为通过浑浊红球菌PD630的发酵液对黄曲霉毒素B1进行降解；所述浑浊红球菌PD630菌株保藏编号为DSMZ 44193。
一种高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，具体步骤如下所示：
将浑浊红球菌PD630菌株在营养肉汤培养基中进行活化，得到菌株活化液；然后将菌株活化液接种于含黄曲霉毒素B1的样品中，即可发酵降解黄曲霉毒素B1。
所述活化的温度为20～35℃，活化时间为24～48h。
所述菌株活化液以5％～20％接种量接种于含黄曲霉毒素B1的样品；
所述发酵降解的温度为20～35℃，发酵降解的时间为48～72h。
所述样品为受黄曲霉毒素B1污染的饲料、食品。
本发明所述室温和未指明的温度均为20～37℃。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明首次应用浑浊红球菌PD630高效降解黄曲霉毒素，在AFB1终浓度为0.4μg/mL的营养肉汤培养基中，PD630菌株培养72h后降解率可以高达93％，降解效果十分优秀。
(2)浑浊红球菌可高密度培养，并且可以利用多种碳源，具有高基质耐受性，在应用上具有显著优势。
(3)浑浊红球菌PD630通过产生胞外代谢物降解黄曲霉毒素B1，且发酵所得胞外代谢物非诱导产生，无论是制备生物降解菌剂还是无菌酶制剂都具有广阔的应用前景。
(4)浑浊红球菌PD630的培养上清液具有优秀的热稳定性，高温处理后仍然具有对AFB1的高降解活性，可在实际应用时承受食品加工中的苛刻条件。
附图说明
图1为实施例3中不同时间浑浊红球菌PD630对黄曲霉毒素B1降解率图。
图2为实施例4中浑浊红球菌PD630接种量对降解黄曲霉毒素B1的影响图。
图3为实施例5中发酵液、无细胞上清液、细胞悬液和细胞内容物的黄曲霉毒素B1降解率图。
图4为实施例6中浑浊红球菌PD630培养上清液的热稳定性图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
浑浊红球菌PD630菌株保藏编号为DSMZ 44193，购买自北京北纳创联生物技术研究院。
实施例1
浑浊红球菌PD630菌株活化液的制备
浑浊红球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630，DSMZ 44193)接种于营养肉汤培养基中，于30℃、160rpm的条件下培养24h得到菌株活化液，用于后续黄曲霉毒素B1降解实验。
实施例2
高效液相色谱法测定浑浊红球菌PD630降解黄曲霉毒素B1
将实施例1中得到的菌株活化液以10％接种量接种于黄曲霉毒素B1(AFB1)终浓度为0.4μg/mL的营养肉汤中，以AFB1浓度相同但不接种的培养基作为空白对照。在30℃、160rpm共培养72h后，测定发酵液中AFB1的含量。
将实验组和空白对照离心取上清液，二氯甲烷萃取上清液中的AFB1，50℃氮气下吹干二氯甲烷，甲醇复溶，0.22μm有机滤膜过滤。使用高效液相色谱法对AFB1进行测定，检测器为紫外检测器，检测波长为365nm。
AFB1降解率＝(1-测定样品中AFB1峰面积/空白对照AFB1峰面积)×100％。
实验结果表明，在AFB1终浓度为0.4μg/mL的营养肉汤培养基中，PD630菌株培养72h后降解率可以高达93％，浑浊红球菌PD630菌株发酵液对AFB1具有高降解活性。
实施例3
不同培养时间对浑浊红球菌PD630降解黄曲霉毒素B1的影响
将实施例1中得到的菌株活化液以10％接种量接种于AFB1终浓度为0.4μg/mL的营养肉汤培养基中，空白对照为AFB1浓度相同但不接种的NB培养基，在0，12，24，36，48，60，72h分别取样，测定培养液AFB1含量变化。
图1为实施例3中不同时间浑浊红球菌PD630对黄曲霉毒素B1降解率图。结果显示，PD630菌株培养48h得到的发酵液对AFB1降解率为89.6％，60h发酵液对AFB1降解率为91.4％，72h发酵液对AFB1降解率为93.2％。
实施例4
浑浊红球菌PD630接种量对降解黄曲霉毒素B1的影响
将实施例1中得到的菌株活化液分别以5％、10％、15％、20％接种量接种于AFB1终浓度为0.4μg/mL的营养肉汤培养基中，空白对照为AFB1浓度相同但不接种的营养肉汤培养基，在30℃、160rpm下培养72h测定发酵液残余AFB1的含量。
图2为实施例4中浑浊红球菌PD630接种量对降解黄曲霉毒素B1的影响图。结果显示，当PD630菌株接种量为20％，培养72h得到的发酵液对AFB1降解率最高，为95.81％。当PD630接种量为5％、10％、15％时，培养72h得到的发酵液对AFB1降解率分别为79.33％、90.23％、94.01％。
实施例5
浑浊红球菌PD630降解黄曲霉毒素B1机制初步分析
将实施例1中得到的菌株活化液以10％接种量接种于营养肉汤培养基中，在30℃、160rpm培养72h，培养所得的发酵液作以下处理：低温高速离心后取上清，经0.22μm滤膜过滤得到无细胞上清液；离心所得菌沉淀用无菌生理盐水清洗三次后重悬得到菌悬液；取部分菌悬液在细胞超声破碎仪破碎后，低温离心后0.22μm滤膜过滤得到细胞内容物。上述三种处理液中加入终浓度为0.4μg/mL的AFB1溶液，在30℃避光反应72h后测定培养基中的AFB1含量，以含有同浓度AFB1的无菌营养肉汤培养基作为空白对照。
图3为实施例5中发酵液、无细胞上清液、细胞悬液和细胞内容物的黄曲霉毒素B1降解率图。实验结果显示，PD630菌株对AFB1的降解机理主要为胞外上清液作用，胞外上清液处理72h后AFB1的降解率为81.72％，并且这种降解活性是菌株非诱导所产生的代谢物。
实施例6
浑浊红球菌PD630培养上清液热稳定性研究
将实施例1中得到的菌株活化液以10％接种量接种于营养肉汤培养基中，在30℃、160rpm培养72h得到发酵液，低温高速离心后取上清，经过0.22μm滤膜过滤得到无细胞上清液。上清液分别用沸水加热处理20min及高温高压(121℃，0.1MPa)处理10min，处理结束后加入最终浓度为0.4μg/mL的AFB1溶液，30℃避光反应72h后测定培养中基的AFB1含量。
图4为实施例6中浑浊红球菌PD630培养上清液的热稳定性图。结果表明，PD630菌株无细胞上清液在沸水浴处理20min后对AFB1的降解活性为85.31％，高温高压处理后对AFB1的降解活性为83.00％。上清液具有热稳定性的优势有益于在实际应用时承受食品加工中的苛刻条件，在制备脱毒剂时可以忽略温度影响，保证降解活性。
实施例7
浑浊红球菌PD630应用降解污染玉米中的黄曲霉毒素B1
在20g无菌玉米粒中加入60mL无菌蒸馏水，加入终浓度为100μg/kg的AFB1。体系平衡12h后，经实施例1中描述的方法得到的PD630菌株活化液以10％(v/v)接种于玉米粒中，于室温发酵处理72h后，收集样品。取5g样品，粉碎后加入25mL 80％甲醇水溶液，涡旋振荡器震荡5min，提取结束后离心取上清液，按照黄曲霉毒素B1快速检测盒(粮食适用)的要求进行黄曲霉毒素B1含量的检测。
实验结果表明，100μg/kg AFB1污染的玉米粒经过浑浊红球菌PD630室温发酵处理后，测定玉米粒中的AFB1含量降低为26.55μg/kg，降解率可以达到73％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，其特征在于：具体通过浑浊红球菌PD630的发酵液对黄曲霉毒素B1进行降解；
所述浑浊红球菌PD630菌株保藏编号为DSMZ 44193。
2.根据权利要求1所述高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，其特征在于具体步骤如下所述：
将浑浊红球菌PD630菌株在营养肉汤培养基中进行活化，得到菌株活化液；然后将菌株活化液接种于含黄曲霉毒素B1的样品中，即可发酵降解黄曲霉毒素B1。
3.根据权利要求2所述的高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，其特征在于：所述菌株活化液以5％-20％接种量接种于含黄曲霉毒素B1的样品。
4.根据权利要求2或3所述的高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，其特征在于：所述发酵降解的温度为20～35℃，发酵降解的时间为48～72h。
5.根据权利要求2或3所述的高降解黄曲霉毒素B1的生物方法，其特征在于：所述活化的温度为20～35℃，活化时间为24～48h。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113558175A (zh) * | 2021-08-10 | 2021-10-29 | 赞皇县光森中药材有限公司 | 一种酸枣仁中黄曲霉毒素的降解方法及装置 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN104745493A (zh) * | 2013-12-27 | 2015-07-01 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 降解黄曲霉毒素b1的红城红球菌菌株的分离、培养和使用方法 |
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2019
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Patent Citations (1)
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| CN113558175A (zh) * | 2021-08-10 | 2021-10-29 | 赞皇县光森中药材有限公司 | 一种酸枣仁中黄曲霉毒素的降解方法及装置 |
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