CN112391365B

CN112391365B - 一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用

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Publication number: CN112391365B
Application number: CN202011393059.3A
Authority: CN
Inventors: 李兆丰; 江海旻; 顾正彪; 李才明; 班宵逢; 程力; 洪雁
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112391365A

Abstract

本发明公开了一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。采用本发明的技术方案得到催化活力提高的淀粉分支酶突变体，与野生型淀粉分支酶相比，本发明所得的淀粉分支酶突变体G160R、G160T比酶活分别为12482U/mg和10497U/mg，较淀粉分支酶野生型分别提高了88％和58％；将本发明的淀粉分支酶添加至以DE11麦芽糊精为底物的反应体系中，与添加野生型的淀粉分支酶相比，产物稳定性显著提高，在4℃放置30天后，添加本发明提供的淀粉分支酶突变体G160T和G160R后得到的产物的澄清度分别是添加野生型淀粉分支酶的10.7和12倍。

Description

一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme；EC 2.4.1.18)是属于α-淀粉酶家族的一类糖基转移酶，能够催化水解淀粉分子α-1,4-糖苷键，产生具有非还原性末端的游离短链，再通过转糖苷作用将其以α-1,6-糖苷键的形式连接至受体链上，由此形成新的α-1,6-分支点。通过这种转糖基反应，淀粉分支酶可增加淀粉及其衍生物的分支度，改善使用性能。因此，淀粉分支酶成为生物酶法改性淀粉领域的重要淀粉酶类。

麦芽糊精具有增稠性强、溶解性好等优点，但在储存过程中容易聚集、老化，一些含有麦芽糊精的产品往往因此而存在透明度稳定性差等缺陷，在储存一个月之后会有浑浊的现象发生，这在一定程度上限制了麦芽糊精的应用范围。因此，研究人员通常会采用淀粉分支酶改性麦芽糊精。在前期的研究中，发明人课题组利用Rhodothermus obamensisSTB05来源的淀粉分支酶对麦芽糊精进行酶法改性(王哲.淀粉分支酶在大肠杆菌中的分泌表达及其对麦芽糊精的改性研究[D]:[硕士学位论文].无锡:江南大学,2019.)，结果显示，以100U/g的加酶量改性麦芽糊精12h后，能显著提高麦芽糊精的透明度稳定性。但是，由于此方法加酶量大，反应时间长等问题限制了淀粉分支酶对麦芽糊精的有效改性。

因此，如何提高麦芽糊精的改性效率，以满足工业生产的需求，成为了一个亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人课题组发现，提高淀粉分支酶的催化活力，则可以减少加酶量或反应时间，从而提高麦芽糊精的改性效率。

本发明首先提供了一种淀粉分支酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第160位氨基酸突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第160位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸得到的；

或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第160位氨基酸由甘氨酸突变为苏氨酸得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶来源于Rhodothermus obamensisSTB05。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了编码上述突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET系列载体、pGEX系列载体、pKD系列载体中的任一种为出发质粒。

本发明还提供了一种携带上述基因，或上述重组质粒的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为Escherichia coli BL21(DE3)或Bacillus subtilis WB600。

本发明还提供了一种提高麦芽糊精稳定性的方法，所述方法为将上述突变体，或上述重组细胞添加至含有麦芽糊精的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为，向含有麦芽糊精的反应体系中至少添加1μg/g的上述突变体，在60-70℃条件下反应3-5h。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的添加量为8μg/g。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精为干基30％(w/w)DE11的麦芽糊精。

本发明还提供了一种水解淀粉的方法，所述方法为将上述突变体，或上述重组细胞添加至含有淀粉的反应体系中进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为，向含有淀粉的反应体系中添加5～25μg/g的上述突变体或0.1-0.5G(DCW)/mL的上述重组细胞，在60-70℃条件下反应12-24h。

本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述重组细胞在改性麦芽糊精方面的应用。

有益效果

(1)本发明提供了一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体，与野生型淀粉分支酶相比，本发明所得的淀粉分支酶突变体G160R、G160T比酶活分别为12482U/mg和10497U/mg，较淀粉分支酶野生型分别提高了88％和58％。

(2)本发明提供的淀粉分支酶能够提高麦芽糊精的稳定性，将本发明的淀粉分支酶添加至以DE11麦芽糊精为底物的反应体系中，与添加野生型的淀粉分支酶相比，产物稳定性显著提高，在4℃放置30天后，添加本发明提供的淀粉分支酶突变体G160T和G160R后得到的产物的澄清度分别是添加野生型淀粉分支酶的10.7和12倍。

附图说明

图1：淀粉分支酶粗酶蛋白电泳图。

图2：淀粉分支酶的热稳定性。

图3：淀粉分支酶野生型及突变体改性麦芽糊精4℃条件下储存30天的实时状态图。

具体实施方式

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH 7.0。

TB液体培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH₂PO₄ 2.3136g/L，K₂HPO₄ 16.4318g/L，pH 7.0。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

淀粉分支酶活力的测定方法：

用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液作为酶反应的底物，取900μL上述底物在65℃下保温10min，加入100μL 2mg/mL淀粉分支酶后混合均匀并置于65℃水浴条件下反应15min。沸水浴灭酶终止反应。待冷却至室温后取300μL反应混合液加入5mL显色液0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I₂，pH 6.0，置于室温下静置以充分显色。显色15min后在530nm处测定吸光值。

一个酶活力单位(U/mL)定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位。

淀粉分支酶蛋白浓度的测定方法：

使用上海碧云天的Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)，按照说明书测定蛋白质浓度，该试剂盒采用Bradford方法。使用牛血清白蛋白绘制标准曲线。

淀粉分支酶比酶活的测定方法：

以牛血清蛋白作为标品绘制标准曲线，通过Bradford方法测定了淀粉分支酶野生型和突变体的蛋白浓度。酶的比活是指在特定条件下，单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数，利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，因此通过酶活与蛋白浓度计算出比酶活。

麦芽糊精溶液澄清度的检测方法：

分别称取15g(以干基计)原麦芽糊精(对照)及其改性样品，溶解于50mL去离子水中，将配制好的麦芽糊***溶液恒温(4℃)储存在40mL样品瓶中，每隔一段时间测定其透明度，拍照记录其实时状态。透明度通过采用分光光度计于620nm下测定的透光率(％)表示。

实施例1：含有淀粉分支酶突变体的基因工程菌的构建

1、含有淀粉分支酶突变体的重组质粒的构建

以Rhodothermus obamensis基因组DNA为模板，采用PCR法扩增得到两端分别含Nde I和Xho I限制性酶切位点的gbe基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，将其***到pMD 18-T simple质粒中，得到重组质粒pMD 18-T simple-gbe，将重组质粒经双酶切后回收含有粘性末端的目的基因片段，并***到经相同内切酶处理过的pET-20b质粒中，得到重组载体pET-20b-gbe。以表达载体pET-20b-gbe为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STAR Primer GXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变。

PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)10μL，模板DNA 1μL，正向和反向引物(10μM)均为1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，最后加入超纯水32.5μL。

PCR扩增条件为：98℃条件下预变性3min；98℃预变性3min；随后98℃变性10s；60℃退火15s；68℃延伸5.5min，进行30个循环；最后68℃保温10min。

表1淀粉分支酶突变位点的引入

备注，下划线碱基对应于相应突变氨基酸。

2、含有淀粉分支酶的基因工程菌的构建

在37℃下，分别用DpnI处理步骤1得到的PCR产物2h，随后分别将处理好的PCR产物转化到E.coli JM 109感受态细胞中，得到转化产物，将得到的转化产物分别涂布到含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基中，在37℃恒温箱中培养12h后，挑选出单菌落接种到含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃下、200r/min培养过夜并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒鉴定测序，测序正确即为构建成功的含有突变体的重组质粒pET-20b-G160R、pET-20b-G160T、pET-20b-G160A、pET-20b-G160W；分别将上述构建成功的含有野生型淀粉分支酶的重组质粒和含有突变体的重组质粒通过化学转化法转入表达宿主E.coli BL21(DE 3)中；最终得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-gbe、E.coliBL21(DE3)/pET-20b-G160R、E.coli BL21(DE3)/pET-20b-G160T、E.coli BL21(DE3)/pET-20b-G160A、E.coli BL21(DE3)/pET-20b-G160W。

实施例2：淀粉分支酶突变体的表达

具体步骤如下：

(1)基因工程菌的活化培养：

分别将实施例1得到的基因工程菌E.coli BL21(DE 3)/pET-20b-gbe、E.coliBL21(DE 3)/pET-20b-G160R、E.coli BL21(DE 3)/pET-20b-G160T、E.coli BL21(DE 3)/pET-20b-G160A、E.coli BL21(DE 3)/pET-20b-G160W在LB固体培养基上进行划线分离，并置于37℃恒温培养箱中培养12h后，分别挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基(使用前添加终浓度为100μmg/mL的氨苄青霉素)的灭菌250mL三角瓶中，将该三角瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养8-10h，得到种子液。

(2)发酵培养：

将步骤(1)得到的种子液按照2％(v/v)的接种量分别接种于含有50mL TB液体培养基(使用前添加终浓度为100μmg/mL的氨苄青霉素)的250mL三角瓶中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在37℃下培养96h，得到发酵液。

(3)淀粉分支酶突变体的表达：

将步骤(2)得到的发酵液分别在10000×g下离心20min，取上清液，分别得到含有野生型淀粉分支酶WT的粗酶液，含有突变体G160R的粗酶液，含有突变体G160T的粗酶液，含有突变体G160A的粗酶液，含有突变体G160W的粗酶液；将上述粗酶液进行SDS-PAGE电泳分析(如图1所示)，结果野生型和突变体粗酶液显示均在73kDa处有分子条带，说明表达成功。

实施例3：淀粉分支酶突变体的分离纯化

将实施例2中得到的含有野生型淀粉分支酶WT的粗酶液，含有突变体G160R的粗酶液，含有突变体G160T的粗酶液，含有突变体G160T的粗酶液，含有突变体G160A的粗酶液，经0.45μm水系膜过滤后，用HisTrap^TM HP柱(规格为5mL)进行镍柱亲和层析纯化。用缓冲液A以2mL/min流速平衡镍柱(5个柱体积左右)，然后将样品配置成A液相同体系，流速不变，上样60mL，而后以60％(v/v)的缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液得到纯酶，即为野生型淀粉分支酶WT纯酶，突变体G160R纯酶，突变体G160T纯酶，突变体G160A纯酶，突变体G160W纯酶。

缓冲液A：20mM咪唑，10mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.0

缓冲液B：500mM咪唑，10mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.0

粗酶液：20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.0

实施例4：淀粉分支酶突变体的比酶活分析

向50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中添加马铃薯支链淀粉，配制浓度为0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液作为反应底物，将反应底物在65℃条件下预热15min；

取0.9mL的预热好的底物置于反应容器中，分别向反应容器中加入0.1mL的10μg/mL的实施例3得到的野生型淀粉分支酶WT纯酶，突变体G160R纯酶，突变体G160T纯酶，突变体G160A纯酶，突变体G160W纯酶，得到各个反应体系，将各反应体系分别在65℃下进行反应，测定淀粉分支酶突变体的活力。

测得的比酶活结果如表2所示，与野生型相比，突变体G160R、G160T的比酶活分别提高了88％和58％，而突变体G160A、G160W的比酶活与野生型相比则分别降低了1％和11％。

表2野生型和突变体GBE的比酶活

每个值为3次平行实验的平均值。

实施例5：淀粉分支酶突变体的热稳定性分析

将实施例3获得的野生型淀粉分支酶WT纯酶，突变体G160R纯酶，突变体G160T纯酶，突变体G160A纯酶，突变体G160W纯酶分别在85℃下保温2h，每隔一段时间取出酶液，立即置于冰水混合物中冷却，测定淀粉分支酶的残余酶活，以未保温酶液的活力为100％。

如图2所示，突变体G160R、G160T相较于野生型，热稳定性均有所提升，而突变体G160A、G160W的热稳定性相较于野生型则有所下降。

实施例6：淀粉分支酶突变体改性麦芽糊精

分别向含有干基浓度30％(w/w)DE11的麦芽糊精的水溶液中，添加8μg/g实施例3得到的野生型淀粉分支酶WT纯酶，突变体G160R纯酶，突变体G160T纯酶，突变体G160A纯酶，突变体G160W纯酶得到反应体系；以不添加淀粉分支酶为空白对照；

分别将上述反应体系放置在65℃条件下反应4h，沸水浴灭酶30min后，得到反应产物。

将反应产物恒温(4℃)储存在40mL样品瓶中，放置30天，每隔2天测定溶液的澄清度，并拍照记录其实时状态和澄清度，具体结果如表3和图3所示，其中图3中Control为空白对照。

表3不同淀粉分支酶改性的麦芽糊精澄清度

由表3和图3中可知，在4℃放置30天后，添加本发明提供的淀粉分支酶突变体G160T和G160R后得到的产物的澄清度分别是添加野生型淀粉分支酶的10.7和12倍；而添加淀粉分支酶突变体G160A和G160W后得到的产物的澄清度与添加野生型淀粉分支酶的澄清度差异不大，甚至更低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用

<130> BAA201077A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 621

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr

1 5 10 15

Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly

20 25 30

Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu

35 40 45

Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr

50 55 60

Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His

65 70 75 80

Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr

85 90 95

Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu

100 105 110

Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp

115 120 125

Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val

130 135 140

Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly

145 150 155 160

Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His

180 185 190

Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro

195 200 205

Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr

210 215 220

Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His

225 230 235 240

Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu

245 250 255

Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr

260 265 270

Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser

275 280 285

Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val

290 295 300

Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp

305 310 315 320

Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe

325 330 335

Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met

340 345 350

Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr

355 360 365

Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met

370 375 380

His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr

385 390 395 400

His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His

405 410 415

Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser

420 425 430

Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu

435 440 445

Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu

450 455 460

Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr

465 470 475 480

Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln

485 490 495

Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Ala Leu

500 505 510

Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg

515 520 525

Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Arg Met Leu

530 535 540

Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val

545 550 555 560

Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala

565 570 575

Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala

580 585 590

Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu

595 600 605

Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly

610 615 620

<210> 2

<211> 1890

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catatgagct ggctcacgga agaagacatc cggcgctggg aaagcggtac gttctacgac 60

agttaccgaa agctgggcgc ccatcccgac gacgaaggca cctggttctg cgtctgggcg 120

ccgcatgccg atggcgtctc ggtgctcgga gcgttcaacg actggaatcc ggaggccaac 180

ccgctggagc gctacggcgg cggcctgtgg gccggttacg taccgggagc gcgcccgggc 240

cacacctaca agtatcgcat ccggcacggc ttctatcagg ccgacaagac ggatccctac 300

gccttcgcca tggagccgcc taccggcagt cccatcgaag ggctggcctc catcatcacg 360

cggctcgact acacctggca cgacgacgaa tggatgcggc gccggaaggg tccggccagc 420

ctttacgagc cggtttccat ctacgaggta catctgggct cctggcgtca caaacggccc 480

ggcgagtcct tctcttaccg ggagattgcc gagccgctgg ccgactacgt gcaggagatg 540

ggcttcacgc acgtggagct gctgcccgtc atggaacatc cctactacgg ctcctggggc 600

tatcaggtgg tgggctacta cgccccaacg tttcgctacg gatcacccca ggacctgatg 660

tacctgatcg actacctgca ccagcgcggc atcggcgtca tcctcgactg ggtcccgagc 720

cactttgcgg ccgatcccca gggactggtt ttcttcgacg ggaccacact cttcgaatac 780

gacgatccca agatgcgcta tcaccctgac tggggtacgt atgtgttcga ttacaacaag 840

ccgggcgtac gcaactttct gatttccaac gcacttttct ggctcgaaaa gtaccacgtc 900

gacgggctgc gcgtcgatgc ggtggcttct atgctctacc gggactactc acgcaaggag 960

tggacaccca acatcttcgg cggccgtgaa aacctggagg ccattgattt catcaagaaa 1020

ttcaacgaaa cggtctacct gcacttcccc gaggccatga cgatcgccga ggagtcgacg 1080

gcctggcccg gcgtgtcggc ccccacctac aacaacggtc tgggcttcct ctacaagtgg 1140

aacatgggct ggatgcacga cacgctggac tacatccagc gcgatcccat ctaccgcaag 1200

tatcaccacg acgagctgac cttctcgctc tggtacgcct tttcggagca ctacgtcctg 1260

ccgctctcgc acgacgaggt ggtgcacggc aagggctcgc tctggggtaa aatgcccggc 1320

gacgactggc agaaggcagc caacttgcgc ctgctctttg gccacatgtg gggccatccg 1380

ggcaaaaaac tgctcttcat gggcggcgag ttcggccagc accacgagtg gaaccacgac 1440

acgcagctcg aatggcacct gctggaccag ccctaccatc gaggtattca gctgtgggtg 1500

tgcgatctga accacctcta ccgtacgaat ccggccctct ggcacgacgg accggaaggg 1560

ttcgagtgga tcgacttcag cgaccgcgac cagagcgtga tctgttacct gcgcaagaat 1620

gccggccgca tgctgctgtt cgtgctgaac tttacgcccg tgccacgcga gcactaccgc 1680

gtgggcgtgc cgatcggtgg cccctggcac gaggtgctca acagcgacgc ggtggcctac 1740

ggcgggagcg ggatgggcaa cttcggccgc gtcgaggcgg tgcccgagtc ctggcacggc 1800

cgccccttcc acttagagct gacgcttccc ccgctggccg ccctcatcct ggagccggag 1860

cacgggctcg agcaccacca ccaccaccac 1890

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggccccgtga gtccttctct taccg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaggactcac ggggccgttt gtgacg 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcccacaga gtccttctct taccg 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggactctg tgggccgttt gtgacg 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcccgcaga gtccttctct taccg 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaggactctg cgggccgttt gtgacg 26

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggccctggga gtccttctct taccg 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaggactccc agggccgttt gtgacg 26

Claims

1.一种淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第160位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸或苏氨酸得到的。

2.编码如权利要求1所述的突变体的基因。

3.携带如权利要求2所述基因的重组质粒。

4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以pET系列载体、pGEX系列载体、pKD系列载体中的任一种为出发质粒。

5.携带如权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述重组质粒的重组细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

7.一种提高麦芽糊精稳定性的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞添加至含有麦芽糊精的反应体系中进行反应。

8.一种水解淀粉的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞添加至含有淀粉的反应体系中进行反应。

9.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3或4所述的重组质粒，或权利要求5或6所述的重组细胞在改性麦芽糊精方面的应用。