CN108929883B - 芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用 - Google Patents

芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用。本发明通过***式失活的方式，将spoⅡE部分基因片段与Cmr基因融合，融合基因spoⅡE‑Cmr***克劳氏芽孢杆菌spoⅡE基因序列中，使spoⅡE基因无法正常表达而失活，spoⅡE基因失活菌株不仅可以使芽孢生成率显著降低至0.3％，并且使工程菌株生长速度比原始菌株明显加快，实现了在更短时间内细胞数量的积累和更高活力的淀粉酶的发酵生产。本发明构建了低芽孢产率的克劳氏芽孢杆菌，克服了克劳氏芽孢杆菌在工业化生产过程中无法实现高密度连续发酵的问题，可有效提高目标酶的生产强度，具有广泛的应用前景。

Description

芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用
技术领域
本发明涉及芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)是工业酶生产菌株，在生产过程中伴随芽孢的形成会对发酵产生影响，限制目标酶的产量，降低生产效率。构建芽孢缺失菌是对克劳氏芽孢杆菌等细胞工厂进行改造的一个重要方向。芽孢形成相关基因很多，如spo0A、sigmaE、sigmaK等，这些基因在芽孢形成过程中的单基因功能及基因间互作关系已有研究报道，其中，SpoⅡE是芽孢化进程中的主要调节子，是前芽孢形成过程中SigmaF因子激活所必需的蛋白磷酸酶，在染色体轴丝形成时，位于细胞中央的微管蛋白同源蛋白FtsZ在经过一次螺旋结构过渡后会重新定位于细菌两极附近，spo ⅡE的表达引发这种重新定位，在其中一个位点促发细菌不对称分布，进而推动芽孢的分化形成。进一步研究发现，芽孢基因不仅影响芽孢的形成，对于菌株的结构、生长、代谢产物生成等也有调节作用，例如一定阈值的spo0A能够促进菌体被膜的形成；spo ⅢD在苏云金芽孢杆菌中不仅为形成芽孢所必须，也与晶体蛋白表达相关；在产芽孢梭菌中，芽孢形成相关基因既能影响芽孢形成，也与丙酮，丁醇等有机物的发酵生产有关。而在克劳氏芽孢杆菌中，构建Spo ⅡE基因缺失菌株，能在控制克劳氏芽孢杆菌芽孢形成的同时，提高菌株生长速度和生物量的积累，提高淀粉酶等胞外酶的发酵活力。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用。
本发明的技术方案如下：
芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，所述基因spo ⅡE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述产酶为产淀粉酶，淀粉酶的酶活是出发菌株的5～6倍。
根据本发明优选的，所述芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，步骤如下：
(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，制得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因spo ⅡE，基因spo ⅡE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)以pHT01质粒为模板进行PCR扩增，扩增获得Cmr片段，Cmr片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将步骤(1)制得的基因spo ⅡE与步骤(2)制得的Cmr片段采用重叠PCR进行融合，获得融合基因spo ⅡE-Cmr；
(4)将步骤(3)的融合基因spo ⅡE-Cmr经酶切后，浓缩，然后转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞，经筛选得阳性重组菌，即可应用于菌体生长与产酶。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增引物核苷酸序列如下，下划线为BamHI酶切位点：
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC；
spo ⅡE-R：GCCAGCAAAAAGCGTTCCTACAAGTAAGCC；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCR Master 25μL，引物spo ⅡE-F 2.5μL，引物spo ⅡE-R 2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL，ddH2O 17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增引物核苷酸序列如下，下划线为BamHI酶切位点：
Cmr-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC；
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCR Master 25μL，引物Cmr-F 2.5μL，引物Cmr-R 2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH2O 17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，重叠PCR的扩增引物核苷酸序列如下，下划线为BamHI酶切位点：
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC；
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG；
第一轮重叠PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，胶回收产物spo ⅡE片段2μL，胶回收产物Cmr片段2μL，ddH2O 8.5μL；
第一轮重叠PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，5个循环；72℃继续延伸10min；
第二轮重叠PCR扩增体系为在第一轮PCR扩增体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，引物spo ⅡE-F 1μL，引物Cmr-R 1μL，ddH2O 10.5μL；
第二轮重叠PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min25s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，酶切体系如下，总体积40μL：
重叠PCR产物20μL，10×K Buffer 4μL，BamHⅠ内切酶2μL，ddH2O 14μL；
酶切条件为：37℃，1.5h。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，浓缩后融合基因spo ⅡE-Cmr的浓度为300～500ng/μL。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞，步骤如下：
将浓缩后的酶切产物在1500～1800V的条件下电转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞4～5ms，然后在37℃条件下于液体复苏培养基中培养3～4h，即得。
进一步优选的，所述液体复苏培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，山梨醇9％，甘露醇7％，余量水，pH＝7.0～7.4。
进一步优选的，所述克劳氏芽孢杆菌感受态细胞的制备步骤如下：
挑取新鲜的克劳氏芽孢杆菌单菌落，培养至菌体浓度OD600＝0.9～1.0，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌EP管，制得克劳氏芽孢杆菌感受态细胞。
其中，所述电转缓冲液组分如下：
质量百分比为9.1％的山梨醇，质量百分比为9.1％的甘露醇，体积百分比为10％的甘油，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，筛选步骤如下：
将转化后的克劳氏芽孢杆菌涂布含氯霉素的LB平板，37℃培养12～24h，选取阳性菌株，经鉴定，即得。
进一步优选的，所述含氯霉素的LB平板为含有氯霉素浓度为25μmol/mL的LB固体培养基。
有益效果
1、本发明首次公开了芽孢形成相关基因spo ⅡE在控制菌株生长速度方面的作用，通过***式失活的方式，将spo ⅡE部分基因片段与Cmr基因融合，融合基因spo ⅡE-Cmr***克劳氏芽孢杆菌spo ⅡE基因序列中，使spo ⅡE基因无法正常表达而失活，spo ⅡE基因失活菌株不仅可以使芽孢生成率显著降低至0.3％，并且使工程菌株生长速度比原始菌株明显加快，实现了在更短时间内细胞数量的积累；
2、本发明构建的工程菌株提高了淀粉酶的发酵酶活，有利于芽孢杆菌类酶制剂生产菌株的遗传育种及工业化生产。
附图说明
图1为本发明克劳氏芽孢杆菌spo ⅡE基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；
图中：泳道M为DNA分子量标记(DNA marker)，泳道1～3为spo ⅡE基因条带，大小为793bp；
图2为本发明Cmr基因片段的琼脂糖凝胶电泳图；
图中：泳道M为DNA分子量标记(DNA marker)，泳道1～4为Cmr基因条带，大小为1259bp；
图3为本发明克劳氏芽孢杆菌spo ⅡE基因失活转化子验证的琼脂糖凝胶电泳图；
图中：泳道M为DNA分子量标记(DNA marker)，泳道1～4为转化子条带，大小为2028bp；
图4为spo ⅡE失活菌株与出发菌株菌体浓度变化折线图；
图中：B.clausii QL-1Δspo ⅡE为spo ⅡE失活菌株，B.clausii QL-1为出发菌株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
本方法中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下的实施例中，未详细描述的和各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名称以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
生物材料来源：
实施例中的克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)购自北京北纳创联生物技术研究院，菌种编号：BNCC160124，为普通市售菌株；
质粒pHT01购自杭州宝赛生物有限公司。
LB固体培养基组分如下，均为质量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，余量水，pH＝7.0～7.4；
LB培养基组分如下，均为质量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，余量水，pH＝7.0～7.4
实施例1：目的基因片段的制备
(ⅰ)提取克劳氏芽孢杆菌基因组DNA(按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书)
根据spo ⅡE基因的核苷酸序列设计引物，在上游引物中引入BamHI酶切位点，下游引物加上Cmr片段的5'端10个碱基，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用宝生物工程有限公司的2×HiFi-PCR Master聚合酶，以克劳氏芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增spo ⅡE基因。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是BamHI酶切位点。
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC
spo ⅡE-R：GCCAGCAAAAAGCGTTCCTACAAGTAAGCC；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCR Master 25μL，引物spo ⅡE-F 2.5μL，引物spo ⅡE-R 2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL，ddH2O 17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果如图1所示，目的基因spo ⅡE的长度为793bp(SEQ ID NO.1)，将克隆得到的PCR产物spo ⅡE使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，所得DNA溶液-20℃保存备用。
(ⅱ)目的基因Cmr基因的获得
以pHT01质粒为模板，经PCR扩增得到的Cmr基因片段。
其中PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下游引物中引入BamHI酶切位点，上游引物加上spo ⅡE 3'端14个碱基，其中下划线代表的是BamHI酶切位点：
Cmr-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG；
PCR扩增体系，总体积50μL：
2×HiFi-PCR Master 25μL，引物Cmr-F 2.5μL，引物Cmr-R 2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH2O 17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果如图2所示，目的基因Cmr的长度为1259bp(SEQID NO.2)，将克隆得到的PCR产物Cmr使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，DNA溶液-20℃保存备用。
(ⅲ)将步骤(ⅰ)制得的基因spo ⅡE与步骤(ⅱ)制得的Cmr片段采用重叠PCR进行融合，制得spo ⅡE-Cmr片段；
所使用的引物核苷酸序列如下，下划线代表的是BamHI酶切位点：
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG
第一轮重叠PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，胶回收产物spo ⅡE片段2μL，胶回收产物Cmr片段2μL，ddH2O 8.5μL；
第一轮重叠PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，5个循环；72℃继续延伸10min。
第二轮重叠PCR扩增体系为在第一轮PCR扩增体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，引物spo ⅡE-F 1μL，引物Cmr-R 1μL，ddH2O 10.5μL；
第二轮重叠PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min25s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
同样，琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，检测到目的基因spo ⅡE-Cmr的长度为2028bp(SEQ ID NO.3)，将克隆得到的PCR产物spo ⅡE-Cmr使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，所得DNA溶液-20℃保存备用。
实施例2：制备克劳氏芽孢杆菌感受态
(ⅰ)挑取新鲜的克劳氏芽孢杆菌单菌落，接种于10mL LB培养基中，37℃、200r/min培养12h；
(ⅱ)取2.0mL菌液转接到50mL GM培养基，37℃、200r/min，培养4h至OD600＝1.0；
(ⅲ)菌液转移至50mL离心管，冰浴10min；
(Ⅳ)冰浴后4℃、5000r/min离心5min，收集菌体；
(Ⅴ)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤3次；
(Ⅵ)洗涤结束后，使用1000μL电转缓冲液重悬菌体；
(Ⅶ)制备好的感受态细胞分装100μL/管，-80℃保存，备用。
其中，GM培养基：LB培养基+0.5mol/L山梨醇；
电转缓冲液(ETM)：质量百分比为9.1％的山梨醇，质量百分比为9.1％的甘露醇，体积百分比为10％的甘油，余量水。
实施例3：spo ⅡE-Cmr片段电转化克劳氏芽孢杆菌
(ⅰ)将spo ⅡE-Cmr片段用限制性内切酶BamHⅠ消化；
酶切体系(40μL)如下：
10×K Buffer 4μL，BamH Ⅰ内切酶2μL，重叠PCR胶回收产物20μL，ddH2O 14μL；
酶切条件为：37℃，1.5h。
(ⅱ)浓缩酶切产物
加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20℃冰箱20min；12000r/min离心5min得沉淀；沉淀中加入300μL75％(体积百分比)的无水乙醇溶液，重悬沉淀；12000r/min，离心5min，37℃风干30min除去乙醇；加入20μL ddH2O重悬DNA，-20℃保存，备用。
(ⅲ)电转化
测定spo ⅡE-Cmr片段浓度达到470ng/μL，将感受态细胞与浓缩产物冰浴5min后1500V，5ms电转化，细胞经液体复苏培养基RM在37℃复苏培养4h，4000r/min离心5min后，100μL上清悬浮沉淀，涂布25μmol/mL氯霉素平板，37℃恒温培养20h，筛选具有氯霉素抗性的转化子；
所述液体复苏培养基RM组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，山梨醇9％，甘露醇7％，余量水，pH＝7.2。
实施例4：阳性重组菌的培养和鉴定
挑取上述阳性重组菌落，接种到含氯霉素抗性的液体LB培养基中，37℃培养12h后，菌液反复冻融3～4次，以菌液为模版，spo ⅡE-F和Cmr-R为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证结果如图3所示；
所述的PCR引物序列如下；
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG
其中，以下划线标识酶切位点。
所述的PCR扩增体系为25μL：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，菌液2μL，spo ⅡE-F 1μL，Cmr-R 1μL，ddH2O 8.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min25s，30个循环；72℃继续延伸10min。
实施例5：芽孢生成率的测定
(ⅰ)取实施例4鉴定为阳性重组菌的菌种，在含有25μmol/mL氯霉素的LB固体培养基中反复活化2次，37℃静置培养20h；挑单菌落于10mL LB液体培养基，37℃、200r/min培养12h，以2％的接种量接种于含有25μmol/mL氯霉素的100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min培养；
(ⅱ)芽孢生成率的测定方法为：
取步骤(ⅰ)中培养36h的菌液，80℃水浴处理10min，冰浴5min，稀释适当倍数，取100μL涂布LB平板，37℃恒温培养24h，平板计数并计算芽孢生成率，出发菌株及未热处理的阳性重组菌株做对照，计数结果如表1所示。
其中，芽孢生成率(％)＝(芽孢数/活菌总数)×100％。
表1出发菌株及spo ⅡE失活菌株芽孢生成率的测定
Figure BDA0001755801890000071
由以上结果可知，重组克劳氏芽孢杆菌(spo ⅡE基因失活)芽孢生成率为0.3％，出发菌株为89.5％，spo ⅡE基因失活菌株的芽孢生成率大幅度降低。
实施例6：生长周期的测定
(ⅰ)取实施例4鉴定为阳性重组菌的菌种，在含有25μmol/mL氯霉素的LB固体培养基中反复活化2次，37℃培养20h；挑单菌落于10mL LB液体培养基，37℃、200r/min培养12h，以2％的接种量接种于含有25μmol/mL氯霉素的100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min培养；
(ⅱ)每隔2～4h取样，稀释适当倍数于600nm下测定分光光度值。
分光光度值的变化如图4所示，结果显示：spo ⅡE基因失活菌株于2～18h为对数生长期，18～28h为稳定期，28h之后为衰亡期，且spo ⅡE基因失活菌株在测定期间OD600皆大于出发菌株，有效提高了单位时间内菌体积累量。
实施例7：淀粉酶的酶活测定
(ⅰ)出发菌株及实施例4鉴定的spo ⅡE基因失活菌株于含有25μmol/mL氯霉素的LB固体培养基中反复活化2次，37℃静置培养20h；挑单菌落于10mL液体LB培养基，37℃，200r/min培养12h，以3％的接种量接种于含有25μmol/mL氯霉素的100mL发酵培养基中，37℃，200r/min培养；72h后，取发酵培养液，经细胞破碎、淀粉酶纯化，得待测酶液；
(ⅱ)淀粉酶酶活测定的具体方法为：吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5.0mL，摇匀后，置于60℃恒温水浴中预热8min；加入1.0mL稀释好的步骤(i)制备的待测酶液，立即计时，摇匀，反应5min；立即用自动移液器吸取1.0mL反应液，加到预先盛有0.5mL 0.1mol/L盐酸溶液的试管中终止反应，再加入5.0mL稀碘液，未加反应液的稀碘液为空白，于660nm波长下测定吸光度，根据数据表查得吸光度所对应的酶液浓度。
(ⅲ)酶活力计算公式：X＝c×n
式中：X－样品的酶活力[IU/g(IU/mL)]
c－样品酶液的浓度(IU/mL)
n－样品的稀释倍数
酶活定义：1mL液体酶，于60℃，pH＝6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需酶量，即为1个酶活力单位(U/mL)。
通过干重的测定，将淀粉酶酶活单位U/mL换算为U/g。
所述的发酵培养基配制方法如下：
A.称取2g(精确至0.001g)可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入40mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却，加入1g蛋白胨和2g酵母粉，搅拌至溶解后定容至50mL，121℃，20min灭菌，备用。
B.称取2.66g Na2HPO4和0.66g NaH2PO4，加水溶解后定容至50mL，121℃，20min灭菌，备用。
将A液及B液冷却后混合，作为发酵培养基。
所述的可溶性淀粉溶液配制方法如下：
称取2.000g(精确至0.001g)可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。
所述的磷酸缓冲液配制方法如下：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解定容至1000mL，调节pH＝6.0。
经计算，spo ⅡE失活菌株发酵72h后淀粉酶酶活为4.8×105U·g-1，出发菌株发酵72h后淀粉酶酶活为0.86×105U·g-1，spo ⅡE失活菌株的淀粉酶酶活是出发菌株的5.58倍，spo ⅡE失活菌株较出发菌株淀粉酶发酵活力得到有效提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 793
<212> DNA
<213> Bacillus clausii
<400> 1
ccttaaaagc ggagccaaaa cggtgcttta tgattggggc atattcattg ccattcttgg 60
ttttctgcta ggaagggcta tgattttatc agagttgacg ccatttatct tgccattctt 120
ggcggccgtg ttcttgttaa gacgctctca atcactcatt gctgcagctt cattattagc 180
aggtgctgtg ttcagtttcc atggtcagtt gatttttgcg attgcaggga tcgggttttt 240
tcttattctg tacaaatgta tgaaaatgtt catgaagtac cctgctaaat cgctccctta 300
tcttgtgttt tcagctagta tcgccacgag gctgtcactc gtatttttga cagaaggtgg 360
attaagccaa tatgcgatga tgatggctac agtcgaagcg gcgcttagct ttatcctgac 420
aatgatcttt atccaaagca taccgcttgt gacaggaaaa agaggcggac aagcactccg 480
gaatgaagaa attatttgtt taattatttt gcttgcctct gtaatgacag gaacagtcgg 540
ttggacgata aatgaagctg tgcttcagca tagctttgca agttatctcg ttttagtgtt 600
tgcttttgtt ggcggggctg caataggctc gactgtcgga gtggtgacag gcttgatttt 660
aagcttggcc agtttagcaa gtctttatca gatgagtctg cttgcctttg caggcttgtt 720
aggagggttg ttaaaggaag ggaaacggat cggcgtgtca cttggcttac ttgtaggaac 780
gctttttgct ggc 793
<210> 2
<211> 1259
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttgtaggaa cgctttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 60
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 120
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcatgctta 180
agttattggt atgactggtt ttaagcgcaa aaaaagttgc tttttcgtac ctattaatgt 240
atcgttttag aaaaccgact gtaaaaagta cagtcggcat tatctcatat tataaaagcc 300
agtcattagg cctatctgac aattcctgaa tagagttcat aaacaatcct gcatgataac 360
catcacaaac agaatgatgt acctgtaaag atagcggtaa atatattgaa ttacctttat 420
taatgaattt tcctgctgta ataatgggta gaaggtaatt actattatta ttgatattta 480
agttaaaccc agtaaatgaa gtccatggaa taatagaaag agaaaaagca ttttcaggta 540
taggtgtttt gggaaacaat ttccccgaac cattatattt ctctacatca gaaaggtata 600
aatcataaaa ctctttgaag tcattcttta caggagtcca aataccagag aatgttttag 660
atacaccatc aaaaattgta taaagtggct ctaacttatc ccaataacct aactctccgt 720
cgctattgta accagttcta aaagctgtat ttgagtttat cacccttgtc actaagaaaa 780
taaatgcagg gtaaaattta tatccttctt gttttatgtt tcggtataaa acactaatat 840
caatttctgt ggttatacta aaagtcgttt gttggttcaa ataatgatta aatatctctt 900
ttctcttcca attgtctaaa tcaattttat taaagttcat ttgatatgcc tcctaaattt 960
ttatctaaag tgaatttagg aggcttactt gtctgctttc ttcattagaa tcaatccttt 1020
tttaaaagtc aatattactg taacataaat atatatttta aaaatatccc actttatcca 1080
attttcgttt gttgaactaa tgggtgcttt agttgaagaa taaaagacca cattaaaaaa 1140
tgtggtcttt tgtgtttttt taaaggattt gagcgtagcg aaaaatcctt ttctttctta 1200
tcttgataat aagggtaact attgccgatc gtccattccg acagcatcgc cagtcacta 1259
<210> 3
<211> 2028
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccttaaaagc ggagccaaaa cggtgcttta tgattggggc atattcattg ccattcttgg 60
ttttctgcta ggaagggcta tgattttatc agagttgacg ccatttatct tgccattctt 120
ggcggccgtg ttcttgttaa gacgctctca atcactcatt gctgcagctt cattattagc 180
aggtgctgtg ttcagtttcc atggtcagtt gatttttgcg attgcaggga tcgggttttt 240
tcttattctg tacaaatgta tgaaaatgtt catgaagtac cctgctaaat cgctccctta 300
tcttgtgttt tcagctagta tcgccacgag gctgtcactc gtatttttga cagaaggtgg 360
attaagccaa tatgcgatga tgatggctac agtcgaagcg gcgcttagct ttatcctgac 420
aatgatcttt atccaaagca taccgcttgt gacaggaaaa agaggcggac aagcactccg 480
gaatgaagaa attatttgtt taattatttt gcttgcctct gtaatgacag gaacagtcgg 540
ttggacgata aatgaagctg tgcttcagca tagctttgca agttatctcg ttttagtgtt 600
tgcttttgtt ggcggggctg caataggctc gactgtcgga gtggtgacag gcttgatttt 660
aagcttggcc agtttagcaa gtctttatca gatgagtctg cttgcctttg caggcttgtt 720
aggagggttg ttaaaggaag ggaaacggat cggcgtgtca cttggcttac ttgtaggaac 780
gctttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 840
aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 900
agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcatgcttaa gttattggta 960
tgactggttt taagcgcaaa aaaagttgct ttttcgtacc tattaatgta tcgttttaga 1020
aaaccgactg taaaaagtac agtcggcatt atctcatatt ataaaagcca gtcattaggc 1080
ctatctgaca attcctgaat agagttcata aacaatcctg catgataacc atcacaaaca 1140
gaatgatgta cctgtaaaga tagcggtaaa tatattgaat tacctttatt aatgaatttt 1200
cctgctgtaa taatgggtag aaggtaatta ctattattat tgatatttaa gttaaaccca 1260
gtaaatgaag tccatggaat aatagaaaga gaaaaagcat tttcaggtat aggtgttttg 1320
ggaaacaatt tccccgaacc attatatttc tctacatcag aaaggtataa atcataaaac 1380
tctttgaagt cattctttac aggagtccaa ataccagaga atgttttaga tacaccatca 1440
aaaattgtat aaagtggctc taacttatcc caataaccta actctccgtc gctattgtaa 1500
ccagttctaa aagctgtatt tgagtttatc acccttgtca ctaagaaaat aaatgcaggg 1560
taaaatttat atccttcttg ttttatgttt cggtataaaa cactaatatc aatttctgtg 1620
gttatactaa aagtcgtttg ttggttcaaa taatgattaa atatctcttt tctcttccaa 1680
ttgtctaaat caattttatt aaagttcatt tgatatgcct cctaaatttt tatctaaagt 1740
gaatttagga ggcttacttg tctgctttct tcattagaat caatcctttt ttaaaagtca 1800
atattactgt aacataaata tatattttaa aaatatccca ctttatccaa ttttcgtttg 1860
ttgaactaat gggtgcttta gttgaagaat aaaagaccac attaaaaaat gtggtctttt 1920
gtgttttttt aaaggatttg agcgtagcga aaaatccttt tctttcttat cttgataata 1980
agggtaacta ttgccgatcg tccattccga cagcatcgcc agtcacta 2028

Claims (8)

1.芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，制得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因spo ⅡE，基因spo ⅡE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)以pHT01质粒为模板进行PCR扩增，扩增获得Cmr片段，Cmr片段的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
(3)将步骤(1)制得的基因spo ⅡE与步骤(2)制得的Cmr片段采用重叠PCR进行融合，获得融合基因spo ⅡE-Cmr；
(4)将步骤(3)的融合基因spo ⅡE-Cmr经酶切后，浓缩，然后转化克劳氏芽孢杆菌，经筛选得阳性菌株，即可应用于菌体生长与产酶；所述浓缩后的融合基因spo ⅡE-Cmr的浓度为300～500ng/μL；
所述产酶为产淀粉酶，淀粉酶的酶活是出发菌株的5～6倍。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC；
spo ⅡE-R：GCCAGCAAAAAGCGTTCCTACAAGTAAGCC；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCR Master 25μL，引物spo ⅡE-F 2.5μL，引物spo ⅡE-R 2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL，ddH2O 17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
Cmr-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC；
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG；
PCR扩增体系如下，总体积50μL：
2×HiFi-PCR Master 25μL，引物Cmr-F 2.5μL，引物Cmr-R 2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH2O 17.5μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述重叠PCR的扩增引物核苷酸序列如下：
spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC；
Cmr-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG；
第一轮重叠PCR扩增体系如下，总体积25μL：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，胶回收产物spo ⅡE片段2μL，胶回收产物Cmr片段2μL，ddH2O 8.5μL；
第一轮重叠PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，5个循环；72℃继续延伸10min；
第二轮重叠PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
2×HiFi-PCR Master 12.5μL，引物spo ⅡE-F 1μL，引物Cmr-R 1μL，ddH2O 10.5μL；
第二轮重叠PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min25s，共30个循环；72℃继续延伸10min。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述酶切的反应体系如下，总体积40μL：
重叠PCR产物20μL，10×K Buffer 4μL，BamH Ⅰ内切酶2μL，ddH2O 14μL；
酶切条件为：37℃，1.5h。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述转化克劳氏芽孢杆菌，步骤如下：
将浓缩后的酶切产物在1500～1800V的条件下电转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞4～5ms，然后在37℃条件下于液体复苏培养基中培养3～4h，即得；
其中液体复苏培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，山梨醇9％，甘露醇7％，余量水，pH＝7.0～7.4。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述克劳氏芽孢杆菌感受态细胞的制备步骤如下：
挑取新鲜的克劳氏芽孢杆菌单菌落，培养至菌体浓度OD600＝0.9～1.0，置于冰上冷却，冷却后离心，然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌EP管，制得克劳氏芽孢杆菌感受态细胞；
其中电转缓冲液组分如下：
质量百分比为9.1％的山梨醇，质量百分比为9.1％的甘露醇，体积百分比为10％的甘油，余量水。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述筛选的步骤如下：
将转化后的克劳氏芽孢杆菌涂布含氯霉素的LB平板，37℃培养12～24h，选取阳性菌株，经鉴定，即得；
其中含氯霉素的LB平板为含有氯霉素浓度为25μmol/mL的LB固体培养基。
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