CN109251869B - 一株高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌 - Google Patents

一株高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效利用粗甘油生产1,3‑丙二醇的克雷伯氏菌。命名为Klebsiellasp.2e，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15520。本发明弥补了常规微生物利用粗甘油生产1,3‑丙二醇过程中，受粗甘油杂质的抑制导致微生物生长困难、相关酶活低下及1,3‑丙二醇产率不高等不足。本发明所述菌株Klebsiella sp.2e在含有36 g粗甘油（甘油含量为69%）的培养基中，于37℃，170 rpm条件下培养12 h后，消耗的甘油量达19.44±0.61 g/L，可产生9.83±0.75 g/L的1,3‑丙二醇，产率达到了0.62 mol 1,3‑丙二醇/mol甘油。

Description

一株高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一株高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌。
背景技术
粗甘油是生物柴油产业中的主要副产物，平均每生产10kg生物柴油，约有1kg粗甘油产生，全球约有67％的粗甘油来源于生物柴油的生产据统计全球约有67％的粗甘油来源于生物柴油工业生产。粗甘油中的甘油含量仅为35％～50％，还含有大量的醇类、盐类、皂类、重金属、色素以及残余脂肪酸等杂质。粗甘油的产量巨大且精制成本高，若不及时处理和利用，不仅不利于生物柴油生产成本降低，而且可能成为新的污染源。通过微生物发酵将粗甘油直接转化成高值化学品如1,3-丙二醇，是目前其极具前景的绿色高效利用途径，对于生物柴油产业规模化发展中降低生产成本和减少环境污染具有重要的现实意义。然而微生物发酵粗甘油过程中面临着最主要的问题便是粗甘油中的复杂组分影响关键酶分泌表达及作用活性，导致发酵产物产量过低，生产强度不高，严重制约了粗甘油的有效利用。
目前针对粗甘油的处理主要是将其精制成纯甘油，然而精制过程中的成本较高，且由于供大于求，甘油的市场价格持续走低，导致很大一部分的粗甘油被废弃。筛选并利用微生物转化粗甘油成1,3-丙二醇不仅有利于解决粗甘油的环境污染问题，延长生物柴油的产业链，而且还可以促进1,3-丙二醇生产工业的发展。而目前对于能高效利用粗甘油发酵成1,3-丙二醇的微生物资源还很少，具有工业应用潜力的菌株更少见报道。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种能高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌，该菌能高效转化粗甘油成1,3-丙二醇产物，在工业应用方面具有很大的潜力。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述高效利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌Klebsiellasp.2e，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15520。
本发明所述菌株已于2018年3月26日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCCNo.15520，分类命名为克雷伯氏菌Klebsiella sp.，经检测存活。
本发明菌株来源于生物柴油生产废渣污染的土壤，结合菌株生理生化特征和基于16S rDNA基因序列的***进化分析，鉴定为克雷伯氏菌Klebsiella sp.，命名为2e。本发明菌株Klebsiella sp.2e对粗甘油的转化率及1,3-丙二醇的产率要优于国内外报道的其他大部分克雷伯氏菌株，本发明为利用粗甘油生产1,3-丙二醇提供了一株优良的微生物资源。
本发明菌株Klebsiella sp.2e的分离、纯化和筛选过程为：将取自湖南北大未名生物科技有效公司生物柴油生产厂区附近的土壤样品通过无菌水悬浮、静止、梯度稀释后，采用涂布法将适量稀释液接种至分离富集培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中培养。随后将长出的菌落挑出采用划线法单独接种至新的分离富集培养基平板，通过反复划线接种培养直至获得微生物的纯培养物。将分离得到的纯菌落接种至含有粗甘油发酵培养基中于摇床中170rpm，37℃培养24h后，采用气相色谱检测培养液中的1,3-丙二醇含量，产1,3-丙二醇浓度最高的即为高效利用粗甘油产1,3-丙二醇的菌株。
所述分离富集培养基的组成为：甘油25.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母提取物10.0g/L,乙酸钠5.0g/L,K2HPO42.0g/L,MgSO40.2g/L,MnSO40.02g/L,CaCl20.1g/L,pH 7.0～7.2。粗甘油发酵培养基的组成为：粗甘油(甘油含量为69％)36.0g/L,酵母提取物10.0g/L,(NH4)2SO42.0g/L,K2HPO42.0g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO40.2g/L,CaCl20.1g/L,MnSO40.02g/L,FeSO40.05g/L,pH 7.0～7.2，灭菌前充入氮气以除去培养基中的氧气。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明弥补了常规微生物利用粗甘油生产1,3-丙二醇过程中，受粗甘油杂质的抑制导致微生物生长困难、相关酶活低下及1,3-丙二醇产率不高等不足。本发明所述菌株Klebsiella sp.2e在含有36g粗甘油(甘油含量为69％)的培养基中，于37℃，170rpm条件下培养12h后，消耗的甘油量达19.44±0.61g/L，可产生9.83±0.75g/L的1,3-丙二醇，产率达到了0.62mol 1,3-丙二醇/mol甘油。
附图说明
图1：本发明菌株的菌落形态图；
图2：本发明菌株基于16S rDNA序列的***发育树图；
图3：本发明菌株在粗甘油培养基培养过程中的菌体生长图；
图4：本发明菌株在粗甘油培养基培养过程中甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶以及甘油脱氢酶活性变化图；
图5：本发明菌株在粗甘油培养基中培养12h后对甘油的消耗量及1,3-丙二醇含量图。
具体实施方式
实施例1：菌株的种属鉴定
1、菌落形态特征分析
将菌株单菌落划线接种到营养琼脂培养基(蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH 7.0～7.2)，然后将平板倒置于30℃恒温培养箱中，培养18～24h，观察长出的菌落形态。附图1显示菌株的菌落呈淡黄色润泽，较小，圆形凸起状，边缘整齐，表面光滑。为革兰氏阴性菌。
特征大体上如下：菌落特征：菌落呈微黄色，表面粗糙褶皱不透明，圆形或不规则形，边缘不整齐；用试剂盒对其进行革兰氏染色，油镜下进行菌体观察并拍照，图2显示菌株为杆状，呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。
2、菌株的生理生化实验分析
对菌株分别进行柠檬酸利用、硝酸盐利用、产硫化氢、精氨酸水解、V-P实验等生理生化实验检测，得出该菌株可以利用柠檬酸盐与硝酸盐、产硫化氢、可以水解精氨酸、产吲哚、能酵解蔗糖、乳糖及甘露糖等、不产氧化酶及甲基红实验呈阴性等，这些生理生化特征与Klebsiella菌属的基本一致，实验结果见表1。
表1 Klebsiellasp.2e生理生化实验检测结果
Figure BDA0001702365710000031
3、菌株的16S rDNA分析
采用天根生化科技有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株的基因组DNA，以此为模板，利用细菌16S rDNA通用引物通过PCR反应扩增菌株的16S rDNA序列片段，扩增得到的片段由上海生工生物工程有限公司进行测序(结果参见附表中的核苷酸序列)。将测序得到的菌株的16S rDNA序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对分析，采用MEGA 5.1软件基于临近法构建***发育树(附图2)
综合上述菌落形态特征、生理生化实验与16S rDNA序列分析实验结果，将该菌鉴定为Klebsiella属。
实施例2：菌株发酵粗甘油过程中的生长特点
将培养至对数期的菌液以5％(v/v)的接种量接种至粗甘油发酵培养基中，在37℃，170rpm下培养12h，每隔2h取样一次用于菌体生长分析。菌体生长分析采用紫外分光光度计检测样品溶液600nm处的吸光值(OD600)，结果如附图3所示。
实施例3：菌株发酵粗甘油过程中的与1,3-丙二醇合成相关的酶活性特点
将培养至对数期的菌液以5％(v/v)的接种量接种至粗甘油发酵培养基中，在37℃，170rpm下培养12h，每隔2h取样一次用于甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶以及甘油脱氢酶活性检测。用于酶活检测的样品于8000rpm离心5min后，菌体沉淀用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(0.02M,pH 7.2)洗涤两次后悬浮，悬浮菌体经超声破碎仪破碎后，于12000rpm，4℃离心10min，保存上清液用于后续酶活检测。甘油脱水酶的测定方法如下：在1.0ml的总反应体系中按终浓度混合以下试剂：0.2mol/L 1,2-丙二醇、0.05mol/L KCl、0.035mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、15μmol/L CoB12与适量稀释好的酶液。上述反应体系混匀后置于37℃孵育10min后，再加入1.0mL 0.1M柠檬酸钾缓冲液(pH 3.6)和0.5mL的0.1％MBTH，37℃孵育15min后加入1.0mL水，于305nm处检测吸光值变化。丙醛在305nm处的摩尔吸光系数是13.3×103mol/L-1cm-1。1个酶活单位定义为每分钟生产1μmol丙醛所需的酶的量。甘油脱氢酶的测定方法如下：在1.5ml的总反应体系中按终浓度混合以下试剂:0.03mol/L(NH4)2SO4、0.2mol/L甘油、0.002mol/L NAD、0.001mmol/L Fe(NH4)2(SO4)2、0.1mol/L碳酸钾缓冲液与适量稀释好的酶液。上述反应体系加入酶液后启动反应，监测记录340nm处吸光值在3min内的变化。1个酶活单位定义为每分钟还原1μmol甘油所需的酶的量。1,3-丙二醇氧化还原酶的测定方法如下：在1.5ml的总反应体系中按终浓度混合以下试剂:0.03mol/L(NH4)2SO4、0.1mol/L 1,3-丙二醇、0.002mol/L NAD、0.001mmol/L Fe(NH4)2(SO4)2、0.1mol/L碳酸钾缓冲液与适量稀释好的酶液。上述反应体系加入酶液后启动反应，监测记录340nm处吸光值在3min内的变化。1个酶活单位定义为每分钟还原1μmol 1,3-丙二醇所需的酶的量。结果如附图4所示。
实施例4：菌株发酵粗甘油后甘油的消耗量与1,3-丙二醇产量
将培养至对数期的菌液以5％(v/v)的接种量接种至粗甘油发酵培养基中，在37℃，170rpm下培养12h后，培养液于8000rpm离心5min后，弃沉淀，上清液过0.22μm滤膜后用于甘油及1,3-丙二醇的浓度检测。甘油与1,3-丙二醇的浓度采用高效液相色谱仪进行检测，检测器为示差折光检测器，配备Aminex HPX-87H柱(300nm×7.8mm)，检测程序为：样品上样量为10μL，流动相为0.005mol/L硫酸，流速设为0.5mL/min，柱温为60℃。结果如附图5所示。发酵12小时后，消耗的甘油量达19.44±0.61g/L，可产生9.83±0.75g/L的1,3-丙二醇，产率达到了0.62mol 1,3-丙二醇/mol甘油。

Claims (2)

1.一种利用粗甘油生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌，命名为Klebsiellasp. 2e，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 15520。
2.根据权利要求1所述的菌株在利用粗甘油生产1,3-丙二醇中的应用，其特征在于，所述粗甘油中甘油含量为69％。
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