CN116622704A - 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用 - Google Patents

可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明一般涉及用于基因表达的空间和时间控制的方法和组合物，其可以使用可诱导的转录效应物。本发明特别涉及改变或干扰细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其中所述基因组基因座可以与非天然存在或经改造的组合物接触，所述组合物包含脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽。

Description

可诱导的DNA结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
相关申请且通过引用并入
本申请是申请号为201380049665.5、申请日为2013年7月21日、发明名称为“可诱导的DNA结合蛋白和基因组干扰工具及其应用”的中国发明专利申请的分案申请。本申请要求名称为INDUCIBLE DNA BINDING PROTEINS AND GENOME PERTURBATION TOOLS ANDAPPLICATIONS THEREOF，于2012年7月25日提交的美国临时专利申请系列号61/675,778，于2012年11月1日提交的美国临时专利申请系列号61/721,283，于2012年12月12日提交的美国临时专利申请系列号61/736,465，于2013年3月15日提交的美国临时专利申请系列号61/794,458和于2013年6月17日提交的美国临时专利申请系列号61/835,973的优先权和权益。
还参考名称为NUCLEOTIDE-SPECIFIC RECOGNITION SEQUENCES FOR DESIGNERTAL EFFECTORS，于2011年11月30日提交的美国临时申请号61/565,171，以及2012年7月30日提交的美国申请号13/554,922和于2012年9月6日提交的美国申请号13/604,945。
还参考名称为SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION，于2012年12月12日提交的美国临时申请号61/736,527；于2013年1月2日提交的美国临时申请号61/748,427；于2013年1月29日提交的美国临时申请号61/757,972，于2013年2月25日提交的美国临时申请号61/768,959和于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/791,409。
还参考名称为ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS，METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION，于2013年1月30日提交的美国临时申请号61/758,468和于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/769,046。
还参考于2013年6月17日提交的美国临时申请号61/835,931；61/835,936；61/836,080；61/836,101；61/836,123和61/836,127。
还参考名称为CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OFGENE PRODUCTS，于2013年7月2日提交的美国临时申请号61/842,322，和名称为DELIVERY，ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS，METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION AND APPLICATIONS，于2013年7月17日提交的美国临时申请号61/847,537。
前述申请和在其中或在其审查期间引用的所有文件(“申请引用的文件”)以及在申请引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或参考的所有文件(“本文引用文件”)以及在本文引用文件中引用或参考的所有文件，连同关于本文或在通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品传单，均在此通过引用并入本文并且可以用于本发明的实践中。更具体而言，所有参考的文件均通过引用并入，其程度与每个个别文件具体且个别指出通过引用并入相同。
发明领域
本发明一般涉及用于基因表达的空间和时间控制例如基因组干扰的方法和组合物，其可以使用可诱导的转录效应物。
联邦基金会
本发明在由美国国立卫生研究院授予的R01NS073124和先锋奖1DP1MH100706下由政府支持进行。
发明背景
正常基因表达是具有精心安排的时间和空间组分的动态过程，其精确度是生物的正常发育、稳态和进展所必需的。依次地，通过增加、减少或改变一种基因或一组基因的功能的所需基因表达模式失调已与广泛多样的病理状态联系。能够以空间与时间精确方式调控基因表达的技术允许阐明负责正常生物过程和疾病机制的遗传线索。为了解决该技术需要，申请人开发了可以调节基因表达的可诱导的分子工具，特别是光诱导的转录效应物(LITE)，其提供了光介导的内源基因表达控制。
诱导基因表达***通常已设计为允许化学诱导的***的开放读码框或shRNA序列的激活，分别导致基因过表达或阻遏。使用开放读码框用于过表达的缺点包括基因大小的剪接变化和限制的丧失。尽管其在人类生物学中的变革力量，经由RNA干扰的基因阻遏可以被复杂的脱靶效应阻碍。某些诱导***包括基于***、蜕皮激素和FKBP12/FRAP的***已知激活脱靶内源基因。长期抗生素治疗的潜在有害作用可以使基于四环素反式激活物(TET)的***的使用复杂化。在体内，这些化学诱导***的时间精确度取决于诱导剂摄取和消除的动力学。进一步地，因为诱导剂一般是全身递送的，所以此类***的空间精确度受外源载体递送的精确度约束。
美国专利公开号20030049799涉及经改造的刺激应答开关，以引起响应预先选择的刺激的可检测输出。
存在允许有效和精确空间和时间控制目的基因组基因座的方法和组合物的明显需要。这些方法和组合物可以提供在体内和在体外两者的基因组表达的调节和调控，以及提供用于许多疾病病理状态的新型治疗方法。
在本申请中任何文件的引用或鉴定并非承认此类文件可用作本发明的现有技术。
发明概述
在一个方面，本发明提供了非天然存在或经改造的TALE或CRISPR-Cas***，其可以包含至少一种开关，其中所述TALE或CRISPR-Cas***的活性通过与关于开关的至少一种诱导物能源接触而加以控制。在本发明的一个实施方案中，关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性可以得到激活、增强、终止或阻遏。与至少一种诱导物能源的接触可以导致第一效应和第二效应。第一效应可以是入核转运、出核转运、次级组分(例如效应物分子)的召募、(蛋白质、DNA或RNA的)构象变化、切割、货物(例如笼装分子或辅因子)释放、结合或解离中的一种或多种。第二效应可以是关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性的激活、增强、终止或阻遏中的一种或多种。在一个实施方案中，第一效应和第二效应可以级联发生。
在本发明的另一个方面，TALE或CRISPR-Cas***可以进一步包含至少一种核定位信号(NLS)、出核转运信号(NES)、功能结构域、弹性接头、突变、缺失、改变或截短。NLS、NES或功能结构域中的一种或多种可以根据条件激活或失活。在另一个实施方案中，突变可以是转录因子同源区中的突变、DNA结合结构域中的突变(例如使碱性螺旋环螺旋的碱性残基突变)、内源NLS中的突变或内源NES中的突变的一种或多种。本发明包含诱导物能源可以是热、超声、电磁能或化学品。在本发明的优选实施方案中，诱导物能源可以是抗生素、小分子、激素、激素衍生物、类固醇或类固醇衍生物。在更优选的实施方案中，诱导物能源可以是脱落酸(ABA)、多西环素(DOX)、cumate、雷帕霉素、4-羟基他莫昔芬(4OHT)、***或蜕皮激素。本发明提供了至少一种开关可以选自基于抗生素的诱导***、基于电磁能的诱导***、基于小分子的诱导***、基于核受体的诱导***和基于激素的诱导***。在更优选的实施方案中，至少一种开关可以选自四环素(Tet)/DOX诱导***、光诱导***、ABA诱导***、cumate阻遏物/操纵子***、4OHT/***诱导***、基于蜕皮激素的诱导***和FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导***。
在本发明的一个方面，诱导物能源是电磁能。电磁能可以是波长在450nm-700nm范围内的可见光的组分。在优选实施方案中，可见光的组分可以具有在450nm-500nm范围内的波长并且可以是蓝光。蓝光可以具有至少0.2mW/cm2、或更优选至少4mW/cm2的强度。在另一个实施方案中，可见光的组分可以具有在620-700nm范围内的波长并且可以是红光。
本发明包含其中至少一种功能结构域可以选自下述的***：转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA羟甲基化酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录调节蛋白(或转录复合物召募)结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域、抗体呈现结构域、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰酶的召募者；组蛋白修饰酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、组蛋白激酶、组蛋白磷酸酶、组蛋白核糖基酶、组蛋白脱核糖基酶、组蛋白泛素酶、组蛋白去泛素酶、组蛋白生物素酶和组蛋白尾部蛋白酶的抑制剂。
本发明还提供了该***用于干扰目的基因组或表观基因组基因座的用途。还提供了该***用于制备药物化合物的用途。
在进一步方面，本发明提供了控制非天然存在或经改造的TALE或CRISPR-Cas***的方法，其包括提供包含至少一种开关的所述TALE或CRISPR-Cas***，其中所述TALE或CRISPR-Cas***的活性通过与关于开关的至少一种诱导物能源接触而加以控制。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了其中关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性可以得到激活、增强、终止或阻遏的方法。与至少一种诱导物能源的接触可以导致第一效应和第二效应。第一效应可以是入核转运、出核转运、次级组分(例如效应物分子)的召募、(蛋白质、DNA或RNA的)构象变化、切割、货物(例如笼装分子或辅因子)释放、结合或解离中的一种或多种。第二效应可以是关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性的激活、增强、终止或阻遏中的一种或多种。在一个实施方案中，第一效应和第二效应可以级联发生。
在本发明的方法的另一个方面，TALE或CRISPR-Cas***可以进一步包含至少一种核定位信号(NLS)、出核转运信号(NES)、功能结构域、弹性接头、突变、缺失、改变或截短。NLS、NES或功能结构域中的一种或多种可以根据条件激活或失活。在另一个实施方案中，突变可以是转录因子同源区中的突变、DNA结合结构域中的突变(例如使碱性螺旋环螺旋的碱性残基突变)、内源NLS中的突变或内源NES中的突变中的一种或多种。本发明包含诱导物能源可以是热、超声、电磁能或化学品。在本发明的优选实施方案中，诱导物能源可以是抗生素、小分子、激素、激素衍生物、类固醇或类固醇衍生物。在更优选的实施方案中，诱导物能源可以是脱落酸(ABA)、多西环素(DOX)cumate、雷帕霉素、4-羟基他莫昔芬(4OHT)、***或蜕皮激素。本发明提供了至少一种开关可以选自基于抗生素的诱导***、基于电磁能的诱导***、基于小分子的诱导***、基于核受体的诱导***和基于激素的诱导***。在更优选的实施方案中，至少一种开关可以选自四环素(Tet)/DOX诱导***、光诱导***、ABA诱导***、cumate阻遏物/操纵子***、4OHT/***诱导***、基于蜕皮激素的诱导***和FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导***。
在本发明的方法的一个方面，诱导物能源是电磁能。电磁能可以是波长在450nm-700nm范围内的可见光的组分。在优选实施方案中，可见光的组分可以具有在450nm-500nm范围内的波长并且可以是蓝光。蓝光可以具有至少0.2mW/cm2、或更优选至少4mW/cm2的强度。在另一个实施方案中，可见光的组分可以具有在620-700nm范围内的波长并且可以是红光。
本发明包含其中至少一种功能结构域可以选自下述的方法：转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA羟甲基化酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录调节蛋白(或转录复合物召募)结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域、抗体呈现结构域、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰酶的召募者；组蛋白修饰酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、组蛋白激酶、组蛋白磷酸酶、组蛋白核糖基酶、组蛋白脱核糖基酶、组蛋白泛素酶、组蛋白去泛素酶、组蛋白生物素酶和组蛋白尾部蛋白酶的抑制剂。
本发明的进一步方面提供了如本文描述的***或方法，其中TALE***包含DNA结合多肽，所述DNA结合多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过诱导物能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过诱导物能源诱导后与相互作用配偶体结合。
本发明的***和方法提供了包含下述的DNA结合多肽：(a)N末端封盖区，(b)包含特别排序以靶向目的基因座的至少5-40个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体的DNA结合结构域，和(c)C末端封盖区，其中(a)、(b)和(c)可以以预定N末端至N末端取向排列，其中基因组基因座包含靶DNA序列5′-T0N1N2…NzNz+1-3′，其中T0和N＝A、G、T或C，其中靶DNA序列与DNA结合结构域结合，并且DNA结合结构域可以包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，其中z可以是至少5-40，其中多肽可以由密码子优化的核酸分子编码和翻译，从而使得多肽优先与目的基因座的DNA结合。
在进一步的实施方案中，本发明的***或方法提供了包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸的N末端封盖区或其片段，或包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸C末端封盖区或其片段，或者包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸的N末端封盖区或其片段，和包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸的C末端封盖区或其片段。在另一个实施方案中，至少一个RVD可以选自(a)用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN；(b)用于识别腺嘌呤(A)的NI、KI、RI、HI、SI；(c)用于识别胸腺嘧啶(T)的NG、HG、KG、RG；(d)用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD、HD、ND、KD、YG；(e)用于识别A或G的NV、HN；以及(f)用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
在另外一个实施方案中，至少一个RVD可以选自(a)用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS；(b)用于识别腺嘌呤(A)的SI；(c)用于识别胸腺嘧啶(T)的HG、KG、RG；(d)用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD；(e)用于识别A或G的NV、HN以及(f)用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。在优选实施方案中，用于识别G的RVD是RN、NH、RH或KH；或用于识别A的RVD是SI；或用于识别T的RVD是KG或RG；并且用于识别C的RVD是SD或RD。在另外一个实施方案中，下述中的至少一个存在于X1-4处：[LTLD]或[LTLA]或[LTQV]，或者[EQHG]或[RDHG]存在于位置X30-33或X31-34或X32-35处。
在本发明的一个方面，TALE***包装成AAV或慢病毒载体。
本发明的进一步方面提供了如本文描述的***或方法，其中CRISPR***可以包含载体***，其包含：a)与靶向目的基因座的CRISPR-Cas***引导RNA可操作地连接的第一调节元件，b)与Cas蛋白质可操作地连接的第二调节诱导元件，其中组分(a)和(b)可以位于***的相同或不同载体上，其中引导RNA靶向目的基因座的DNA，其中Cas蛋白质和引导RNA并非天然一起出现。在本发明的优选实施方案中，Cas蛋白质是Cas9酶。本发明还提供了其为AAV或慢病毒的载体。
本发明特别涉及改变目的基因组基因座的表达的诱导方法和诱导改变目的基因组基因座的表达的组合物，其中所述基因组基因座可以与非天然存在或经改造的组合物接触，所述组合物包含脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽。
该多肽可以包括与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，所述DNA结合结构域包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者至少一种或多种效应物结构域。能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体。多肽还可以包括与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个变体TALE单体或半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段可以在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合。该方法还可以包括施加能源且测定基因组基因座的表达是改变的。在本发明的优选实施方案中，基因组基因座可以在细胞中。
本发明还涉及阻遏目的基因组基因座的表达的诱导方法和诱导阻遏目的基因组基因座的表达的组合物，其中所述基因组基因座可以与非天然存在或经改造的组合物接触，所述组合物包含DNA结合多肽。
多肽可以包括与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，所述DNA结合结构域包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者至少一个或多个阻遏物结构域。能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体。多肽还可以包括与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个变体TALE单体或半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段可以在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合。该方法还可以包括施加能源且测定基因组基因座的表达是阻遏的。在本发明的优选实施方案中，基因组基因座可以在细胞中。
本发明还涉及激活目的基因组基因座的表达的诱导方法和诱导激活目的基因组基因座的表达的组合物，其中所述基因组基因座可以与非天然存在或经改造的组合物接触，所述组合物包含DNA结合多肽。
多肽可以包括与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，所述DNA结合结构域包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个TALE单体和至少一个或多个半单体，或者至少一个或多个激活物结构域。能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后可经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体。多肽还可以包括DNA结合结构域，其包含与相互作用配偶体连接，特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个变体TALE单体或半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段可以在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合。该方法还可以包括施加能源且测定基因组基因座的表达是激活的。在本发明的优选实施方案中，基因组基因座可以在细胞中。
在本发明的另一个优选实施方案中，诱导效应物可以是光诱导的转录效应物(LITE)。LITE***的模块性允许任何数目的效应物结构域用于转录调控。
在本发明的另外一个优选实施方案中，诱导效应物可以是化学品。
本发明还考虑使用CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)/Cas***的可诱导多路基因组改造。
本发明还包含编码本发明的多肽的核酸。核酸可以包含启动子，有利地人突触蛋白I启动子(hSyn)。在特别有利的实施方案中，核酸可以包装成腺相关病毒载体(AAV)。
本发明进一步还涉及包含本文描述的方法和组合物的处理或治疗方法。
相应地，本发明的目的是在本发明内不包含任何先前已知的产品、制备产品的过程或使用产品的方法，从而使得申请人保留权利且在此公开任何先前已知的产品、过程或方法的放弃。进一步指出本发明不预期在本发明的范围内包含不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的条款83)的书面描述和启用要求的任何产品、过程或产品的制备或使用产品的方法，从而使得申请人保留权利且在此公开任何先前描述的产品、制备产品的过程或使用产品的方法的放弃。
应当指出在本公开内容且特别是权利要求和/或段落中，术语例如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等可以具有在美国专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且术语例如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于其的含义；例如，它们允许未明确叙述的元件，但排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新型特征的元件。
这些及其他实施方案由下述详述得到公开或由于下述详述是显而易见的且由下述详述涵盖。
附图简述
通过实例给出但不预期使本发明仅仅限制于所述具体实施方案的下述详述与附图结合可以得到最佳理解。
图1显示指示关于空间和时间精确度的需要的示意图。
图2显示转录激活物样效应物(TALE)。TALE由在其序列核心处的34aa重复组成。每个重复对应于由TALE结合的靶DNA中的碱基。重复仅相差在位置12和13处的2个可变氨基酸。该对应的编码已得到阐明(Boch，J等人，Science，2009和Moscou，M等人，Science，2009)，并且显示于该图中。申请人已开发了用于合成设计者TALE的方法，所述TALE掺入该编码且能够结合在基因组内的选择序列(Zhang，F等人，Nature Biotechnology，2011)。
图3显示LITE的设计：TALE/隐花色素转录激活。每种LITE是两组分***，其可以包含融合至CRY2的TALE和融合至VP64(转录激活物)的隐花色素结合配偶体CIB1。在失活状态，TALE使其融合的CRY2结构域定位至目的基因的启动子区。在这点上，CIB1不能结合CRY2，在核空间中留下未结合的CIB1-VP64。在用488nm(蓝)光刺激后，CRY2经历构象变化，露出其CIB1结合位点(Liu，H等人，Science，2008)。CIB1的快速结合导致融合的VP64结构域的召募，其诱导靶基因的转录。
图4显示隐花色素二聚体截短对LITE活性的作用。已知改变CRY2和CIB1活性的截短(Kennedy M等人，Nature Methods 2010)针对全长蛋白质进行比较。对于每种结构域组合，靶向Neurog2的启动子的LITE在Neuro-2a细胞中进行测试。在用488nm光刺激后，对于刺激或未受刺激的样品，使用qPCR定量Neurog2的转录水平。
图5显示KLF4 LITE的光强度依赖性应答。
图6显示Neurog2 LITE的激活动力学和Neurog2 LITE失活动力学。
图7A显示如使用申请人的RVD筛选***测定的，多种RVD的碱基偏好。
图7B显示如使用申请人的RVD筛选***测定的，另外RVD的碱基偏好。
图8A-D在(a)中显示衍生自黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp)的TALE的天然结构。每个DNA结合模块由34个氨基酸组成，其中根据密码NG＝T、HD＝C、NI＝A和NN＝G或A，在每个重复的第12和13个氨基酸位置中的RVD指明被靶向的碱基。DNA结合模块侧面为非重复的N和C末端，其携带易位、核定位(NLS)和转录激活(AD)结构域。在N末端内的隐藏信号将胸腺嘧啶指定为靶位点的第一个碱基。(b)TALE工具箱允许定制TALE-TF和TALEN的快速和廉价构建。试剂盒由总共12个质粒组成：四个单体质粒用作PCR扩增的模板，四个TALE-TF和四个TALE克隆主链对应于由0.5重复靶向的四个不同碱基。CMV，巨细胞病毒启动子；N末端，来自Hax3 TALE的非重复N末端；C末端，来自Hax3 TALE的非重复C末端；BsaI，用于***定制的TALE DNA结合结构域的II型限制位点；ccdB+CmR，含有ccdB负选择基因和氯霉素抗性基因的负选择盒；NLS，核定位信号；VP64，衍生自单纯疱疹病毒的VP16蛋白质的合成转录激活物；2A，2A自切割接头；EGFP，增强型绿色荧光蛋白；聚A信号，多聚腺苷酸化信号；FokI，来自FokI核酸内切酶的催化结构域。(c)TALE可以用于生成定制TALE-TF且调控来自基因组的内源基因的转录。TALE DNA结合结构域融合至合成VP64转录激活物，其召募RNA聚合酶和起始转录所需的其他因子。(d)TALEN可以用于生成位点特异性双链断裂，以促进通过非同源修复或同源性指导的修复的基因组编辑。两个TALEN靶向侧接16-bp间隔物的一对结合位点。左和右TALEN分别识别靶位点的顶部和底部链。每个TALE DNA结合结构域融合至FokI核酸内切酶的催化结构域；当FokI二聚化时，它切割在左和右TALEN结合位点之间的区域中的DNA。
图9A-F显示列出单体序列(排除在位置12和13处的RVD)和具有特定序列的单体出现的频率的表。
图10显示非RVD氨基酸对TALE活性的作用的比较。
图11显示比较VP64、p65和VP16之间的激活水平的激活物筛选。
图12A-D显示TALE转录阻遏物体系结构的开发。(a)用于TALE阻遏物筛选的SOX2TALE的设计。合成靶向人基因组内的SOX2基因座内的14bp序列的TALE。(b)筛选的所有阻遏物及其宿主起源的列表(左)。八个不同的候选阻遏物结构域融合至SOX2TALE的C末端。通过用模拟转染的细胞中的SOX2 mRNA水平除用每种候选TALE阻遏物转染的细胞中的SOX2mRNA水平，使用qRTPCR测量内源SOX2 mRNA的增加倍数。(d)内源CACNA1C的转录阻遏。构建使用NN、NK和NH作为G靶向RVD的TALE，以靶向人CACNA1C基因座内的18bp靶位点。每种TALE融合至SID阻遏结构域。NLS，核定位信号；KRAB，Krüppel结合框；SID，mSin相互作用结构域。所有结果均由在HEK 293FT细胞中的三次独立实验收集。误差条指示s.e.m.；n＝3.*p<0.05，斯氏t检验。
图13A-C显示使用SID和SID4X的TALE转录阻遏物体系结构的优化。(a)用于测试TALE阻遏物体系结构的p11 TALE的设计。合成靶向小鼠(小家鼠(Mus musculus))基因组的p11(s100a10)基因座内的20bp序列(p11 TALE结合位点)的TALE。(b)内源小鼠p11 mRNA的转录阻遏。如x轴上所示，靶向具有野生型TALE体系结构的两种不同截短的小鼠p11基因座的TALE融合至不同阻遏物结构域。圆括号中的值指示在侧接DNA结合重复的TALE DNA结合结构域的N和C末端处的氨基酸数目，随后为在构建体中使用的阻遏物结构域。内源p11mRNA水平使用qRT-PCR进行测量，并且针对用GFP编码构建体转染的阴性对照细胞中的水平标准化。(c)内源小鼠p11的转录阻遏倍数。通过用阴性对照GFP构建体转染的细胞中的p11mRNA水平除用每种候选TALE阻遏物转染的细胞中的p11mRNA水平，使用qRT-PCR测量内源p11 mRNA的减少倍数。沿x轴的构建体标记与先前小图相同。NLS，核定位信号；SID，mSin相互作用结构域；SID4X，通过短肽接头连接的SID结构域的优化四次串联重复。所有结果均由在Neuro2A细胞中的三次独立实验收集。误差条指示s.e.m.；n＝3.*p<0.001，斯氏t检验。
图14显示两种不同类型的TALE体系结构的比较。
图15A-C显示化学诱导的TALE ABA诱导***。ABI(ABA不敏感的1)和PYL(PYL蛋白质：pyrabactin抗性(PYR)/PYR1样(PYL))是来自下文列出的两种蛋白质的结构域，所述结构域在结合植物激素脱落酸(ABA)后将二聚化。该植物激素是申请人在申请人的可诱导的TALE***中使用的小分子化学品。在该***中，TALE DNA结合多肽融合至ABI结构域，而VP64激活结构域或SID阻遏物结构域或任何效应物结构域与PYL结构域连接。因此，在通过ABA分子的存在诱导后，两个相互作用结构域ABI和PYL将二聚化且允许TALE与效应物结构域连接，以执行其在调节靶基因表达中的活性。
图16A-B显示化学诱导的TALE 4OHT诱导***。
图17描述隐花色素2异源二聚体取向对LITE功能性的作用。
图18描述在小鼠皮层神经元培养物中的mGlur2 LITE活性。
图19描述用LITE AAV载体转导原代小鼠神经元。
图20描述LITE组分在体内的表达。
图21描述改良的构建体设计，其中使用的具体NES肽序列是LDLASLIL。
图22描述在4OH他莫昔芬的不存在和存在下的Sox2 mRNA水平。
图23A-E描述来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SF370的II型CRISPR基因座可以在哺乳动物细胞中重构，以促进靶向DNA的DSB。(A)用NLS改造SpCas9和SpRNaseIII允许输入哺乳动物核内。(B)SpCas9和SpRNase III的哺乳动物表达由EF1a启动子驱动，而tracrRNA和crRNA前体阵列(DR-Spacer-DR)由U6启动子驱动。具有PAM的来自人EMX1基因座的原型间隔物(protospacer)(蓝色突出显示)用作crRNA前体阵列中的间隔物模板。(C)在靶基因座和EMX1靶向crRNA之间的碱基配对的图示。红色箭头指示假定的切割位点。(D)用于SpCas9介导的***缺失的SURVEYOR测定。(E)示例色谱图显示微小缺失，以及由187个克隆扩增子鉴定的突变等位基因的代表性序列。红色虚线，缺失的碱基；红色碱基，***或突变。比例尺＝10μm。
图24A-C描述SpCas9可以重编程以靶向哺乳动物细胞中的多重基因组基因座。(A)人EMX1基因座的示意图显示由蓝线指示的五种原型间隔物的位置，而相应PAM由品红指示。(B)crRNA前体:tracrRNA复合物的示意图(上)显示在crRNA前体和tracrRNA的直接重复(灰色)区之间的杂交。嵌合RNA设计的示意图(M.Jinek等人，A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337，816(2012年8月17日))(下)。tracrRNA序列以红色显示，并且20bp间隔物序列以蓝色显示。(C)SURVEYOR测定比较在人EMX1基因座中的五种原型间隔物处Cas9介导的切割的功效。每种原型间隔物使用经加工的crRNA前体:tracrRNA复合物(crRNA)或嵌合RNA(chiRNA)靶向。
图25A-D描述SpCas9特异性的评估和使用TALEN的效率比较。(A)生成具有单个点突变的EMX1靶向嵌合crRNA，以评估间隔物-原型间隔物错配的效应。(B)SURVEYOR测定比较不同突变型嵌合RNA的切割效率。(C)示意图显示靶向EMX1的TALEN的设计。(D)SURVEYOR凝胶比较TALEN和SpCas9的效率(N＝3)。
图26A-G描述Cas9用于同源重组和多路基因组改造的应用。(A)RuvC I结构域的突变将Cas9转化成切口酶(SpCas9n)。(B)EMX1靶向嵌合RNA与SpCas9的过表达导致***缺失，而SpCas9n则不是(N＝3)。(C)重组策略的图示。设计修复模板以将限制位点***EMX1基因座内。用于扩增经修饰的区域的引物显示为红色箭头。(D)限制性片段长度多态性凝胶分析。箭头指示由HindIII消化生成的片段。(E)示例色谱图显示成功重组。(F)SpCas9可以使用crRNA阵列促进多路基因组修饰，所述crRNA阵列含有靶向EMX1和PVALB的两种间隔物。示意图显示crRNA阵列的设计(上)。两种间隔物均介导有效的原型间隔物切割(下)。(G)SpCas9可以用于实现精确的基因组缺失。靶向EMX1的两种间隔物(上)介导118bp基因组缺失(下)。
图27描述II型CRISPR介导的DNA双链断裂的示意图。来自酿脓链球菌SF370的II型CRISPR基因座含有四种基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的簇，以及两种非编码RNA元件，tracrRNA和由非重复序列(间隔物，各30bp)的短段隔开的重复(直接重复)的特征性阵列(15-18，30，31)。每种间隔物通常衍生自外源遗传材料(原型间隔物)，并且指导CRISPR介导的核酸切割的特异性。在靶核酸中，每种原型间隔物与原型间隔物邻近基序(PAM)结合，所述PAM的识别对于个别CRISPR***是特异性的(22，23)。II型CRISPR***在序贯步骤中进行靶向的DNA双链断裂(DSB)(M.Jinek等人，Science337，816(Aug 17，2012)；Gasiunas，R.等人Proc Natl Acad Sci U S A 109，E2579(Sep25，2012)；J.E.Garneau等人，Nature 468，67(Nov 4，2010)；R.Sapranauskas等人，Nucleic Acids Res 39，9275(Nov，2011)；A.H.Magadan等人PLoS One 7，e40913(2012))。首先，crRNA前体阵列和tracrRNA由CRISPR基因座转录。其次，tracrRNA与crRNA前体的直接重复杂交，并且与Cas9结合为双链体，其介导crRNA前体加工成含有个别、截短的间隔物序列的成熟crRNA。第三，经由crRNA的间隔物区和原型间隔物DNA之间的异源双链体形成，成熟的crRNA:tracrRNA双链体将Cas9导向由原型间隔物和必要PAM组成的DNA靶。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，以制备在原型间隔物内的DSB。
图28A-C描述用于Cas9介导的基因靶向的不同tracrRNA转录物的比较。(A)示意图显示测试的两种tracrRNA转录物(短和长)的设计和序列。每种转录物由U6启动子驱动。转录起始位点标记为+1，并且转录终止子如所示。蓝线指示其反向互补序列用于生成用于tracrRNA检测的RNA印迹探针的区域。(B)SURVEYOR测定比较hSpCas9介导的EMX1基因座切割的效率。对于每种tracrRNA转录物显示了两种生物重复。(C)由用U6表达构建体转染的293FT细胞提取的总RNA的RNA印迹分析，所述U6表达构建体携带长或短tracrRNA、以及SpCas9和DR-EMX1(1)-DR。左和右图分别来自不用或用SpRNase III转染的293FT细胞。U6指示用靶向人U6 snRNA的探针印迹的装载对照。短tracrRNA表达构建体的转染导致丰富水平的经加工形式的tracrRNA(～75bp)(E.Deltcheva等人，Nature471，602(2011年3月31日))。在RNA印迹上检测到极低量的长tracrRNA。作为这些实验的结果，申请人选择使用短tracrRNA用于应用于哺乳动物细胞中。
图29描述用于检测双链断裂诱导的微小***和缺失的SURVEYOR测定(D.Y.Guschin等人Methods Mol Biol 649，247(2010))。SURVEYOR测定的示意图用于测定Cas9介导的切割效率。首先，基因组PCR(gPCR)用于扩增来自经修饰的和未经修饰的细胞的异质群体的Cas9靶区域，并且gPCR产物缓慢再退火以生成异源双链体。再退火的异源双链体由SURVEYOR核酸酶切割，而同源双链体保持完整。Cas9介导的切割效率(％***缺失)基于切割DNA的级分进行计算。
图30A-B描述在哺乳动物细胞中加工的crRNA的RNA印迹分析。(A)示意图显示关于侧面为两个直接重复的单个间隔物的表达载体(DR-EMX1(1)-DR)。靶向人EMX1基因座原型间隔物1的30bp间隔物(表1)以蓝色显示，并且直接重复以灰色显示。橙线指示其反向互补序列用于生成用于EMX1(1)crRNA检测的RNA印迹探针的区域。(B)由用携带DR-EMX1(1)-DR的U6表达构建体转染的293FT细胞提取的总RNA的RNA印迹分析。左和右图分别来自不用或用SpRNase III转染的293FT细胞。DR-EMX1(1)-DR仅在SpCas9和短tracrRNA的存在下加工为成熟crRNA，并且不依赖于SpRNase III的存在。由经转染的293FT总RNA检测到的成熟crRNA是～33bp，并且比来自酿脓链球菌的39-42bp成熟crRNA更短(E.Deltcheva等人，Nature 471，602(2011年3月31日)，提示在人293FT细胞中经加工的成熟crRNA可能不同于酿脓链球菌中细菌成熟的crRNA。
图31A-B描述关于crRNA前体阵列或具有Cas9的嵌合crRNA的双顺反子表达载体。(A)示意图显示用于crRNA前体阵列的表达载体的设计。间隔物可以使用退火的寡核苷酸***两个BbsI位点之间。关于寡核苷酸的序列设计显示于下方，其中指示适当的连接衔接子。(B)嵌合crRNA的表达载体的示意图。引导序列可以使用退火的寡核苷酸***两个BbsI位点之间。载体已含有部分直接重复(灰色)和部分tracrRNA(红色)序列。WPRE，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
图32A-B描述人PVALB和小鼠Th基因座中的原型间隔物的选择。人PVALB(A)和小鼠Th(B)基因座以及分别在PVALB和Th基因的最后一个外显子内的三种原型间隔物的位置的示意图。30bp原型间隔物由黑线指示，并且邻近PAM序列由品红条指示。在有义链和反义链上的原型间隔物分别在DNA序列上方和下方指示。
图33A-C描述在人基因组中的PAM序列的存在。在人基因组中邻近酿脓链球菌SF370基因座1PAM(NGG)(A)和酿脓链球菌LMD9基因座1PAM(NNAGAAW)(B)之间的距离的直方图。(C)通过染色体关于每个PAM的距离。Chr，染色体。假定靶使用人染色体序列的正链和负链两者进行鉴定。考虑到可能存在染色质、DNA甲基化、RNA结构和可能限制在一些原型间隔物靶处的切割活性的其他因素，重要的是指出实际靶向能力可能小于该计算分析的结果。
图34A-D描述来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)LMD-9的II型CRISPR也可以在真核细胞中起作用。(A)来自嗜热链球菌LMD-9的CRISPR基因座2的示意图。(B)用于嗜热链球菌CRISPR***的表达***的设计。使用组成型EF1a启动子表达人密码子优化的hStCas9。使用U6启动子表达成熟形式的tracrRNA和crRNA，以确保精确的转录起始。显示了关于成熟crRNA和tracrRNA的序列。在crRNA序列中由小写字母“a”指示的单个碱基用于去除聚U序列，其充当RNA Pol III转录终止子。(C)示意图显示在人EMX1基因座中的原型间隔物和相应PAM序列靶。两种原型间隔物序列突出显示，并且其相应的满足NNAGAAW基序的PAM序列由品红线指示。两种原型间隔物均靶向反义链。(D)SURVEYOR测定显示在靶基因座中StCas9介导的切割。RNA引导间隔物1和2分别诱导14％和6.4％。跨越在这两个原型间隔物位点处的生物复制的切割活性的统计分析可以在表1中发现。
图35描述AAV-启动子-TALE-效应物构建体的例子，其中hSyn＝人突触蛋白1启动子，N+136＝TALE N末端，AA+136截短，C63＝TALE C末端，AA+63截短，vp＝VP64效应物结构域，GFP＝绿色荧光蛋白，WPRE＝土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，bGH＝牛生长激素聚A，ITR＝AAV反向末端重复和AmpR＝氨苄青霉素抗性基因。
图36A-C描述LITE***的设计和优化。(a)TALE DNA结合结构域融合至CRY2，并且转录效应物结构域融合至CIB1。在失活状态，TALE-CRY2结合靶基因的启动子区，而CIB1效应物在核中保持未结合。VP64转录激活物显示于上方。在用蓝光照射后，TALE-CRY2和CIB1-效应物快速二聚化，将CIB1-效应物召募至靶启动子。效应物依次又调控靶基因的转录。(b)用含有其光敏结合配偶体的功能截短的LITE的内源靶Neurog2 mRNA的光依赖性下调。LITE转染的Neuro-2a细胞用466nm光以5mW/cm2的强度和7％的工作循环(以0.066Hz的1s脉冲)刺激24小时。(c)通过TALE-CRY2PHR和CIB1-VP64 LITE的光依赖性Neurog2上调的时间过程。LITE转染的Neuro-2a细胞用466nm光以5mW/cm2的强度和7％的工作循环(以0.066Hz的1s脉冲)刺激，并且Neurog2 mRNA水平在6小时光刺激后减少。所有Neurog2 mRNA水平均相对于表达GFP的对照细胞进行测量(平均值±s.e.m.；n＝3-4)(*，p<0.05；和***，p<0.001)。
图37A-F描述在体外和体内AAV介导的TALE递送靶向神经元中的内源基因座。(a)组成性TALE转录激活物包装成AAV的一般示意图。效应物结构域VP64突出显示。hSyn：人突触蛋白启动子；2A：***衍生的2A肽；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后应答元件；bGH pA：牛生长激素聚A信号。(b)代表性图像显示用来自原代皮层神经元中的(a)的AAV-TALE-VP64构建体转导。细胞就GFP和神经元标记NeuN进行染色。比例尺＝25μm.(c)靶向多种内源基因座的AAV-TALE-VP64构建体就原代皮层神经元中的转录激活进行筛选(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。(d)TALE-VP64通过AAV有效递送到小鼠的ILC内。比例尺＝100μm。(Cg1＝扣带皮层，PLC＝前边缘皮层，ILC＝下边缘皮层)。(e)ILC中的神经元的有效转导的更高倍放大图像。(f)使用300μm组织穿孔器测量的，在ILC中在体内通过TALE-VP64的Grm2 mRNA上调(平均值±s.e.m.；n＝3只动物/条件)。
图38A-I描述LITE介导的原代神经元和体内的内源转录的光遗传学调控。(a)具有转换的CRY2PHR和CIB1体系结构的AAV-LITE激活物构建体。(b)代表性图像显示原代神经元中AAV递送的LITE构建体的共转导。细胞就GFP、HA-标签和DAPI进行染色。(比例尺＝25μm)。(c)在用0.8％工作循环脉冲的466nm光(以0.033Hz的250ms脉冲或以0.016Hz的500ms脉冲；5mW/cm2)刺激24小时后，在原代神经元中的Grm2表达的光诱导激活。(d)在4小时和24小时时间点用和不用光刺激，在原代皮层神经元中的Grm2mRNA上调。表达水平相对于仅用GFP转导的神经元显示。(e)在仅GFP对照转导、具有LITE未受刺激的神经元和具有LITE光刺激的神经元中的mGluR2蛋白质水平的定量。显示了代表性蛋白质印迹，其中β-微管蛋白-III作为装载对照。(f)示意图显示用LITE***转导ILC，光导纤维植入物和用于组织分离的0.35mm直径脑穿孔器。(g)用两种LITE组分共转导的ILC的代表性图像。显示了关于HA-标签(红色)、GFP(绿色)和DAPI(蓝色)的染色。(比例尺＝25μm)。(h)使用转导到ILC内的LITE的内源Grm2表达的光诱导激活。**，p<0.05；对于每种实验条件，由4只不同小鼠生成的数据。(i)使用LITE1.0和优化的LITE 2.0的Neurog2表达的增加倍数和光诱导。LITE2.0提供最低限度本底，同时维持高水平激活。NLSα-输入蛋白和NLSSV40，分别来自α-输入蛋白和猿猴病毒40的核定位信号；GS，Gly-Ser接头；NLS*，突变的NLS，其中所示残基已置换为Ala，以阻止核定位活性；Δ318-334；高等植物螺旋-环-螺旋转录因子同源区的缺失。
图39A-H描述TALE-和LITE-介导的外遗传修饰。(a)LITE外遗传修饰物(epiLITE)的示意图。(b)在AAV载体内经改造的外遗传转录阻遏物SID4X的示意图。phiLOV2.1(330bp)而不是GFP(800bp)用作荧光标记，以确保有效的AAV包装。(c)在用和不用光刺激的原代皮层神经元中epiLITE介导的内源Grm2表达的阻遏。下调倍数相对于用单独的GFP转导的神经元显示。(d)在用和不用光刺激的在Grm2启动子处的epiLITE介导的H3K9组蛋白残基乙酰化减少。(e，f)通过epiTALE甲基转移酶(epiTALE-KYP、-TgSET8和-NUE)的Grm2 mRNA降低倍数，以及在Grm2启动子处组蛋白甲基化标记H3K9me1、H4K20me3和H3K27me3的相应富集。(g，h)通过epiTALE组蛋白脱乙酰基酶(epiTALE-HDAC8、-RPD3、-Sir2a和-Sin3a)的Grm2 mRNA降低倍数，以及在Grm2启动子处的组蛋白残基乙酰化标记H4K8Ac和H3K9Ac中的相应减少。所有小图中所示的值均为平均值±s.e.m.，n＝3-4。
图40描述在体外CRY2的吸收光谱的图解。隐花色素2通过350-475nm光优化激活1。对于大于480nm的波长可见吸收和激活中的急剧下降。光谱改编自Banerjee，R.等人TheSignaling State of Arabidopsis Cryptochrome 2Contains FlavinSemiquinone.Journal of Biological Chemistry 282，14916-14922，doi:10.1074/jbc.M700616200(2007)。
图41描述照明工作循环对LITE介导的基因表达的影响。不同工作循环(作为总时间的百分比的照明)用于刺激表达靶向KLF4基因的LITE的293FT细胞，以便研究工作循环对LITE活性的作用。KLF4表达水平与仅表达GFP的细胞相比较。刺激参数是：466nm，5mW/cm2共24小时。脉冲以0.067Hz与下述持续时间执行：1.7％＝0.25s脉冲，7％＝1s脉冲，27％＝4s脉冲，100％＝恒定照明。(平均值±s.e.m.；n＝3-4)。
图42A-B描述光强度对LITE介导的基因表达和细胞存活的影响。(a)发现CRY2PHR::CIB1 LITE的转录活性根据466nm蓝光的强度而改变。Neuro 2a细胞以7％工作循环(以0.066Hz的1s脉冲)刺激24小时。(b)光诱导的毒性测量为相对于钙黄绿素阳性细胞，对于红色荧光乙啶同源二聚体-1阳性的细胞百分比。所有Neurog2 mRNA水平均相对于仅表达GFP的细胞进行测量(平均值±s.e.m.；n＝3-4)。
图43描述转录激活结构域对LITE介导的基因表达的影响。通过使用不同转录激活结构域(VP16、VP64和p65)的LITE，连同和不连同光的Neurog2上调。用LITE转染的Neuro-2a细胞用466nm光以5mW/cm2的强度和7％的工作循环(以0.066Hz的1s脉冲)刺激24小时。(平均值±s.e.m.；n＝3-4)。
图44A-C描述内源基因转录的化学诱导。(a)示意图显示基于脱落酸(ABA)受体***的化学诱导双杂交TALE***的设计。ABI和PYL在添加ABA后二聚化，并且当ABA撤出后解离。(b)ABA依赖性Neurog2上调的时间过程。将250μM ABA加入表达TALE(Neurog2)-ABI和PYL-VP64的HEK 293FT细胞中。在ABA添加后的所示时间点测量mRNA增加倍数。(c)在ABA刺激24小时后的Neurog2 mRNA水平减少。所有Neurog2 mRNA水平均相对于表达GFP的对照细胞进行测量(平均值±s.e.m.；n＝3-4)。
图45A-C描述AAV上清液产生。(a)携带GFP的慢病毒和AAV载体用于测试转导效率。(b)用衍生自相同数目的AAV或慢病毒转染的293FT细胞的300和250μL上清液转导原代胚胎皮层神经元。以7d.p.i收集GFP表达的代表性图像。比例尺＝50μm。(c)所述过程开发用于产生AAV上清液和原代神经元的后续转导。293FT细胞用携带目的基因的AAV载体，AAV1血清型包装载体(pAAV1)和使用PEI的辅助质粒(pDF6)进行转染。48小时后，收获上清液且通过0.45μm PVDF膜过滤。随后用上清液转导原代神经元，并且将剩余等分试样贮存于-80℃下。在5-6天后达到AAV构建体表达的稳定水平。遵循该过程的AAV上清液产生可以用于产生以96孔形式的高达96种不同病毒构建体(用于图37C中所示的神经元中的TALE筛选)。
图46描述通过DNA酶I敏感染色质区引导的TALE靶位点的选择。基于来自ENCODE(http://genome.ucsc.edu)的小鼠皮层组织数据的高DNA酶I灵敏度用于鉴定开放染色质区。选择在转录起始位点上游2kb区域内具有最高振幅的峰用于靶向。随后在峰中心处的200bp区域内挑选TALE结合靶。
图47描述光工作循环对原代神经元健康的影响。光刺激对原代皮层神经元健康的作用对于7％、0.8％的工作循环和无光条件进行比较。钙黄绿素用于评估神经元活力。捕获明视野图像以显示形态和细胞完整性。原代皮层神经元用所示工作循环使用5mW/cm2的466nm光刺激24小时。代表性图像，比例尺＝50μm。以下述方式执行脉冲：7％工作循环＝以0.067Hz的1s脉冲，0.8％工作循环＝以0.0167Hz的0.5s脉冲。
图48描述在光遗传学刺激期间的小鼠图像。描绘了具有立体定位植入的插管和光导纤维，清醒、表现自如、注射LITE的小鼠。
图49描述通过在小鼠下边缘皮层中的AAV1/2的LITE组分的共转导效率。通过单独的TALE(Grm2)-CIB1、单独的CRY2PHR-VP64转导或共转导的细胞计算为所有转导细胞的百分比。
图50描述个别LITE组分对基线转录调控的贡献。Grm2 mRNA水平在用个别LITE组分转染的原代神经元中进行测定。表达单独的Grm2 TALE_1-CIB1的原代神经元导致与表达完整LITE***的未受刺激的细胞在Grm2 mRNA水平中的相似增加。(平均值±s.e.m.；n＝3-4)。
图51描述LITE组分改造对激活、本底信号和诱导倍数的作用。蛋白质修饰用于发现导致本底转录激活降低同时改善通过光的诱导比的LITE组分。蛋白质变化在下文详细讨论。简言之，核定位信号和内源出核转运信号中的突变用于改善CRY2PHR-VP64组分的入核转运。追求预期降低核定位或CIB1转录激活的几种CIB1变化，以便降低TALE-CIB1组分对本底活性的贡献。测试的CRY2PHR-VP64和TALE-CIB1的所有组合的结果显示于上方。条形图左侧的表指示用于每种条件的特定结构域/突变组合。表的每行和条形图含有对于特定CRY2PHR/CIB1组合的组分细节、光/无光活性和通过光的诱导比。与LITE 1.0相比较导致本底减少和诱导倍数增加两者的组合在标记为“+”的表格列中以绿色突出显示(t检验p<0.05)。CRY2PHR-VP64构建体：设计三种新构建体，目标是改善CRY2PHR-VP64入核转运。首先，诱导在CRY2PHR的预测的内源出核转运序列内的突变L70A和L74A，以限制蛋白质的出核转运(在效应物列中被称为‘*’)。其次，α-输入蛋白核定位序列融合至CRY2PHR-VP64的N末端(在效应物列中被称为‘A’)。第三，SV40核定位序列融合至CRY2PHR-VP64的C末端(在效应物列中被称为‘P’)。TALE-CIB1接头：在LITE 1.0中使用的TALE和CIB1之间的SV40 NLS接头替换为设计为增加TALE-CIB1蛋白质的出核转运的几种接头之一(在CIB1接头列中使用的符号在圆括号中显示)：弹性甘氨酸-丝氨酸接头(G)、腺病毒5型E1B出核转运序列(W)、HIV出核转运序列(M)、MAPKK出核转运序列(K)和PTK2出核转运序列(P)。NLS*内源CIB1核定位序列突变：核定位信号存在于野生型CIB1序列内。该信号在NLS*构建体中的K92A、R93A、K105A和K106A处突变，以便减小TALE-CIB1核定位(在NLS*列中被称为‘N’)。ΔCIB1转录因子同源性缺失：为了消除可能的基础CIB1转录激活，设计了缺失构建体，其中去除与高等植物中的碱性螺旋-环-螺旋转录因子的高同源性的区域。这些缺失的区域由Δaa230-256、Δaa276-307、Δaa308-334(在ΔCIB1列中被称为‘1’、‘2’和‘3’)组成。在每种情况下，缺失的区域替换为3残基GGS连接。进入CIB1内的NES***序列：促进TALE-CIB1的光依赖性入核转运的一种策略是在其与CRY2PHR的二聚化界面处在CIB1中***NES，从而使得信号在与CRY2PHR结合后隐藏。为此，将NES***已知CRY2相互作用结构域CRY2内的不同位置处(aa1-170)。位置如下(在NES列中使用的符号显示于圆括号中)：aa28(1)、aa52(2)、aa73(3)、aa120(4)、aa140(5)、aa160(6)。*bHLH碱性螺旋-环-螺旋突变：为了降低直接CIB1-DNA相互作用，使CIB1中的碱性螺旋-环-螺旋区域的几个碱性残基突变。下述突变呈现于所有*bHLH构建体中(在图51的*bHLH列中被称为‘B’)：R175A、G176A、R187A和R189A。
图52描述TALE-CIB1的光介导的共依赖性入核转运的图解。(a)在不存在光的情况下，由于核定位信号NLS(或弱出核转运信号NES的添加)的不存在，TALE-CIB1 LITE组分位于细胞质中。另一方面含有NLS的CRY2PHR-VP64组分独自主动输入核内。(b)在蓝光的存在下，TALE-CIB1与CRY2PHR结合。CRY2PHR-VP64中存在的强NLS目前介导两种LITE组分的复合物的入核转运，允许它们激活在靶向基因座处的转录。
图53描述显著的LITE 1.9组合。除LITE 2.0构建体之外，来自经改造的LITE组分筛选的几种CRY2PHR-VP64::TALE-CIB1组合特别值得注意。组合α-输入蛋白NLS效应物构建体与突变的内源NLS和Δ276-307TALE-CIB1构建体的LITE 1.9.0，显示出大于9的诱导比和超过180的绝对光激活。组合未经修饰的CRY2PHR-VP64与突变的NLS、Δ318-334、AD5 NESTALE-CIB1构建体的LITE 1.9.1，实现本底激活1.06的诱导比4。本底激活低于2和诱导比范围为7-12的其他LITE 1.9组合的选择也是突出显示的。
图54A-D描述在神经元中的TALE SID4X阻遏物表征和应用。a)通过串联4个SID结构域(SID4X)构建合成阻遏物。为了鉴定优化的TALE阻遏物体系结构，SID或SID4X融合至设计为靶向小鼠p11基因的TALE。(b)使用qRT-PCR测定p11 mRNA中的增加倍数。(c)包装成AAV的组成性TALE转录阻遏物的一般示意图。效应物结构域SID4X是突出显示的。hSyn：人突触蛋白启动子；2A：***衍生的2A肽；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后应答元件；bGH pA：牛生长激素聚A信号。选择phiLOV2.1(330bp)作为较短的荧光标记，以确保有效的AAV包装。(d)靶向内源小鼠基因座Grm5和Grm2的2个TALE融合至SID4X，且病毒转导到原代神经元内。相对于仅表达GFP的神经元中的水平，对于每种TALE显示了经由SID4X的靶基因下调。(平均值±s.e.m.；n＝3-4)。
图55A-B描述不同的epiTALE集合介导神经元和Neuro2a细胞中的转录阻遏。a)融合至不同组蛋白效应物结构域的总共24种Grm2靶向TALE使用AAV转导到原代皮层小鼠神经元内。相对于仅用GFP转导的神经元，使用RT-qPCR测量Grm2 mRNA水平。*指示p<0.05的阻遏。b)总共32种epiTALE转染到Neuro2A细胞内。其中20种介导靶向Neurog2基因座的显著阻遏(*＝p<0.05)。
图56A-D描述在Neuro 2A细胞中epiTALE介导的转录阻遏连同组蛋白修饰。(a)靶向Neuro 2A细胞中的鼠Neurog2基因座的融合至组蛋白脱乙酰基外遗传效应物NcoR和SIRT3的TALE就对Neurog2转录水平的阻遏活性进行测定。(b)ChIP RT-qPCR显示对于NcoR和SIRT3 epiTALE，在Neurog2启动子处的H3K9乙酰化中的降低。(c)具有已知组蛋白甲基转移酶结合活性的外遗传效应物PHF19融合至靶向Neurog2介导Neurog2 mRNA水平阻遏的TALE。(d)ChIP RT-qPCR显示对于PHF19 epiTALE，在Neurog2启动子处的H3K27me3水平中的增加。
图57A-G描述RNA引导的DNA结合蛋白Cas9可以用于将转录效应物结构域靶向至特异性基因组基因座。(a)通过引入两个丙氨酸置换(D10A和H840A)，来自II型酿脓链球菌CRISPR/Cas***的RNA引导的核酸酶Cas9可以转换成核溶解-失活RNA-引导的DNA结合蛋白(Cas9**)。示意图显示合成引导RNA(sgRNA)可以指导与人基因组中的特异性基因座的Cas9**-效应物融合。sgRNA含有在5'末端处的20bp引导序列，其指定靶序列。在靶基因组DNA上，20bp靶位点需要随后为5’-NGG PAM基序。(b，c)示意图分别显示在人KLF4和SOX2基因座中的sgRNA靶位点。每个靶位点由蓝色条指示，并且相应PAM序列由品红条指示。(d，e)Cas9**-VP64转录激活物和SID4X-Cas9**转录阻遏物构建体的示意图。(f，g)Cas9**-VP64和SID4X-Cas9**分别介导KLF4激活和SOX2阻遏。所有mRNA水平均相对于GFP模拟转染的对照细胞进行测量(平均值±s.e.m.；n＝3)。
图58描述设计的6种TALE，其中两种TALE靶向内源小鼠基因座Grm5、Grin2a和Grm2中的每一个。TALE融合至转录激活物结构域VP64或阻遏物结构域SID4X，并且病毒转导到原代神经元内。相对于仅表达GFP的神经元中的水平，对于每种TALE显示经由VP64的靶基因上调和经由SID4X的下调两者。
图59A-B描述(A)突出显示SID4X阻遏物结构域的LITE阻遏物构建体。(B)使用Grm2T1-LITE和Grm2 T2-LITE，在原代皮层神经元中的内源Grm2表达的光诱导阻遏。下调倍数相对于仅用GFP转导的神经元显示(平均值±s.e.m.；对于所有子图，n＝3-4)。
图60A-B描述交换CRY2PHR和CIB1组分。(A)TALE-CIB1::CRY2PHR-VP64能够激活比TALE-CRY2PHR::CIB1-VP64更高水平的Ngn2。(B)Ngn2 LITE的激活倍数比(光相对于无光)显示对于两种设计相似的效率。刺激参数与图36B中所示的那些相同。
图61描述对于可诱导的Cas9的Tet Cas9载体设计。
图62描述在Cas9和EGFP的强力霉素诱导后，在293FT细胞中的载体和EGFP表达。
发明详述
术语“核酸”或“核酸序列”指以单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。该术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语还包含具有合成主链的核酸样结构，参见例如Eckstein，1991；Baserga等人，1992；Milligan，1993；WO97/03211；WO 96/39154；Mata，1997；Strauss-Soukup，1997；和Samstag，1996。
如本文使用的，“重组”指在体外合成或以其他方式操纵的多核苷酸(例如“重组多核苷酸”)，使用重组多核苷酸在细胞或其他生物***中产生基因产物的方法，或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组方法”包含具有来自不同来源的多个编码区或结构域或启动子序列的核酸连接成表达盒或载体，用于表达例如诱导型或组成性表达在本发明的载体中的多肽编码序列。
当就核酸而言使用时，术语“异源的”指示细胞或病毒中的核酸，通常在自然界中所述细胞或病毒中未发现该核酸；或者包含两种或更多种子序列，其未以与自然界中通常发现的相同的彼此关系发现，或重组改造，从而使得它的表达水平、或在细胞或结构中与其他核酸或其他分子的物理关系在自然界中通常未发现。在该上下文中使用的相似术语是“外源的”。例如，异源核酸通常重组产生，具有以自然界中未发现的方式排列的来自无关基因的两种或更多种序列；例如，与***本发明的基于腺病毒的载体内的启动子序列可操作地连接的人基因。例如，目的异源核酸可以编码免疫原性基因产物，其中腺病毒治疗或预防地作为载体或药物疫苗组合物施用。异源序列可以包含启动子和序列的不同组合，其例子在本文中详细描述。
“治疗配体”可以是具有疗效的可以与靶细胞的受体结合的物质。
“疗效”可以是任何种类的医学治疗的后果，所述医学治疗的结果通过本领域技术人员判断为希望和有利的。“疗效”可以是作为对医学治疗的应答而发生的行为或生理变化。结果可以是医学治疗的预期、出乎意料或甚至意外的后果。“疗效”可以包括例如在患有通过病原体感染的对象中的症状降低。
“靶细胞”可以是其中它活性中的变化可以诱导所需结果或应答的细胞。如本文使用的，细胞可以是体外细胞。细胞可以是分离的细胞，其可能无法发育成完全生物体。
“配体”可以是与生物分子结合且与生物分子形成复合物以发挥生物目的的任何物质。如本文使用的，“配体”还可以指“抗原”或“免疫原”。如本文使用的，“抗原”和“免疫原”可互换使用。
基因或核酸的“表达”不仅包含细胞基因表达，还包含在克隆***和任何其他背景下的一种或多种核酸的转录和翻译。
如本文使用的，“载体”是允许或促进实体从一种环境到另一种的转移的工具。例如，在重组DNA技术中使用的一些载体允许实体例如DNA区段(例如异源DNA区段，例如异源cDNA区段)转移到靶细胞内。本发明包含重组载体，其可以包括病毒载体、细菌载体、原生动物载体、DNA载体或其重组体。
关于在载体中表达的外源DNA(例如编码目的表位和/或抗原和/或治疗剂)和提供此类外源DNA的文件，以及关于用于增强核酸分子表达的转录和/或翻译因子的表达，并且尤其关于术语例如“目的表位”、“治疗剂”、“免疫应答”、“免疫学应答”、“保护性免疫应答”、“免疫学组合物”、“免疫原性组合物”和“疫苗组合物”，参考于1999年11月23日颁发的美国专利号5,990,091以及WO 98/00166和WO 99/60164，以及其中引用的文件和在该专利和那些PCT申请的审查中记录的文件；所有这些均通过引用并入本文。因此，美国专利号5,990,091以及WO 98/00166和WO 99/60164，以及其中引用的文件和在该专利和那些PCT申请的审查中记录的文件，以及本文引用或以其他方式通过引用并入本文的其他文件，可以在本发明的实践中咨询；并且其中引用的所有外源核酸分子、启动子和载体均可用于本发明的实践中。在这点上，还提及美国专利号6,706,693；6,716,823；6,348,450；美国专利申请序列号10/424,409；10/052,323；10/116,963；10/346,021；以及来自PCT/US98/16739，于1999年2月25日公开的WO 99/08713。
本发明的方面包含待经由递送***递送到生物或细胞或目的基因座内的本发明的TALE和CRISPR-Cas***。一种递送方法是经由载体，其中所述载体是病毒载体，例如慢病毒或杆状病毒或优选腺病毒/腺相关病毒载体，但其他递送方法也是已知(例如酵母***、微泡、基因枪/将载体附着至金纳米颗粒的方法)且提供的。在一些实施方案中，病毒或质粒载体中的一种或多种可以经由纳米颗粒、外来体、微泡或基因枪递送。
如本文使用的，术语“药物组合物”和“药物”、“疫苗的组合物”、“疫苗”、“疫苗组合物”、“治疗组合物”和“治疗-免疫原性组合物”涵盖诱导针对抗原或病原体的保护的任何组合物。在一些实施方案中，保护可以是由于抑制或预防由病原体的感染。在其他实施方案中，可以通过针对一种或多种目的抗原的免疫应答诱导保护或所述免疫应答有效针对抗原保护；例如在施用或注射到对象内之后，引发针对靶向抗原或免疫原的保护性免疫应答，或者提供针对由本发明的本发明腺病毒载体表达的抗原或免疫原的有效保护。术语“药物组合物”意指递送至对象的任何组合物。在一些实施方案中，组合物可以递送以抑制或预防通过病原体的感染。
“治疗有效量”是编码目的基因的重组载体的量或浓度，当施用于对象时，其产生针对目的基因产物的治疗应答或免疫应答。
如本文使用的，术语“病毒载体”包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、甲病毒和单纯疱疹病毒。
本发明包含使用能量形式的内源或外源基因表达的空间与时间控制。能量形式可以包括但不限于电磁辐射、声能、化学能和热能。在本发明的优选实施方案中，能量形式是电磁辐射，优选光能。控制内源基因表达的先前方法例如与DNA结合锌指蛋白连接的转录激活物未提供用于时间或空间控制的机制。本文描述的***的光激活能力允许诱导基因表达调控，以在局限性的细胞群体内在精确时间开始。
如本申请中详述的控制方面涉及至少一种或多种开关。如本文使用的，术语“开关”指组分***或集合，其以协调方式起作用，以影响生物功能的变化，包含生物功能的所有方面，例如该功能的激活、阻遏、增强或终止。在一个方面，术语开关包含基因开关，其包含基因调节蛋白质和这些蛋白质识别的特异性DNA序列的基本组分。在一个方面，开关涉及在基因调节中使用的诱导和阻遏***。一般而言，诱导***可以是关闭的，除非存在允许基因表达的一些分子(称为诱导物)。该分子被说成“诱导表达”。这通过其发生的方式依赖控制机制以及细胞类型中的差异。阻遏***是除了在一些分子(称为辅阻遏物)的存在下之外，抑制基因表达的***。该分子被说成“阻遏表达”。这通过其发生的方式依赖控制机制以及细胞类型中的差异。如本文使用的，术语“诱导”可以包含开关的所有方面，与涉及的分子机制无关。相应地，如由本发明包含的开关可以包括但不限于基于抗生素的诱导***、基于电磁能的诱导***、基于小分子的诱导***、基于核受体的诱导***和基于激素的诱导***。在更优选的实施方案中，开关可以是四环素(Tet)/DOX诱导***、光诱导***、脱落酸(ABA)诱导***、cumate阻遏物/操纵子***、4OHT/***诱导***、基于蜕皮激素的诱导***或FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导***。
在本发明的一个方面，至少一种开关可以与TALE或CRISPR-Cas***结合，其中所述TALE或CRISPR-Cas***的活性通过与关于开关的至少一种诱导物能源接触而加以控制。如本文关于本发明的方面使用的，术语“接触”指在开关和诱导物能源之间的任何结合关系，其可以是与组分的物理相互作用(如结合在一起的分子或蛋白质中)或处于通过由能源发出的能量的路径中或被能源发出的能量击中(如在光吸收或反射、热或声音的情况下)。在本发明的一些方面，开关与诱导物能源的接触通过施加诱导物能源来实现。本发明还包含经由被动反馈***的接触。这包括但不限于任何被动调节机制，通过其TALE或CRISPR-Cas***活性通过与诱导物能源接触而加以控制，所述诱导物能源已经存在且因此无需施加。例如，该能源可以是已经存在于细胞或细胞环境中的分子或蛋白质。实现被动接触的相互作用可以包括但不限于受体/配体结合、受体/化学配体结合、受体/蛋白质结合、抗体/蛋白质结合、蛋白质二聚化、蛋白质异源二聚化、蛋白质多聚化、核受体/配体结合、翻译后修饰例如磷酸化、脱磷酸化、泛素化或去泛素化。
两种关键分子工具在光响应转录激活物样(TAL)效应物***的设计中利用(leveraged)。第一种，经改造的TAL效应物的DNA结合特异性用于将复合物定位至基因组中的特定区域。第二种，光诱导的蛋白质二聚化用于将激活或阻遏结构域吸引至由TAL效应物指定的区域，导致下游基因的调控。
诱导效应物考虑用于其中需要时间或空间特异性基因表达控制的体外或体内应用。体外例子：发育基因的时间精确诱导/抑制，以阐明发育线索的时机，用于生成细胞类型模式化组织的细胞命运重编程因子的空间控制诱导。体内例子：在特异性脑区内的基因表达的组合时间和空间控制。
在本发明的优选实施方案中，诱导效应物是光诱导的转录效应物(LITE)。LITE***的模块性允许任何数目的效应物结构域用于转录调控。在特别有利的实施方案中，转录激活物样效应物(TALE)和激活结构域VP64用于本发明中。
LITE设计为以时间和空间精确方式调控或改变个别内源基因的表达。每种LITE可以包含由下述组成的两组分***：定制的DNA结合转录激活物样效应物(TALE)蛋白质、来自拟南芥(Arabadopsis thaliana)的光应答性隐花色素异源二聚体、以及转录激活/阻遏结构域。TALE设计为与目的基因的启动子序列结合。TALE蛋白质融合至隐花色素异源二聚体的一半(隐花色素-2或CIB1)，而剩余隐花色素配偶体融合至转录效应物结构域。效应物结构域可以是激活物，例如VP16、VP64或p65，或者阻遏物例如KRAB、EnR或SID。在LITE的未受刺激状态，TALE-隐花色素2蛋白质定位至目的基因的启动子，但不与CIB1-效应物蛋白质结合。在用蓝光谱光刺激LITE后，隐花色素-2变得激活，经历构象变化，并且揭示其结合结构域。CIB1依次又与隐花色素-2结合，导致效应物结构域定位至目的基因的启动子区且起始基因过表达或沉默。
激活物和阻遏物结构域可以基于物种、强度、机制、持续时间、尺寸或任何数目的其他参数加以选择。优选的效应物结构域包括但不限于转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录-蛋白质召募结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域或抗体呈现结构域。
LITE或任何其他诱导效应物中的基因靶向可以经由定制的TALE DNA结合蛋白的特异性来实现。选择目的基因的启动子区中的靶序列，并且设计对该序列定制的TALE。TALE的关键部分由长度34个氨基酸的串联重复组成。尽管这些重复的序列是几乎相同的，但每种重复的第12和13个氨基酸(称为重复可变双残基)不同，决定每种重复的核苷酸结合特异性。因此，通过合成具有TALE单体重复的适当排序的构建体，制备对靶启动子序列特异性的DNA结合蛋白。
在本发明的有利实施方案中，本文提供的方法使用分离、非天然存在、重组或经改造的DNA结合蛋白，其包含TALE单体或TALE单体或半单体作为其组构结构的一部分，这允许以改善的效率和扩大的特异性靶向核酸序列。
天然存在的TALE或“野生型TALE”是由变形菌的众多物种分泌的核酸结合蛋白。TALE多肽含有由高度保守的单体多肽的串联重复构成的核酸结合结构域，所述单体多肽长度主要为33、34或35个氨基酸，并且主要在氨基酸位置12和13中彼此不同。在有利实施方案中，核酸是DNA。如本文使用的，术语“多肽单体”、“TALE单体”或“单体”用于指在TALE核酸结合结构域内高度保守的重复多肽序列，并且术语“重复可变双残基”或“RVD”用于指在多肽单体的位置12和13处高度可变的氨基酸。包含在DNA结合结构域内的TALE单体的一般表示是X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35，其中下标指示氨基酸位置，并且X表示任何氨基酸。X12X13指示RVD。在一些多肽单体中，在位置13处的可变氨基酸缺失或不存在，并且在此类单体中，RVD由单个氨基酸组成。在此类情况下，RVD可以可替代地表示为X*，其中X表示X12，并且(*)指示X13不存在。DNA结合结构域包含TALE单体的几个重复，并且这可以表示为(X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35)z，其中在有利实施方案中，z是至少5-40。在进一步有利的实施方案中，z是至少10-26。
TALE单体具有由在其RVD内的氨基酸身份决定的核苷酸结合亲和力。例如，具有NI的RVD的多肽单体优先与腺嘌呤(A)结合，具有NG的RVD的单体优先与胸腺嘧啶(T)结合，具有HD的RVD的单体优先与胞嘧啶(C)结合，并且具有NN的RVD的单体优先与腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)结合。在本发明的另外一个实施方案中，具有IG的RVD的单体优先与T结合。因此，在TALE的核酸结合结构域中的多肽单体重复的数目和次序决定其核酸靶特异性。在本发明的再进一步的实施方案中，具有NS的RVD的单体识别所有四个碱基对，并且可以与A、T、G或C结合。TALE的结构和功能例如在Moscou等人，Science 326:1501(2009)；Boch等人，Science326:1509-1512(2009)；和Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中进一步描述，所述参考文献各自整体通过引用并入。
在本发明的方法中使用的多肽是分离、非天然存在、重组或经改造的核酸结合蛋白，其具有含有多肽单体重复的核酸或DNA结合区，所述多肽单体重复设计为靶向特异性核酸序列。
如本文描述的，具有HN或NH的RVD的多肽单体优先与鸟嘌呤结合，并且从而允许生成对于含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在本发明的优选实施方案中，具有RVD RN、NN、NK、SN、NH、KN、HN、NQ、HH、RG、KH、RH和SS的多肽单体优先与鸟嘌呤结合。在本发明的有利得多的实施方案中，具有RVD RN、NK、NQ、HH、KH、RH、SS和SN的多肽单体优先与鸟嘌呤结合，并且从而允许生成对于含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在本发明的甚至更有利的实施方案中，具有RVD HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN和SS的多肽单体优先与鸟嘌呤结合，并且从而允许生成对于含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在进一步有利的实施方案中，对于鸟嘌呤具有高结合特异性的RVD是RN、NH RH和KH。此外，具有NV的RVD的多肽单体优先与腺嘌呤和鸟嘌呤结合。在本发明的更优选的实施方案中，具有H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA和S*的RVD的单体以可比较的亲和力与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶结合。
在本发明的甚至更有利的实施方案中，对于腺嘌呤具有特异性的RVD是NI、RI、KI、HI和SI。在本发明的更优选的实施方案中，对于腺嘌呤具有特异性的RVD是HN、SI和RI，最优选地，对于腺嘌呤特异性的RVD是SI。在本发明的甚至更优选的实施方案中，对于胸腺嘧啶具有特异性的RVD是NG、HG、RG和KG。在本发明的进一步有利的实施方案中，对于胸腺嘧啶具有特异性的RVD是KG、HG和RG，最优选地，对于胸腺嘧啶特异性的RVD是KG或RG。在本发明的甚至更优选的实施方案中，对于胞嘧啶具有特异性的RVD是HD、ND、KD、RD、HH、YG和SD。在本发明的进一步有利的实施方案中，对于胞嘧啶具有特异性的RVD是SD和RD。关于待掺入本发明的最优选实施方案内的代表性RVD和它们靶向的核苷酸参考图7B。在本发明的进一步有利的实施方案中，变体TALE单体可以包含如图7A中所述，对于核苷酸显示出特异性的RVD中的任一种。所有此类TALE单体均允许生成能够与相关但不相同的靶核酸序列储库结合的变性TALE多肽。在本发明的再进一步的实施方案中，RVD NT可以与G和A结合。在本发明的再进一步的实施方案中，RVD NP可以与A、T和C结合。在本发明的更有利的实施方案中，至少一种选择的RVD可以是NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、KI、HI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA或NC。
核酸或DNA结合结构域的一种或多种多肽单体的预定N末端值C末端次序决定本发明的多肽将与之结合的相应的预定靶核酸序列。如本文使用的，单体和至少一个或多个半单体“特别排序，以靶向”目的基因组基因座或基因。在植物基因组中，天然TALE结合位点始终以胸腺嘧啶(T)开始，其可以由在TALE多肽的非重复N末端内的隐藏信号指定；在一些情况下，该区域可以被称为重复0。在动物基因组中，TALE结合位点不一定必须以胸腺嘧啶(T)开始，并且本发明的多肽可以靶向以T、A、G或C开始的DNA序列。TALE单体的串联重复始终以半长度重复或序列段结束，所述序列可以仅与重复全长TALE单体的前20个氨基酸共享同一性，并且该半重复可以被称为半单体(图8)。因此，它遵循待靶向的核酸或DNA的长度等于完全单体的数目加上二。
例如，核酸结合结构域可以改造为含有以N末端至C末端方向排列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个多肽单体，以结合预定的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25核苷酸长度核酸序列。在本发明的更有利的实施方案中，核酸结合结构域可以改造为含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个全长多肽单体，其特别排序或排列以分别靶向长度7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28个核苷酸的核酸序列。在某些实施方案中，多肽单体是邻接的。在一些实施方案中，半单体可以用于代替一个或多个单体，特别当它们存在于TALE多肽的C末端时。
多肽单体一般长度为33、34或35个氨基酸。除了RVD之外，多肽单体的氨基酸序列是高度保守的，或如本文描述的，除了RVD之外，多肽单体中的氨基酸显示出影响TALE活性的模式，其鉴定可以用于本发明的优选实施方案中。单体序列中的氨基酸的代表性组合(除了RVD)由申请人显示为对TALE活性具有作用(图10)。在本发明的更优选的实施方案中，当DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z,时，其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，其中z可以是至少5-26，随后氨基酸的优选组合是在X1-4处的[LTLD]或[LTLA]或[LTQV]，或者在位置X30-33或X31-34或X32-35处的[EQHG]或[RDHG]。此外，当单体长度为34个氨基酸时，在单体中的其他目的氨基酸组合是在X1-4处的[LTPD]和在X16-20处的[NQALE]和在X32-34处的[DHG]。当单体长33或35个氨基酸时，则相应转变在邻接氨基酸[NQALE]和[DHG]的位置中发生；优选地，本发明的实施方案可以具有在X15-19或X17-21处的[NQALE]和在X31-33或X33-35处的[DHG]。
在本发明的再进一步的实施方案中，当单体长度为34个氨基酸时，在单体中的目的氨基酸组合是在X1-4处的[LTPD]和在X16-20处的[KRALE]和在X32-34处的[AHG]，或在X1-4处的[LTPE]和在X16-20处的[KRALE]和在X32-34处的[DHG]。当单体长33或35个氨基酸时，则相应转变在邻接氨基酸[KRALE]、[AHG]和[DHG]的位置中发生。在优选实施方案中，邻接氨基酸的位置可以是(在X1-4处的[LTPD]和在X15-19处的[KRALE]和在X31-33处的[AHG])或(在X1-4处的[LTPE]和在X15-19处的[KRALE]和在X31-33处的[DHG])或(在X1-4处的[LTPD]和在X17-21处的[KRALE]和在X33-35处的[AHG])或(在X1-4处的[LTPE]和在X17-21处的[KRALE]和在X33-35处的[DHG])。在本发明的再进一步的实施方案中，邻接氨基酸[NGKQALE]存在于位置X14-20或X13-19或X15-21处。这些代表性位置提出本发明的多个实施方案，并且提供鉴定在本文描述的所有TALE单体中的另外目的氨基酸或目的氨基酸组合的指导(图9A-F和10)。
下文提供了多肽单体的保守部分的示例性氨基酸序列。在每种序列中的RVD位置由XX或X*(其中(*)指示RVD是单个氨基酸，并且残基13(X13)不存在)表示。
可以在序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中指出的排除RVD的TALE单体的进一步列表在图9A-F中提供，其中X是任何氨基酸，并且下标是氨基酸位置。还指示了每种单体出现的频率。
如Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述，TALE多肽结合效率可以通过在经改造的TALE DNA结合区的位置N末端或C末端处，将来自“封盖区”的氨基酸序列包括到经改造的TALE内得到增加，所述“封盖区”是天然存在的TALE的DNA结合区的直接N末端或C末端。因此，在某些实施方案中，本文描述的TALE多肽进一步包含N末端封盖区和/或C末端封盖区。
N末端封盖区的示例性氨基酸序列是：
C末端封盖区的示例性氨基酸序列是：
如本文使用的，N末端封盖区的预定“N末端”至“C末端”取向，包含重复TALE单体的DNA结合结构域和C末端封盖区提供了用于在本发明的d-TALE或多肽中的不同结构域组构的结构基础。
整个N末端和/或C末端封盖区无需增强DNA结合区的结合活性。因此，在某些实施方案中，N末端和/或C末端封盖区的片段包括在本文描述的TALE多肽中。
在某些实施方案中，本文描述的TALE多肽包含N末端封盖区片段，其包括N末端封盖区的至少10、20、30、40、50、54、60、70、80、87、90、94、100、102、110、117、120、130、140、147、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270个氨基酸。在某些实施方案中，N末端封盖区片段氨基酸具有N末端封盖区的C末端(DNA结合区近端)。如Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述，包括C末端240个氨基酸的N末端封盖区片段增强与全长封盖区相等的结合活性，而包括C末端147个氨基酸的片段保留全长封盖区的大于80％功效，并且包括C末端117个氨基酸的片段保留全长封盖区的大于50％活性。
在某些实施方案中，本文描述的TALE单体包含C末端封盖区片段，其包括C末端封盖区的至少6，10，20，30，37，40，50，60，68，70，80，90，100，110，120，127，130，140，150，155，160，170，180个氨基酸。在某些实施方案中，C末端封盖区片段氨基酸具有C末端封盖区的N末端(DCA结合区近端)。如Zhang等人，Cature Biotechnology29:149-153(2011)中所述，包括C末端68个氨基酸的C末端封盖区片段增强与全长封盖区相等的结合活性，而包括C末端20个氨基酸的片段保留全长封盖区的大于50％功效。
在某些实施方案中，本文描述的TALE多肽的封盖区无需具有与本文提供的封盖区序列相同的序列。因此，在一些实施方案中，本文描述的TALE多肽的封盖区具有的序列与本文提供的封盖区氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同或共享同一性。序列同一性与序列同源性相关。同源性比较可以通过肉眼，或更通常地，借助于可容易获得的序列比较程序来进行。这些商购可得的计算机程序可以计算在两个或更多个序列之间的同源性百分比(％)，并且还可以计算由两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列同一性。在一些优选实施方案中，本文描述的TALE多肽的封盖区具有的序列与本文提供的封盖区氨基酸序列至少95％相同或共享同一性。
序列同源性可以通过本领域已知的许多计算机程序中的任一种生成，所述计算机程序包括但不限于BLAST或FASTA。还可以使用用于进行比对的合适计算机程序如GCGWisconsin Bestfit软件包。一旦软件已产生最佳比对，就能够计算同源性％，优选序列同一性％。软件通常将这作为序列比较的一部分完成，并且生成数字结果。
在本文描述的有利实施方案中，本发明的TALE多肽包括与一种或多种效应物结构域连接的核酸结合结构域。术语“效应物结构域”或“调节和功能结构域”指具有除与由核酸结合结构域识别的核酸序列结合外的活性的多肽序列。通过组合核酸结合结构域与一种或多种效应物结构域，本发明的多肽可以用于将由效应物结构域介导的一种或多种功能或活性靶向至核酸结合结构域与之特异性结合的特定靶DNA序列。术语“效应物结构域”和“功能结构域”在本申请自始至终可互换使用。
在本文描述的TALE多肽的一些实施方案中，由效应物结构域介导的活性是生物活性。例如，在一些实施方案中，效应物结构域是转录抑制剂(即阻遏物结构域)，例如mSin相互作用结构域(SID)、SID4X结构域或Krüppel结合框(KRAB)或KRAB结构域的片段。在一些实施方案中，效应物结构域是转录增强子(即，激活结构域)，例如VP16、VP64或p65激活结构域。图11中提供了这些不同激活结构域对Sox2 mRNA水平的作用的图解比较。
如本文使用的，VP16是疱疹病毒蛋白质。它是非常强的转录激活物，其特异性激活病毒立即早期基因表达。VP16激活结构域富含酸性残基，并且已视为典型的酸性激活结构域(AAD)。如本文使用的，VP64激活结构域是VP16的最低限度激活结构域的四聚重复。如本文使用的，p65是组成NFκB转录因子复合物的两种蛋白质之一。另一种蛋白质是p50。p65激活结构域是p65亚单位的一部分，即使在不存在p50的情况下，所述p65亚单位也是有力的转录激活物。在某些实施方案中，效应物结构域是哺乳动物蛋白质或其生物活性片段。此类效应物结构域被称为“哺乳动物效应物结构域”。
在一些实施方案中，核酸结合例如与效应物结构域或功能结构域连接，所述效应物结构域或功能结构域包括但不限于转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA羟甲基化酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录调节蛋白(或转录复合物召募)结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域、抗体呈现结构域、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰酶的召募者；组蛋白修饰酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、组蛋白激酶、组蛋白磷酸酶、组蛋白核糖基酶、组蛋白脱核糖基酶、组蛋白泛素酶、组蛋白去泛素酶、组蛋白生物素酶和组蛋白尾部蛋白酶的抑制剂。
在一些实施方案中，效应物结构域是显示出活性的蛋白质结构域，所述活性包括但不限于转座酶活性、整合酶活性、重组酶活性、解离酶活性、转化酶活性、蛋白酶活性、DNA甲基转移酶活性、DNA脱甲基酶活性、组蛋白乙酰化酶活性、组蛋白脱乙酰基酶活性、核酸酶活性、核定位信号转导活性、转录阻遏物活性、转录激活物活性、转录因子召募活性或细胞摄取信号转导活性。本发明的其他优选实施方案可以包括本文描述的活性的任何组合。
如Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述，具有核酸结合结构域和效应物结构域的TALE多肽可以用于将效应物结构域的活性靶向具有由核酸结合结构域识别的预定核酸序列的基因组位置。在本文描述的本发明的一些实施方案中，TALE多肽设计且用于将基因调节活性例如转录或翻译修饰物活性，靶向至调节、编码和/或基因间隔区，例如增强子和/或阻遏物活性，其可以影响编码区上游和下游的转录，并且可以用于增强或阻遏基因表达。例如，TALE多肽可以包含具有来自转录因子的DNA结合结构域的效应物结构域、来自转录因子(激活物、阻遏物、辅激活物、辅阻遏物)的效应物结构域、沉默子、核激素受体和/或染色质相关蛋白质及其修饰物(例如甲基化酶、激酶、磷酸化酶、乙酰化酶和脱乙酰基酶)。在优选实施方案中，TALE多肽可以包含核酸酶结构域。在更优选的实施方案中，核酸酶结构域是非特异性FokI核酸内切酶催化结构域。
在进一步的实施方案中，用于调节基因表达的有用结构域还可以得自癌基因的基因产物。在本发明的再进一步有利的实施方案中，具有整合酶或转座酶活性的效应物结构域可以用于促进外源核酸序列整合到特异性核酸序列区内，消除(敲除)特异性内源核酸序列，和/或修饰外遗传信号和后续基因调节，例如通过促进DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰化酶和组蛋白脱乙酰基酶活性。在其他实施方案中，具有核酸酶活性的效应物结构域可以通过切割或消化本发明的多肽与之特异性结合的靶序列用于改变基因组结构，并且可以允许在这些位点处引入外源基因。在再进一步的实施方案中，具有转化酶活性的效应物结构域可以通过交换DNA配对的取向用于改变基因组结构。
在特别有利的实施方案中，在本发明的方法中使用的多肽可以用于靶向转录活性。如本文使用的，术语“转录因子”指蛋白质或多肽，其结合与目的基因组基因座或基因结合的特异性DNA序列，以控制转录。转录因子可以促进(作为激活物)或阻断(作为阻遏物)RNA聚合酶召募至目的基因。转录因子可以单独或作为更大的蛋白质复合物的一部分执行其功能。由转录因子使用的基因调节机制包括但不限于a)RNA聚合酶结合的稳定或失稳，b)组蛋白蛋白质的乙酰化或脱乙酰基，和c)辅激活物或辅阻遏物蛋白质的召募。此外，转录因子在生物活性中起作用，所述生物活性包括但不限于基础转录、转录增强、发育、对细胞内信号转导的应答、对环境线索的应答、细胞周期控制和发病机理。就关于转录因子的信息而言，提及整体通过引用并入本文的Latchman和DS(1997)Int.J.Biochem.Cell Biol.29(12):1305–12；Lee TI，Young RA(2000)Annu.Rev.Genet.34:77–137和Mitchell PJ，TjianR(1989)Science 245(4916):371–8。
LITE的光应答性经由隐花色素-2和CIB1的激活和结合来实现。如上所述，蓝光刺激诱导隐花色素-2中的激活构象变化，导致其结合配偶体CIB1的召募。该结合是快速和可逆的，在脉冲刺激后<15秒内实现饱和，并且在刺激结束后<15分钟回到基线。这些快速结合动力学导致LITE***仅暂时束缚于转录/翻译和转录物/蛋白质降解的速度，而不是诱导剂的摄取和清除。隐花色素-2激活也是高度敏感的，允许使用低光强度刺激和减轻光毒性的危险。进一步地，在例如完整哺乳动物脑的背景下，可见光强度可以用于控制LITE刺激区域的大小，允许可以提供比单独的载体递送更大的精确度。
LITE***的模块性允许任何数目的效应物结构域用于转录调控。因此，激活物和阻遏物结构域可以基于物种、强度、机制、持续时间、尺寸或任何数目的其他参数加以选择。
申请人接下来呈现LITE***的两种原型表现。第一个例子是设计为激活小鼠基因NEUROG2的转录的LITE。选择位于小鼠NEUROG2的上游启动子区中的序列TGAATGATGATAATACGA作为靶，并且设计且合成TALE以匹配该序列。TALE序列经由核定位信号(氨基酸：SPKKKRKVEAS)与隐花色素-2的序列连接，以促进蛋白质从细胞溶质到核空间的转运。合成第二载体，其包含使用相同的核定位信号与转录激活物结构域VP64连接的CIB1结构域。该第二载体，也是GFP序列，通过2A翻译跳过信号与CIB1-VP64融合序列分开。每种构建体的表达由遍在的组成型启动子(CMV或EF1-α)驱动。用两种载体共转染来自Neuro 2A细胞系的小鼠成神经瘤细胞。在温育以允许载体表达后，通过来自488nm LED阵列的周期脉冲的蓝光刺激样品。未受刺激的共转染的样品和仅用荧光报道分子YFP转染的样品用作对照。在每次实验结束时，从经由qPCR分析的样品中纯化mRNA。
截短形式的隐花色素-2和CIB1与全长形式的隐花色素-2和CIB1组合克隆且测试，以便测定每个异源二聚体对的有效性。由隐花色素-2蛋白质的保守光响应区组成的CRY2PHR结构域和全长形式的CIB1的组合导致最高的Neurog2 mRNA水平上调(超过YFP样品～22倍和超过未受刺激的共转染样品～7倍)。全长隐花色素-2(CRY2)与全长CIB1的组合导致更低的绝对激活水平(超过YFP～4.6倍)，以及更低的基线激活(对于未受刺激的共转染的样品，超过YFP～1.6倍)。这些隐花色素蛋白质配对可以选择用于特定用途，取决于所需的绝对诱导水平和使LITE***的基线“泄露”降到最低的必要性。
激活和可逆性的速度是LITE***的关键设计参数。为了表征LITE***的动力学，测试由Neurog2 TALE-CRY2PHR和CIB1-VP64形式的***组成的构建体，以测定其激活和失活速度。在提取前将样品刺激少至0.5小时至长达24小时。在最短的0.5小时时间点观察到Neurog2表达的上调(相对于YFP样品～5倍)。Neurog2表达在12小时刺激时达到峰值(相对于YFP样品～19倍)。通过将共转染的样品刺激6小时分析失活动力学，在所述时间停止刺激，并且将样品保留在培养中0至12小时，以允许mRNA降解。Neurog2 mRNA水平在刺激结束后0.5小时达到峰值(相对于YFP样品～16倍)，这之后水平降解，在到12小时回到接近基线水平之前具有～3小时半衰期。
第二种原型例子是设计为激活人基因KLF4的转录的LITE。选择位于人KLF4的上游启动子区中的序列TTCTTACTTATAAC作为靶，并且设计且合成TALE，以匹配该序列。TALE序列经由核定位信号(氨基酸：SPKKKRKVEAS)与CRY2PHR的序列连接。上文描述的相同CIB1-VP64激活物蛋白质也用于LITE***的这种体现中。用两种载体共转染来自HEK293FT细胞系的人胚胎肾细胞。在温育以允许载体表达后，通过来自488nm LED阵列的周期脉冲的蓝光刺激样品。未受刺激的共转染的样品和仅用荧光报道分子YFP转染的样品用作对照。在每次实验结束时，从经由qPCR分析的样品中纯化mRNA。
通过用增加的光功率(0-9mW/cm2)刺激样品来测试LITE***的光强度应答。对于低至0.2mW/cm2的刺激观察到KLF4 mRNA水平的上调。KLF4上调在5mW/cm2时变得饱和(相对于YFP样品2.3倍)。还对于高达9mW/cm2的功率执行细胞活力测试，并且显示>98％细胞活力。类似地，测试对不同刺激工作循环的KLF4 LITE应答(1.6-100％)。在不同工作循环之间未观察到KLF4激活中的差异，指示每15秒低至0.25秒的刺激范式应导致最大限度激活。
本发明考虑例如电磁辐射、声能或热能的能源。有利地，电磁辐射是可见光的组分。在优选实施方案中，光是波长约450-约495nm的蓝光。在尤其优选的实施方案中，波长是约488nm。在另一个优选实施方案中，光刺激是经由脉冲。光功率可以范围为约0-9mW/cm2。在优选实施方案中，每15秒低至0.25秒的刺激范式应导致最大限度激活。
本发明特别涉及干扰基因组或表观基因组基因座或者改变细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其中所述基因组或表观基因组基因座可以与非天然存在或经改造的组合物接触，所述组合物包含脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽。
本发明的细胞可以是原核细胞或真核细胞，有利地动物细胞，更有利地哺乳动物细胞。
该多肽可以包括与化学品敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者至少一种或多种效应物结构域。化学品或能量敏感蛋白质或其片段可以在通过化学品来源结合诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体。多肽还可以包括与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个变体TALE单体或半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述化学品或能量敏感蛋白质或其片段可以在通过化学品来源诱导后与相互作用配偶体结合。该方法还可以包括施加化学品来源且测定基因组基因座的表达是改变的。
存在该化学品诱导***的几种不同设计：1.由脱落酸(ABA)诱导的基于ABI-PYL的***(参见例如，http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans；4/164/rs2)，2.由雷帕霉素(或基于雷帕霉素的相关化学品)诱导的基于FKBP-FRB的***(参见例如，http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.html)，3.由赤霉素(GA)诱导的基于GID1-GAI的***(参见例如，http://www.nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.html)。
由本发明考虑的另一种***是基于亚细胞定位中的变化的化学品诱导***。申请人还开发了其中多肽包括DNA结合结构域的***，所述DNA结合结构域包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，连接到与化学品或能量敏感蛋白质进一步连接的至少一种或多种效应物结构域。该蛋白质导致在化学品结合或能量转移至化学品或能量敏感蛋白质后，整个多肽的亚细胞定位中的变化(即，整个多肽从细胞质转运到细胞的核)。整个多肽从一个亚细胞区室或细胞器(在其中它的活性由于缺乏效应物结构域的底物而被隔离)到另一个亚细胞区室或细胞器(在其中存在底物)的这种转运，允许整个多肽与其所需底物(即哺乳动物核中的基因组DNA)接触，并且导致靶基因表达的激活或阻遏。
当效应物结构域是核酸酶时，这类***还可以用于诱导在细胞中的目的基因组基因座的切割。
关于该化学品诱导***的设计是由4-羟基他莫昔芬(4OHT)诱导的基于***受体(ER)的***(参见例如，http://www.pnas.org/content/104/3/1027.abstract)。称为ERT2的***受体的突变的配体结合结构域在4-羟基他莫昔芬结合后易位到细胞的核内。两个串联ERT2结构域由弹性肽接头连接在一起，并且随后融合至靶向哺乳动物基因组中的特异性序列的TALE蛋白质，且与一种或多种效应物结构域连接。该多肽在不存在4OHT的情况下将处于细胞的细胞质中，这致使TALE蛋白质与失活的效应物结构域连接。在4OHT的存在下，4OHT与串联ERT2结构域的结合将诱导整个肽转运到细胞的核内，允许与效应物结构域连接的TALE蛋白质变得活性。
在由4-羟基他莫昔芬(4OHT)诱导的基于***受体(ER)的***的另一个实施方案中，本发明可以包含出核转运信号(NES)。有利地，NES可以具有LDLASLIL的序列。在本发明的进一步实施方案中，任何核受体、甲状腺激素受体、视黄酸受体、***受体、***相关受体、糖皮质激素受体、孕激素受体、雄激素受体的任何天然存在或经改造的衍生物可以用于与基于ER的诱导***类似的诱导***中。
另一种诱导***基于使用由能量、热或无线电波诱导的基于瞬时受体电位(TRP)离子通道的***的设计(参见例如，http://www.sciencemag.org/content/336/6081/604)。这些TRP家族蛋白质响应不同刺激，包括光和热。当该蛋白质由光或热激活时，离子通道将打开且允许离子例如钙进入质膜内。这种涌入(inflex)的离子将与细胞内离子相互作用配偶体结合，所述配偶体与包括TALE蛋白质和一种或多种效应物结构域的多肽连接，并且结合将诱导多肽的亚细胞定位的变化，导致整个多肽进入细胞的核。一旦在核内，与效应物结构域连接的TALE蛋白质变得活性且调控细胞中的靶基因表达。
当效应物结构域是核酸酶时，这类***还可以用于诱导细胞中的目的基因组基因座的切割。光可以用激光或其他形式的能源生成。热可以通过起因于能源的温度升高或纳米颗粒生成，在吸收来自以无线电波形式递送的能源的能量后，所述纳米颗粒释放热。
虽然光激活可以是有利的实施方案，但有时它对于体内应用尤其是不利的，在所述体内应用中光可能不穿透皮肤或其他器官。在这种情况下，考虑了能量激活的其他方法，特别是具有相似效应的电磁能和/或超声。需要时，LITE***的蛋白质配对可以改变和/或修饰用于通过另一种能源的最大限度效应。
电场能量优选基本上如本领域描述的施用，在体内条件下使用约1Volt/cm至约10Volt/cm的一个或多个电脉冲。代替或加上脉冲，电场可以以连续方式递送。电脉冲可以施加1μs-500毫秒，优选1μs-100毫秒。电场可以以连续或以脉冲方式施加约5分钟。
如本文使用的，‘电场能量’是细胞暴露于其的电能。优选地，电场在体内条件下具有约1Volt/cm至约10kVolt/cm或更多的强度(参见WO97/49450)。
如本文使用的，术语‘电场’包括在可变电容和电压下的一个或多个脉冲，并且包括指数和/或方波和/或调制波和/或调制方波形式。提及电场和电应考虑包括提及在细胞环境中的电势差的存在。此类环境可以经由如本领域已知的静电、交流电(AC)、直流电(DC)等设置。电场可以是均匀的、不均匀的或其他方式的，并且可以以时间依赖性方式在强度和/或方向中改变。
电场的单次或多次施加以及超声的单次或多次施加也是可能的，以任何次序和以任何组合。超声和/或电场可以作为单次或多次连续施加或者作为脉冲(脉冲式递送)递送。
电穿孔已用于体外和体内操作中，以将外源材料引入活细胞内。对于体外应用，活细胞的样品首先与目的试剂混合，且置于电极例如平行板之间。随后，电极对细胞/植入混合物施加电场。执行体外电穿孔的***的例子包括Electro Cell Manipulator ECM600产品和Electro Square Porator T820，两者均由BTX Division of Genetronics，Inc制造(参见美国专利号5,869,326)。
已知电穿孔技术(在体外和体内两者)通过对置于治疗区域周围的电极施加短暂高压脉冲起作用。在电极之间生成的电场促使细胞膜暂时变成多孔的，于是目的试剂分子进入细胞。在已知电穿孔应用中，该电场包含约100.mu.s持续时间的以1000V/cm级别的单个方波脉冲。此类脉冲可以例如在Electro Square Porator T820的已知施加中生成。
优选地，电场在体外条件下具有约1V/cm至约10kV/cm的强度。因此，电场可以具有1V/cm、2V/cm、3V/cm、4V/cm、5V/cm、6V/cm、7V/cm、8V/cm、9V/cm、10V/cm、20V/cm、50V/cm、100V/cm、200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm、900V/cm、1kV/cm、2kV/cm、5kV/cm、10kV/cm、20kV/cm、50kV/cm或更多的强度。更优选地，在体外条件下约0.5kV/cm-约4.0kV/cm。优选地，电场在体内条件下具有约1V/cm-约10kV/cm的强度。然而，当递送至靶部位的脉冲数目增加时，电场强度可以降低。因此，设想以更低场强的电场的脉冲式递送。
优选地，电场的施加以多重脉冲例如相同强度和电容的双脉冲或者不同强度和/或电容的序贯脉冲的形式。如本文使用的，术语“脉冲”包括以可变电容和电压的一个或多个电脉冲，并且包括指数和/或方波和/或调制波/方波形式。
优选地，电脉冲作为选自指数波形式、方波形式、调制波形式和调制方波形式的波形递送。
优选实施方案采用以低电压的直流电。因此，申请人公开了电场的使用，所述电场以1V/cm-20V/cm的场强施加于细胞、组织或组织团块共100毫秒或更久，优选15分钟或更久的时期。
超声有利地以约0.05W/cm2-约100W/cm2的功率水平施用。可以使用诊断或治疗超声，或其组合。
如本文使用的，术语“超声”指由机械振动组成的能量形式，所述机械振动的频率如此高，使得它们超过人听力的范围。超声频谱的频率下限一般可以视为约20kHz。超声的大多数诊断应用采用在范围1-15MHz'中的频率(From Ultrasonics in ClinicalDiagnosis，P.N.T.Wells，编辑，第2版，Publ.Churchill Livingstone[Edinburgh，London&NY，1977])。
超声已用于诊断和治疗应用中。当用作诊断工具(“诊断超声”)时，超声通常以高达约100mW/cm2的能量密度范围使用(FDA推荐)，尽管已使用高达750mW/cm2的能量密度。在物理疗法中，超声通常用作在高达约3-4W/cm2的范围内的能源(WHO推荐)。在其他治疗应用中，可以采用更高强度的超声，例如以100W/cm直到1kW/cm2(或甚至更高)的HIFU持续短时间段。如本说明书中使用的，术语“超声”预期包含诊断、治疗和聚焦超声。
聚焦超声(FUS)允许无需侵入探针而递送热能(参见Morocz等人1998Journal ofMagnetic Resonance Imaging第8卷，No.1，第136-142页。另一种形式的聚焦超声是高强度聚焦超声(HIFU)，其由Moussatov等人在Ultrasonics(1998)第36卷，No.8，第893-900页中和TranHuuHue等人在Acustica(1997)第83卷，No.6，第1103-1106页中综述。
优选地，采用诊断超声和治疗超声的组合。然而，该组合不预期是限制性的，并且熟练的读者应当理解可以使用任何多种的超声组合。另外，能量密度、超声频率和暴露时期可以不同。
优选地，对超声能源的暴露是以约0.05-约100Wcm-2的功率强度。甚至更优选地，对超声能源的暴露是以约1-约15Wcm-2的功率强度。
优选地，对超声能源的暴露是以约0.015-约10.0MHz的频率。更优选地，对超声能源的暴露是以约0.02-约5.0MHz或约6.0MHz的频率。最优选地，超声以3MHz的频率施加。
优选地，暴露是约10毫秒至约60分钟的时期。优选地，暴露是约1秒至约5分钟的时期。更优选地，超声施加约2分钟。然而，取决于待破坏的特定靶细胞，暴露可以是更长持续时间，例如15分钟。
有利地，靶组织暴露于频率范围为约0.015-约10MHz的以约0.05Wcm-2-约10Wcm-2的声功率密度的超声能源(参见WO 98/52609)。然而，替代方案也是可能的，例如暴露于以超过100Wcm-2的声功率密度的超声能源，但持续减少的时间段，例如1000Wcm-2持续毫秒或更少范围内的时期。
优选地，超声的施加以多重脉冲的形式；因此，连续波和脉冲波(超声的脉冲式递送)两者均可以任何组合采用。例如，可以施加连续波超声，随后为脉冲波超声，或反之亦然。这可以重复任何次数，以任何次序和组合。脉冲波超声可以针对连续波超声的背景施加，并且任何脉冲数目可以任何组的数目使用。
优选地，超声可以包含脉冲波超声。在高度优选的实施方案中，超声以0.7Wcm-2或1.25Wcm-2的功率密度作为连续波施加。如果使用脉冲波超声，则可以采用更高的功率密度。
超声的使用是有利的，因为如同光，它可以准确地集中于靶。此外，超声是有利的，因为与光不同，它可以更深地聚焦到组织内。它因此更适合于全组织穿透(例如但不限于肝叶)或全器官(例如但不限于整个肝或整个肌肉，例如心脏)治疗。另一个重要优点是超声是非侵入性刺激，其用于广泛多样的诊断和治疗应用中。例如，超声在医学成像技术中，以及另外的整形外科治疗中是众所周知的。此外，适合于将超声施加于对象脊椎的器械是可广泛获得的，并且它们的使用是本领域众所周知的。
LITE的快速转录应答和内源靶向制备用于研究转录动态的理想***。例如，LITE可以用于研究在诱导靶基因表达后mRNA剪接变体产生的动力学。在转录周期的另一个末端，mRNA降解研究通常响应强细胞外刺激执行，促使过多基因中的表达水平变化。LITE可以用于可逆地诱导内源靶的转录，这之后可以停止刺激并且可以跟踪独特靶的降解动力学。
LITE的精确度可以为时间遗传调节提供与实验干预一致的动力。例如，在长时程增强(LTP)中具有可疑牵涉的靶可以在器官型或解剖的神经元培养物中调控，但仅在刺激期间调控以诱导LTP，以便避免干扰细胞的正常发育。类似地，在显示出疾病表型的细胞模型中，怀疑涉及特定疗法的有效性的靶可以仅在治疗期间得到调控。相反，遗传靶可以仅在病理刺激期间得到调控。其中遗传线索对外部实验刺激的定时具有相关性的任何数目的实验可以潜在获益于LITE调控的使用。
体内背景提供使用LITE控制基因表达的同等丰富的机会。如上所述，光诱导性提供了先前无法达到的空间精确度的潜力。利用光极技术的发展，刺激光纤导线可以置于精确的脑区中。刺激区域大小随后可以通过光强度调谐。这可以与LITE的递送结合完成，经由病毒载体或美国临时专利申请号61/671,615的分子雪橇(molecular sled)，或如果转基因LITE动物是可获得的，则可以消除病毒的使用，同时仍允许调控精确脑区中的基因表达。LITE可以用于透明生物例如固定的斑马鱼中，以允许非常精确的激光诱导的局部基因表达变化。
本发明还考虑了使用CRISPR/Cas***的多路基因组改造。致病性遗传变体和元件的功能阐明需要精确的基因组编辑技术。II型原核CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)适应性免疫***已显示促进RNA引导的位点特异性DNA切割。申请人改造了两种不同类型的CRISPR***，并且证实Cas9核酸酶可以通过短RNA指导，以诱导在人和小鼠细胞中的内源基因组基因座处的精确切割。Cas9还可以转换成切口酶，以促进具有最低限度诱变活性的同源性指导的修复。最后，多重引导序列可以编码到单个CRISPR阵列内，以允许在哺乳动物基因组内的几个位点的同时编辑，证实CRISPR技术的容易编程性和广泛应用性。
一般而言，“CRISPR***”共同指涉及CRISPR相关(“Cas”)基因表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因活性的转录物及其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr匹配序列(在内源CRISPR***的背景下，包含“直接重复”和tracrRNA加工的部分直接重复)、引导序列(在内源CRISPR***的背景下，也称为“间隔物”)、或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。在一些实施方案中，CRISPR***的一种或多种组分衍生自I型、II型或III型CRISPR***。在一些实施方案中，CRISPR***的一种或多种组分衍生自包含内源CRISPR***的特定生物，例如酿脓链球菌。一般而言，CRISPR***的特征在于促进在靶序列(在内源CRISPR***的背景下，也称为原型间隔物)的位点处的CRISPR复合物形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”指针对其设计互补引导序列的序列，其中在靶序列和引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列定位于细胞的核或细胞质中。
通常，在内源CRISPR***的背景下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交且与一种或多种Cas蛋白质复合的引导序列)的形成导致在靶序列中或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。不希望受理论束缚，例如通过与tracr匹配序列的全部或一部分杂交，tracr序列的全部或一部分也可以形成CRISPR复合物的一部分，所述tracr匹配序列与引导序列可操作地连接。在一些实施方案中，驱动CRISPR***的一种或多种组分表达的一种或多种载体引入宿主细胞内，从而使得CRISPR***的元件的表达指导在一个或多个靶位点处的CRISPR复合物形成。例如，Cas酶、与tracr-匹配序列连接的引导序列和tracr序列可以各自与分开载体上的分开调节元件可操作地连接。可替代地，由相同或不同调节元件表达的元件中的两种或更多种可以在单个载体中组合，其中一种或多种另外的载体提供在第一载体中不包括的CRISPR***的任何组分。在单个载体中组合的CRISPR***元件可以以任何合适的取向排列，例如一种元件位于就第二元件而言的5’(上游)或就第二元件而言的3’(下游)。一种元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的相同或相反链上，并且以相同或相反方向定向。在一些实施方案中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及下述中的一种或多种的表达：引导序列、tracr匹配序列(任选与引导序列可操作地连接)、和嵌入一种或多种内含子序列内的tracr序列(例如各自在不同内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或全部在单个内含子中)。在一些实施方案中，CRISPR酶、引导序列、tracr匹配序列和tracr序列与相同启动子可操作地连接且由相同启动子表达。
在一些实施方案中，载体包含一个或多个***位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个***位点(例如约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个***位点)位于一种或多种载体的一种或多种序列元件的上游和/或下游。在一些实施方案中，载体包含在tracr匹配序列上游的***位点，并且任选在与tracr匹配序列可操作地连接的调节元件下游，从而使得在引导序列******位点内之后和表达后，引导序列指导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施方案中，载体包含两个或更多个***位点，每个***位点位于两个tracr匹配序列之间，以便允许在每个位点处***引导序列。在此类排列中，两个或更多个引导序列可以包含单个引导序列的两个或更多个拷贝、两个或更多个不同的引导序列或这些的组合。当使用多重不同的引导序列时，单个表达构建体可以用于将CRISPR活性靶向细胞内的多重不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个引导序列。在一些实施方案中，可以提供约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个此类含引导序列载体，并且任选递送至细胞。
在一些实施方案中，载体包含与编码CRISPR酶例如Cas蛋白质的酶编码序列可操作地连接的调节元件。Cas蛋白质的非限制性例子包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。在一些实施方案中，未经修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，例如Cas9。在一些实施方案中，CRISPR酶指导在靶序列的位置处，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补体内的一条或两条链的切割。在一些实施方案中，CRISPR酶指导在距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个或更多个碱基对内的一条或两条链的切割。在一些实施方案中，载体编码CRISPR酶，其就相应的野生型酶而言进行突变，从而使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，在来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸置换(D10A)将来自切割两条链的核酸酶的Cas9转化成切口酶(切割单条链)。致使Cas9成为切口酶的其他突变例子包括但不限于H840A、N854A和N863A。作为进一步例子，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvC III)可以突变，以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9。在一些实施方案中，D10A突变与H840A、N854A或N863A突变中的一种或多种组合，以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施方案中，当突变酶的DNA切割活性就其非突变形式而言小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低时，CRISPR酶视为基本上缺乏所有DNA切割活性。
在一些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列对于在特定细胞例如真核细胞中的表达进行密码子优化。真核细胞可以是特定生物的那些或衍生自特定生物，例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、犬或非人灵长类动物。一般而言，密码子优化指通过下述修饰核酸序列用于在目的宿主细胞中的增强表达的过程：将天然序列的至少一个密码子(例如约或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子)替换为在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子，同时维持天然氨基酸序列。多个物种显示出对于特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。密码子偏好(在生物之间的密码子使用中的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率关联，这依次又被认为尤其依赖于待翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选tRNA在细胞中的优势一般是在肽合成中最频繁使用的密码子的反映。相应地，基于密码子优化，基因可以对于给定生物中的优化基因表达进行修改。密码子使用表是例如在www.kazusa.orjp/codon/(2002年7月9日访问)处可获得的“密码子使用数据库”处可容易获得的，并且这些表可以以许多方式修改。参见Nakamura，Y.,等人“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000)。关于密码子优化特定序列用于在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可获得的，例如Gene Forge(Aptagen；Jacobus，PA)也是可获得的。在一些实施方案中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个，或全部密码子)对应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在一些实施方案中，载体编码包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS的CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶包含在或接近氨基末端处的约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS，在或接近羧基末端处的约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS，或这些的组合(例如在氨基末端处的一个或多个NLS和在羧基末端处的一个或多个NLS)。当存在超过一个NLS时，各自可以不依赖于其他进行选择，从而使得单个NLS可以以超过一个拷贝和/或与以一个或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合存在。在一些实施方案中，当NLS的最近氨基酸在沿从N到C末端的多肽链的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个氨基酸内时，NLS视为接近N或C末端。NLS的非限制性例子包括衍生自下述的NLS序列：具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ IDNO:1)的SV40病毒大T抗原的NLS；来自核质蛋白的NLS(例如具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:2)的核质蛋白二分NLS)；具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQ ID NO:3)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:4)的c-myc NLS；具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:5)的hRNPA1 M9NLS；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:6)；肌瘤T蛋白质的序列VSRKRPRP(SEQ IDNO:7)和PPKKARED(SEQ ID NO:8)；人p53的序列POPKKKPL(SEQ ID NO:9)；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:10)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO:11)和PKQKKRK(SEQ ID NO:12)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:13)；小鼠Mx1蛋白质的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:14)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQID NO:15)；和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:16)。
一般而言，一个或多个NLS具有足够的强度，以驱动CRISPR酶以可检测的量在真核细胞的核中累积。一般而言，核定位活性的强度可以衍生自CRISPR酶中的NLS数目、使用的一种或多种特定NLS或这些因素的组合。在核中的累积的检测可以通过任何合适的技术进行。例如，可检测标记可以融合至CRISPR酶，从而使得在细胞内的定位可以例如与用于检测核定位的方法(例如对于核特异性的染剂例如DAPI)组合显现。还可以从细胞中分离细胞核，其内含物可以通过用于检测蛋白质的任何合适过程进行分析，所述过程例如免疫组织化学、蛋白质印迹或酶活性测定。在核中的累积还可以间接测定，例如通过对于CRISPR复合物形成的效应的测定(例如用于靶序列处的DNA切割或突变的测定，或关于受CRISPR复合物形成和/或CRISPR酶活性影响改变的基因表达活性的测定)，与未暴露于CRISPR酶或复合物，或暴露于缺乏一个或多个NLS的CRISPR酶的对照相比较。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及可以包含可诱导Cas9的可诱导CRISPR。
CRISPR***可以在载体***内编码，所述载体***可以包含一种或多种载体，所述载体可以包含I.与CRISPR/Cas***嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列可操作地连接的第一调节元件，其中所述多核苷酸序列可以包含(a)能够与真核细胞中的靶序列杂交的引导序列、(b)tracr匹配序列和(c)tracr序列，以及II.与编码CRISPR酶的酶编码序列可操作地连接的第二调节元件，其可以包含至少一种或多种核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5'至3'方向排列，其中组分I和II位于***的相同或不同载体上，其中当转录时，tracr匹配序列与tracr序列杂交，并且引导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合，并且其中CRISPR复合物可以包含与下述复合的CRISPR酶：(1)与靶序列杂交的引导序列，和(2)与tracr序列杂交的tracr匹配序列，其中编码CRISPR酶的酶编码序列进一步编码异源功能结构域。
在有利实施方案中，可诱导的Cas9可以在慢病毒中制备。例如，图61描述Tet Cas9载体设计，并且图62描述在293FT细胞中的载体和EGFP表达。特别地，诱导四环素***考虑用于可诱导的CRISPR。载体可以如Markusic等人，Nucleic Acids Research，2005，第33卷，No.6e63中所述进行设计。四环素依赖性转录调节***基于大肠杆菌(Escherichia coli)Tn10四环素抗性操纵子，其由四环素阻遏物蛋白质(TetR)和特异性DNA结合位点，四环素操纵子序列(TetO)组成。在不存在四环素的情况下，TetR二聚化且与TetO结合。四环素或强力霉素(四环素衍生物)可以结合TetR且诱导TetR中的构象变化，导致其与TetO解离。在有利实施方案中，载体可以是单个Tet-On慢病毒载体，具有用于调节CRISPR复合物表达的自调节的rtTA表达。四环素或强力霉素可以考虑用于激活可诱导的CRISPR复合物。
在另一个实施方案中，cumate基因开关***考虑用于可诱导的CRISPR。相似***如Mullick等人，BMC Biotechnology 2006，6:43doi:10.1186/1472-6750-6-43中所述。诱导cumate***涉及细菌操纵子(cmt和cym)的调节机制，以使用三种不同策略调节哺乳动物细胞中的基因表达。在阻遏物配置中，调节通过阻遏物(CymR)与置于强组成型启动子下游的操纵子位点(CuO)的结合而介导。小分子cumate的添加解除阻遏。在反式激活物配置中，当与置于CMV最小启动子上游的CuO的多个拷贝结合时，通过CymR与VP16的激活结构域融合形成的嵌合反式激活物(cTA)蛋白质能够激活转录。Cumate添加取消DNA结合且因此取消由cTA的反式激活。本发明还考虑了反向cumate激活物(rcTA)，其在cumate的存在下而不是不存在下激活转录。CymR可以用作可逆地阻断来自强启动子例如CMV的表达的阻遏物。Cumate阻遏物/操纵子***的某些方面在美国专利号7745592中进一步描述。
考虑了其他诱导***，例如但不限于通过下述的调节：重金属[Mayo KE等人，Cell1982，29:99-108；Searle PF等人，Mol Cell Biol 1985，5:1480-1489和Brinster RL等人，Nature(London)1982，296:39-42]、类固醇激素[Hynes NE等人，Proc Natl Acad SciUSA 1981，78:2038-2042；Klock G等人，Nature(London)1987，329:734-736和Lee F等人，Nature(London)1981，294:228-232.]、热休克[Nouer L:Heat Shock Response.BocaRaton，FL:CRC；1991]和已开发的其他试剂[Mullick A，Massie B:Transcription，translation and the control of gene expression.In Encyclopedia of CellTechnology Edited by:Speir RE.Wiley；2000:1140-1164和Fussenegger M，.BiotechnolProg 2001，17:1-51]。然而，对于这些诱导型哺乳动物启动子存在局限性，例如“关闭”状态的“泄露”和诱导剂(热休克、重金属、糖皮质激素等)的多效性。昆虫激素(蜕皮激素)的使用已在降低哺乳动物细胞中的细胞过程干扰的尝试中提出[No D等人，Proc Natl Acad SciUSA 1996，93:3346-3351]。另一种优良***使用雷帕霉素作为诱导剂[Rivera VM等人，NatMed 1996，2:1028-1032]，但雷帕霉素作为免疫抑制剂的作用是其在体内的用途的主要局限性，并且因此需要发现用于控制基因表达的生物学惰性化合物[Saez E等人，Proc NatlAcad Sci USA 2000，97:14512-14517]。
本发明还包含编码本发明的多肽的核酸。核酸可以包含启动子，有利地人突触蛋白I启动子(hSyn)。在特别有利的实施方案中，核酸可以包装成腺相关病毒载体(AAV)。
本发明还考虑了重组载体和重组腺病毒，其可以包含来自超过一个腺病毒血清型的亚病毒颗粒。例如，已知腺病毒载体可以展示对于特定组织或细胞类型改变的向性(Havenga，M.J.E.等人，2002)，并且因此，来自不同腺病毒血清型的不同腺病毒衣壳即纤维或五邻体蛋白的混合和匹配可以是有利的。腺病毒衣壳包括纤维和五邻体的修饰可以导致具有不同于未经修饰的腺病毒的向性的腺病毒载体。在其感染靶细胞的能力方面进行修饰且优化的腺病毒载体可以允许在治疗或预防剂量中的显著降低，导致降低的局部和弥散性毒性。
病毒载体基因递送***通常用于基因转移和基因治疗应用中。不同病毒载体***具有其自身独特的优点和缺点。可以用于表达本发明的病原体衍生的配体的病毒载体包括但不限于下文更详细地描述的腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体、单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒载体。
腺病毒的另外一般特点是这样的，从而使得腺病毒的生物学详细表征；腺病毒与严重的人体病理学无关；腺病毒在将其DNA引入宿主细胞内非常有效；腺病毒可以感染广泛多样的细胞，并且具有广泛的宿主范围；腺病毒可以相对容易地大量产生；并且腺病毒可以通过病毒基因组的早期区域1(“E1”)中的缺失致使复制缺陷和/或非复制。
腺病毒是无包膜DNA病毒。腺病毒的基因组是大约36,000个碱基对(“bp”)的线性双链DNA分子，其中55-kDa末端蛋白质与每条链的5'末端共价结合。腺病毒DNA含有约100bp的相同的反向末端重复(“ITR”)，其确切长度取决于血清型。病毒的复制起点确切地位于基因组末端处的ITR内。DNA合成在两个阶段中发生。首先，复制通过链置换进行，生成子代双链体分子和亲本置换链。置换链是单链的，并且可以形成“锅柄样(panhandle)”中间体，其允许复制起始和生成子代双链体分子。可替代地，复制可以同时由基因组的两个末端进行，避免形成锅柄样结构的需求。
在生产性感染循环期间，病毒基因在两个时期内表达：其是直到病毒DNA复制的时期的早期，以及其与病毒DNA复制的起始同时的晚期。在早期过程中，仅表达由区域E1、E2、E3和E4编码的早期基因产物，其携带使细胞准备合成病毒结构蛋白质的许多功能(Berk，A.J.，1986)。在晚期过程中，表达晚期病毒基因产物加上早期基因产物，并且宿主细胞DNA和蛋白质合成关闭。因此，细胞变得专用于产生病毒DNA和病毒结构蛋白质(Tooze，J.，1981)。
腺病毒的E1区域是在靶细胞感染后表达的腺病毒的第一个区域。该区域由两个转录单位E1A和E1B基因组成，这两者均是原代(胚胎)啮齿类动物培养物的致癌性转化所需的。E1A基因产物的主要功能是诱导静止细胞进入细胞周期且重新开始细胞DNA合成，且转录激活病毒基因组的E1B基因和其他早期区域(E2、E3和E4)。用单独的E1A基因转染原代细胞可以诱导不受限制的增殖(永生化)，但不导致完全转化。然而，在大多数情况下，E1A的表达导致程序性细胞死亡(细胞凋亡)的诱导，并且仅偶然获得永生化(Jochemsen等人，1987)。E1B基因的共表达是阻止细胞凋亡的诱导和完全形态转化发生所需的。在建立的永生化细胞系中，高水平的E1A表达可以促使在不存在E1B的情况下的完全转化(Roberts，B.E.等人，1985)。
E1B编码的蛋白质帮助E1A重定向细胞功能以允许病毒复制。形成基本上定位于核中的复合物的E1B 55kD和E4 33kD蛋白质作用于抑制宿主蛋白质的合成且促进病毒基因的表达。它们的主要影响是与感染晚期的开始同时，建立病毒mRNA从核到细胞质的选择性转运。E1B 21kD蛋白质对于生产性感染周期的正确时间控制是重要的，从而阻止在病毒生命周期已完成前的宿主细胞的过早死亡。不能表达E1B 21kD基因产物的突变型病毒显示出缩短的感染周期，其伴随宿主细胞染色体DNA的过量降解(deg表型)和增强的致细胞病变(cyt表型；Telling等人，1994)。当另外E1A基因突变时，deg和cyt表型被抑制，指示这些表型是E1A的功能(White，E.等人，1988)。此外，E1B 21kDa蛋白质减慢E1A通过其开启其他病毒基因的速率。EIB 21kD通过何种机制猝灭这些E1A依赖性功能仍是未知的。
与例如逆转录病毒形成对比，腺病毒无法有效整合到宿主细胞的基因组内，能够感染非***细胞，并且能够在体内有效转移重组基因(Brody等人，1994)。这些特点使得腺病毒成为用于例如目的抗原或免疫原体内基因转移到有此需要的细胞、组织或对象内的有吸引力的候选物。
含有多重缺失的腺病毒载体是优选的，以增加载体的携带能力且降低重组生成有复制能力的腺病毒(RCA)的可能性。当腺病毒含有多重缺失时，不一定缺失各自(如果单独存在的话)导致复制缺陷型和/或非复制型腺病毒。只要缺失之一致使腺病毒复制缺陷或非复制，另外的缺失就可以包括用于其他目的，例如以增加腺病毒基因组关于异源核苷酸序列的携带能力。优选地，超过一个缺失阻止功能蛋白质的表达，且致使腺病毒复制缺陷和/或非复制和/或减毒。更优选地，所有缺失均为致使腺病毒复制缺陷和/或非复制和/或减毒的缺失。然而，本发明还包含有复制能力和/或野生型的腺病毒和腺病毒载体，即包含在对象中感染和复制所需的所有腺病毒基因。
采用腺病毒重组体的本发明的实施方案可以包括E1缺陷或缺失、或者E3缺陷或缺失、或者E4缺陷或缺失，或者包含E1和E3、或E1和E4、或E3和E4、或E1、E3和E4缺失的腺病毒载体，或其中所有病毒基因均缺失的“无肠(gutless)”腺病毒载体。腺病毒载体可以包含在E1、E3、或E4基因中的突变，或在这些或所有腺病毒基因中的缺失。E1突变产生载体的安全边际，因为E1缺陷型腺病毒突变株据说在非许可细胞中是复制缺陷和/或非复制的，并且至少是高度减毒的。E3突变通过破坏腺病毒藉以下调MHC I类分子的机制来增强抗原的免疫原性。E4突变通过抑制晚期基因表达来降低腺病毒载体的免疫原性，因此可以允许利用相同载体的重复再接种疫苗。本发明包含任何血清型或血清群的腺病毒载体，其在E1、或E3、或E4、或E1和E3、或E1和E4中缺失或突变。这些腺病毒基因的缺失或突变导致这些蛋白质活性的受损或基本上完全丧失。
“无肠”腺病毒载体是腺病毒载体家族中的另一类载体。它的复制需要辅助病毒以及表达E1a和Cre两者的专门的人293细胞系，这是在天然环境中不存在的条件；载体被剥夺所有病毒基因，因此作为疫苗携带者的载体是非免疫原性的，并且可以接种多次用于再接种疫苗。“无肠”腺病毒载体还含有36kb空间用于容纳一种或多种目的抗原或免疫原，因此允许将大量抗原或免疫原共递送到细胞内。
腺相关病毒(AAV)是对于人群体内源的单链DNA细小病毒。尽管能够在来自多个物种的细胞中生产性感染，但AAV是依赖病毒，需要来自腺病毒或疱疹病毒的辅助功能用于其自身复制。在不存在来自这些辅助病毒任一的辅助功能的情况下，AAV将感染细胞，在核中无衣壳，且将其基因组整合到宿主染色体内，但不复制或不产生新病毒颗粒。
AAV的基因组已克隆到细菌质粒内且是充分表征的。病毒基因组由4682个碱基组成，所述4682个碱基包括各145个碱基的两个末端重复。这些末端重复充当病毒的DNA复制起点。一些研究者也已提出它们具有增强子功能。基因组的剩余部分分成两个功能结构域。基因组的左侧部分编码rep功能，其调节病毒DNA复制和病毒基因表达。病毒基因组的右侧部分含有cap基因，其编码结构衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3。由rep和cap基因两者编码的蛋白质在生产性AAV复制期间反式起作用。
AAV视为用作转导载体的理想候选物，并且它已以这种方式使用。此类AAV转导载体包含足够的顺式作用功能，以在反式提供的腺病毒或辅助病毒辅助功能的存在下复制。重组AAV(rAAV)已在许多实验室中构建，并且已用于将外源基因携带到多种谱系的细胞内。在这些载体中，AAV cap和/或rep基因从病毒基因组中缺失，并且替换为选择的DNA区段。目前载体可以容纳高达4300个碱基的***DNA。
为了产生rAAV，含有所需病毒构建体的质粒转染到腺病毒感染的细胞内。另外，将第二辅助质粒共转染到这些细胞内，以提供AAV rep和cap基因，其对于重组病毒构建体的复制和包装是必须的。在这些条件下，AAV的rep和cap蛋白质反式作用，以刺激rAAV构建体的复制和包装。转染后三天，从细胞中收获rAAV连同腺病毒。污染腺病毒随后通过热处理灭活。
单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是有包膜的双链DNA病毒，具有编码超过80种基因的153kb基因组。它的广泛宿主范围是由于病毒包膜糖蛋白与在细胞膜中发现的细胞外硫酸肝素分子的结合(WuDunn&Spear，1989)。病毒的内在化随后需要包膜糖蛋白gD和成纤维细胞生长因子受体(Kaner，1990)。HSV能够裂解地感染细胞或可以建立潜伏期。HSV载体已用于感染广泛多样的细胞类型(Lowenstein，1994；Huard，1995；Miyanohara，1992；Liu，1996；Goya，1998)。
存在两类HSV载体，称为重组HSV载体和扩增子载体。重组HSV载体通过经由同源重组事件将转录单位直接***HSV基因组内生成。扩增子载体基于具有选择的转录单位、复制起点和包装信号的质粒。
HSV载体具有用于***外源基因的大容量、在神经元中建立潜伏期的能力、广泛宿主范围和对CNS赋予高达18个月的转基因表达的能力的明显优点(Carpenter&Stevens，1996)。
逆转录病毒是有包膜的单链RNA病毒，其已广泛用于基因转移方案中。逆转录病毒具有约7-10kb的二倍体基因组，由称为gag、pro、pol和env的四个基因区组成。这些基因区分别编码结构衣壳蛋白质、病毒蛋白酶、整合酶和病毒逆转录酶、以及包膜糖蛋白。基因组还具有在每个末端处的包装信号和顺式作用序列，称为长末端重复(LTR)，其在转录控制和整合中发挥作用。
最常使用的逆转录病毒载体基于莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)，并且取决于包膜糖蛋白的受体结合表面结构域，具有不同细胞向性。
重组逆转录病毒载体缺失所有逆转录病毒基因，其替换为标记或治疗基因或两者。为了繁殖重组逆转录病毒，需要提供反式的病毒基因gag、pol和env。
慢病毒是具有在有丝***和有丝***后细胞两者中感染且表达其基因的能力的复杂逆转录病毒。最通常已知的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，其使用其他病毒的包膜糖蛋白以靶向广泛范围的细胞类型。
甲病毒包括原型辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)，构成含有在二十面体衣壳内的正链RNA基因组的一组有包膜病毒。
本发明的病毒载体用于将表达抗原或免疫原的核酸在体外和体内递送至细胞。特别地，本发明的载体可以有利地用于将核酸递送或转移至细胞，更优选哺乳动物细胞。目的核酸包括编码肽和蛋白质，优选治疗(例如用于医学或兽医学用途)或免疫原性(例如用于疫苗)肽或蛋白质的核酸。
优选地，编码目的抗原或免疫原的密码子是“优化的”密码子，即密码子是在对象的物种中例如高度表达的基因中频繁出现的那些，而不是由例如流感病毒频繁使用的那些密码子。此类密码子使用提供用于抗原或免疫原在动物细胞中的有效表达。在其他实施方案中，例如，当目的抗原或免疫原在细菌、酵母或另一种表达***中表达时，密码子使用模式改变以代表在其中待表达抗原或免疫原的生物中高度表达基因的密码子偏好。关于许多物种的高度表达基因的密码子使用模式在文献中是已知的(例如Nakamura等人，1996；Wang等人，1998；McEwan等人1998)。
作为进一步的替代方案，病毒载体可以用于感染培养中的细胞，以表达所需基因产物，例如产生目的蛋白质或肽。优选地，蛋白质或肽分泌到培养基内，并且可以使用本领域已知的常规技术由其纯化。指导蛋白质的细胞外分泌的信号肽序列是本领域已知的，并且通过本领域已知的常规技术，编码其的核苷酸序列可以与编码目的肽或蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。可替代地，细胞可以被裂解，并且表达的重组蛋白质可以从细胞裂解产物中纯化。优选地，细胞是动物细胞，更优选哺乳动物细胞。还优选的是有能力通过特定目的病毒载体转导的细胞。此类细胞包括PER.C6细胞、911细胞和HEK293细胞。
用于培养宿主细胞的培养基包括常用于组织培养的培养基，例如尤其是M199-earle base、Eagle MEM(E-MEM)、Dulbecco MEM(DMEM)、SC-UCM102、UP-SFM(GIBCO BRL)、EX-CELL302(Nichirei)、EX-CELL293-S(Nichirei)、TFBM-01(Nichirei)、ASF104。用于特异性细胞类型的合适培养基可以见于美国典型培养物中心(ATCC)或欧洲细胞培养物收藏中心(European Collection of Cell Cultures)(ECACC)。培养基可以补充有氨基酸例如L-谷氨酰胺、盐、抗真菌剂或抗菌剂例如青霉素-链霉素、动物血清等。细胞培养基可以任选是无血清的。
本发明还涉及能够表达或过表达LITE或在本发明中有用的至少一种试剂的细胞系或转基因动物。优选地，细胞系或动物表达或过表达一种或多种LITE。
转基因动物通常为脊椎动物，更优选啮齿类动物例如大鼠或小鼠，还包括其他哺乳动物例如人、山羊、猪或牛等。
此类转基因动物用作疾病的动物模型且用于新的有用化合物的筛选测定中。通过特异性表达如上定义的一种或多种多肽，可以研究此类多肽对疾病发展的作用。此外，治疗包括基因治疗和多种药物可以对转基因动物进行测试。用于产生转基因动物的方法是本领域已知的。例如，存在将基因引入胚胎内的几种可能途径。这些包括(i)胚胎干细胞的直接转染或逆转录病毒感染，随后将这些细胞引入处于发育的胚泡期的胚胎内；(ii)早期胚胎的逆转录病毒感染；和(iii)DNA直接显微注射到接合子或早期胚胎细胞内。基因和/或转基因还可以包括本领域已知的遗传调节元件和/或结构元件。用于转基因引入的一类靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞可以得自在体外培养的植入前胚胎且与胚胎融合(Evans等人，1981，Nature 292:154-156；Bradley等人，1984，Nature 309:255-258；Gossler等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065-9069；和Robertson等人，1986Nature 322:445-448)。转基因可以通过多种标准技术有效引入ES细胞内，所述有效技术例如DNA转染、显微注射或逆转录病毒介导的转导。所得的经转化的ES细胞其后可以与来自非人动物的胚泡组合。引入的ES细胞其后定殖胚胎且促成所得到的嵌合动物的种系(Jaenisch，1988，Science 240:1468-1474)。
LITE还可以提供在体内有价值的时间精确度。LITE可以用于改变在特定发育阶段期间的基因表达，例如通过仅在秀丽隐杆线虫(C elegans)生长的特定阶段期间阻遏特定细胞凋亡基因。LITE可以用于将遗传线索定时至特定实验窗。例如，牵涉学习的基因可以仅在完整的啮齿类动物或灵长类动物脑的精确区域中在学习刺激期间过表达或阻遏。进一步地，LITE可以用于诱导仅在疾病发展的特定阶段期间的基因表达变化。例如，癌基因可以仅在肿瘤达到特定大小或转移阶段后过表达。相反，在阿尔茨海默氏病发展中可疑的蛋白质可以仅在动物生命的限定时间点且在特定脑区内敲低。尽管这些例子并未详尽地列出LITE***的潜在应用，但它们突出显示其中LITE可以是有力技术的一些领域。
本发明的治疗或诊断组合物以足以治疗或诊断病症的量施用于个体。有效量可以根据多种因素例如个体的状况、重量、性别和年龄而改变。其他因素包括施用模式。
药物组合物可以通过多种途径例如皮下、局部、经口和肌内提供给个体。
根据本文公开的方法鉴定的化合物可以以适当剂量单独使用。可替代地，其他试剂的共施用或序贯施用可以是希望的。
本发明还具有提供合适的局部、经口、全身和肠胃外药物制剂用于本发明的新型治疗方法的目的。含有根据本发明鉴定的化合物作为活性成分的组合物可以以广泛多样的治疗剂型在用于施用的常规媒介物中施用。例如，化合物可以以此类经口例如片剂、胶囊(各自包括定时释放和持续释放制剂)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和乳状液，或通过注射施用。同样地，它们还可以以静脉内(推注和输注)、腹膜内、皮下、具有或不具有阻塞的局部、或肌内形式施用，全部使用药学领域普通技术人员众所周知的形式。
有利地，本发明的化合物可以以单个日剂量施用，或日总剂量可以以每天两、三或四次的分份剂量施用。此外，用于本发明的化合物可以以鼻内形式经由合适鼻内媒介物的局部使用，或经由经皮途径，使用本领域普通技术人员众所周知的那些经皮皮肤贴剂形式施用。为了以经皮递送***的形式施用，剂量施用在剂量方案自始至终当然将是连续的而不是间断的。
对于其中活性剂在分开的剂量制剂中的具有超过一种活性剂的组合治疗，活性剂可以同时施用，或它们各自可以在分别错开的时间施用。
利用本发明的化合物的剂量方案依照多种因素加以选择，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、重量、性别和医学状况；待治疗状况的严重性；施用途径；一个患者的肾、肝和心血管功能；以及采用的其具体化合物。普通技术人员可以容易地决定且开出所需的药物有效量，以预防、对抗(counter)或停止状况的进展。在实现获得功效而无毒性的范围内的药物浓度中的优化精确度需要基于药物对靶部位的可用性的动力学的方案。这涉及药物分布、平衡和消除的考虑。
尽管本发明及其优点已详细描述，但应当理解可以在本文中制备多种变化、置换和改变，而不背离如所附权利要求中限定的本发明的精神和范围。
本发明进一步在下述实施例中举例说明，所述实施例仅给出作为举例说明目的且不预期以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
直接调控来自内源哺乳动物基因组的基因表达的能力对于阐明正常基因功能和疾病机制是关键的。进一步完善细胞群体内的基因表达的空间和时间控制的进展具有扩展基因调控效用的潜力。申请人先前开发了来自水稻黄单胞菌(Xanthamonas oryze)的转录激活物样效应物(TALE)，以允许快速设计且构建位点特异性DNA结合蛋白。申请人开发了一组分子工具，用于允许在内源哺乳动物基因组中的光调节的基因表达。该***由与来自拟南芥的光敏二聚化蛋白质结构域连接的经改造的人工转录因子组成。该***响应在450nm-500nm范围内的光，并且能够在哺乳动物细胞中用以6.2mW/cm2强度的光刺激后，诱导多潜能因子的表达中的显著增加。申请人开发用于靶向广泛范围基因的工具。申请人认为用于光介导的基因表达控制的工具箱补充现有光遗传学方法，并且在未来可以进一步帮助阐明特异性基因在脑中的时机、细胞类型和浓度依赖性作用。
直接调控来自内源哺乳动物基因组的基因表达的能力对于阐明正常基因功能和疾病机制是关键的。申请人呈现一组分子工具的开发，为了能够在内源哺乳动物基因组中的光调节的基因表达。该***由下述组成：与来自拟南芥的光敏二聚化蛋白质结构域隐花色素2(CRY2)和CIB1结合的转录激活物样效应物(TALE)和激活结构域VP64。申请人显示用设计为靶向KLF4和Neurog2的启动子区的这些LITE构建体转染的HEK293FT和Neuro-2a细胞的蓝光刺激导致靶表达中的显著增加，证实基于TALE的光学基因表达调控技术的功能性。
图1显示描述关于空间和时间精确度的需要的示意图。
图2显示转录激活物样效应物(TALE)。TALE由在其序列核心处的34aa重复组成。每个重复对应于由TALE结合的靶DNA中的碱基。重复仅相差在位置12和13处的2个可变氨基酸。该对应的编码已得到阐明(Boch，J等人，Science，2009和Moscou，M等人，Science，2009)，并且显示于该图中。申请人开发了用于合成设计者TALE的方法，所述TALE掺入该编码且能够结合在基因组内的选择序列(Zhang，F等人，Nature Biotechnology，2011)。
图3描述LITE的设计：TALE/隐花色素转录激活。每种LITE是两组分***，其可以包含融合至CRY2的TALE和融合至VP64(转录激活物)的隐花色素结合配偶体CIB1。在失活状态，TALE使其融合的CRY2结构域定位至目的基因的启动子区。在这点上，CIB1不能结合CRY2，在核空间中留下未结合的CIB1-VP64。在用488nm(蓝)光刺激后，CRY2经历构象变化，揭示其CIB1结合位点(Liu，H等人，Science，2008)。CIB1的快速结合导致融合的VP64结构域的召募，其诱导靶基因的转录。
图4描述隐花色素二聚体截短对LITE活性的作用。已知改变CRY2和CIB1活性的截短()针对全长蛋白质进行比较。对于每种结构域组合，靶向Neurog2的启动子的LITE在Neuro-2a细胞中进行测试。在用488nm光刺激后，对于刺激或未受刺激的样品，使用qPCR定量Neurog2的转录水平。
图5描述KLF4 LITE的光强度依赖性应答。
图6描述Neurog2 LITE的激活动力学和Neurog2 LITE失活动力学。
实施例2
正常基因表达是具有精心安排的时间和空间组分的动态过程，其精确度是生物的正常发育、稳态和进展所需的。依次地，通过增加、减少或改变一种基因或一组基因的功能的所需基因表达模式失调已与广泛多样的病理状态联系。能够以空间与时间精确方式调控基因表达的技术允许阐明负责正常生物过程和疾病机制的遗传线索。为了解决该技术需要，申请人开发了光诱导的转录效应物(LITE)，其提供了光介导的内源基因表达控制。
诱导基因表达***通常已设计为允许化学诱导的***的开放读码框或shRNA序列的激活，分别导致基因过表达或阻遏。使用开放读码框用于过表达的缺点包括基因大小的剪接变化和限制的丧失。尽管其在人类生物学中的变革力量，经由RNA干扰的基因阻遏可以被复杂的脱靶效应阻碍。某些诱导***包括基于***、蜕皮激素和FKBP12/FRAP的***已知激活脱靶内源基因。长期抗生素治疗的潜在有害作用可以使基于四环素反式激活物(TET)的***的使用复杂化。在体内，这些化学诱导***的时间精确度取决于诱导剂摄取和消除的动力学。进一步地，因为诱导剂一般是全身递送的，所以此类***的空间精确度受外源载体递送的精确度约束。
响应这些局限性，LITE设计为以时间和空间精确方式调控个别内源基因的表达。每种LITE是由下述组成的两组分***：定制的DNA结合转录激活物样效应物(TALE)蛋白质、来自拟南芥的光应答性隐花色素异源二聚体、以及转录激活/阻遏结构域。TALE设计为与目的基因的启动子序列结合。TALE蛋白质融合至隐花色素异源二聚体的一半(隐花色素-2或CIB1)，而剩余隐花色素配偶体融合至转录效应物结构域。效应物结构域可以是激活物，例如VP16、VP64或p65，或者阻遏物例如KRAB、EnR或SID。在LITE的未受刺激状态，TALE-隐花色素2蛋白质定位至目的基因的启动子，但不与CIB1-效应物蛋白质结合。在用蓝光谱光刺激LITE后，隐花色素-2变得激活，经历构象变化，并且揭示其结合结构域。CIB1依次又与隐花色素-2结合，导致效应物结构域定位至目的基因的启动子区且起始基因过表达或沉默。
LITE中的基因靶向经由定制的TALE DNA结合蛋白的特异性来实现。选择目的基因的启动子区中的靶序列，并且设计对该序列定制的TALE。TALE的关键部分由长度34个氨基酸的串联重复组成。尽管这些重复的序列是几乎相同的，但每种重复的第12和13个氨基酸(称为重复可变双残基)不同，决定每种重复的核苷酸结合特异性。因此，通过合成具有TALE单体重复的适当排序的构建体，制备对靶启动子序列特异性的DNA结合蛋白。
LITE的光应答性经由隐花色素-2和CIB1的激活和结合来实现。如上所述，蓝光刺激诱导隐花色素-2中的激活构象变化，导致其结合配偶体CIB1的召募。该结合是快速和可逆的，在脉冲刺激后<15秒内实现饱和，并且在刺激结束后<15分钟回到基线。这些快速结合动力学导致LITE***仅暂时束缚于转录/翻译和转录物/蛋白质降解的速度，而不是诱导剂的摄取和清除。隐花色素-2激活也是高度敏感的，允许使用低光强度刺激和减轻光毒性的危险。进一步地，在例如完整哺乳动物脑的背景下，可见光强度可以用于控制LITE刺激区域的大小，允许可以提供比单独的载体递送更大的精确度。
LITE***的模块性允许任何数目的效应物结构域用于转录调控。因此，激活物和阻遏物结构域可以基于物种、强度、机制、持续时间、尺寸或任何数目的其他参数加以选择。
申请人接下来呈现LITE***的两种原型表现。第一个例子是设计为激活小鼠基因NEUROG2的转录的LITE。选择位于小鼠NEUROG2的上游启动子区中的序列TGAATGATGATAATACGA作为靶，并且设计且合成TALE以匹配该序列。TALE序列经由核定位信号(氨基酸：SPKKKRKVEAS)与隐花色素-2的序列连接，以促进蛋白质从细胞溶质到核空间的转运。合成第二载体，其包含使用相同的核定位信号与转录激活物结构域VP64连接的CIB1结构域。该第二载体，也是GFP序列，通过2A翻译跳过信号与CIB1-VP64融合序列分开。每种构建体的表达由遍在的组成型启动子(CMV或EF1-α)驱动。用两种载体共转染来自Neuro 2A细胞系的小鼠成神经瘤细胞。在温育以允许载体表达后，通过来自488nm LED阵列的周期脉冲的蓝光刺激样品。未受刺激的共转染的样品和仅用荧光报道分子YFP转染的样品用作对照。在每次实验结束时，从经由qPCR分析的样品中纯化mRNA。
截短形式的隐花色素-2和CIB1与全长形式的隐花色素-2和CIB1组合克隆且测试，以便测定每个异源二聚体对的有效性。由隐花色素-2蛋白质的保守光响应区组成的CRY2PHR结构域和全长形式的CIB1的组合导致最高的Neurog2 mRNA水平上调(超过YFP样品～22倍和超过未受刺激的共转染样品～7倍)。全长隐花色素-2(CRY2)与全长CIB1的组合导致更低的绝对激活水平(超过YFP～4.6倍)，以及更低的基线激活(对于未受刺激的共转染的样品，超过YFP～1.6倍)。这些隐花色素蛋白质配对可以选择用于特定用途，取决于所需的绝对诱导水平和使LITE***的基线“泄露”降到最低的必要性。
激活和可逆性的速度是LITE***的关键设计参数。为了表征LITE***的动力学，测试由Neurog2 TALE-CRY2PHR和CIB1-VP64形式的***组成的构建体，以测定其激活和失活速度。在提取前将样品刺激少至0.5小时至长达24小时。在最短的0.5小时时间点观察到Neurog2表达的上调(相对于YFP样品～5倍)。Neurog2表达在12小时刺激时达到峰值(相对于YFP样品～19倍)。通过将共转染的样品刺激6小时分析失活动力学，在所述时间停止刺激，并且将样品保留在培养中0至12小时，以允许mRNA降解。Neurog2 mRNA水平在刺激结束后0.5小时达到峰值(相对于YFP样品～16倍)，这之后水平降解，在到12小时回到接近基线水平之前具有～3小时半衰期。
第二种原型例子是设计为激活人基因KLF4的转录的LITE。选择位于人KLF4的上游启动子区中的序列TTCTTACTTATAAC作为靶，并且设计且合成TALE，以匹配该序列。TALE序列经由核定位信号(氨基酸：SPKKKRKVEAS)与CRY2PHR的序列连接。上文描述的相同CIB1-VP64激活物蛋白质也用于LITE***的这种体现中。用两种载体共转染来自HEK293FT细胞系的人胚胎肾细胞。在温育以允许载体表达后，通过来自488nm LED阵列的周期脉冲的蓝光刺激样品。未受刺激的共转染的样品和仅用荧光报道分子YFP转染的样品用作对照。在每次实验结束时，从经由qPCR分析的样品中纯化mRNA。
通过用增加的光功率(0-9mW/cm2)刺激样品来测试LITE***的光强度应答。对于低至0.2mW/cm2的刺激观察到KLF4 mRNA水平的上调。KLF4上调在5mW/cm2时变得饱和(相对于YFP样品2.3倍)。还对于高达9mW/cm2的功率执行细胞活力测试，并且显示>98％细胞活力。类似地，测试对不同刺激工作循环的KLF4 LITE应答(1.6-100％)。在不同工作循环之间未观察到KLF4激活中的差异，指示每15秒低至0.25秒的刺激范式应导致最大限度激活。
存在LITE对于其代表基因表达控制的有利选择的潜在应用。存在LITE对于其特别有吸引力的许多体外应用。在所有这些情况下，LITE具有诱导内源基因表达的优点，伴随正确剪接变体表达的潜力。
因为LITE激活是经由掩蔽或光栅化的激光扫描产生的光诱导的、空间限定的光模式，所以可以用于改变局限性细胞亚群中的表达水平。例如，通过使细胞内信号转导分子仅在空间约束的细胞集合中过表达或沉默，相对于其与刺激位点的距离的附近细胞应答可以帮助阐明细胞非自主过程的空间特征。另外，在细胞重编程生物学中的近期进展已显示转录因子集合的过表达可以用于将一个细胞类型例如成纤维细胞转化成另一个细胞类型例如神经元或心肌细胞。进一步地，细胞类型在组织内的正确空间分布对于适当的器官型功能是关键的。使用LITE过表达重编程因子可以用于以空间精确方式重编程多重细胞谱系用于组织改造应用。
LITE的快速转录应答和内源靶向制备用于研究转录动态的理想***。例如，LITE可以用于研究在诱导靶基因表达后mRNA剪接变体产生的动力学。在转录周期的另一个末端，通常响应促使过多基因中的表达水平变化的强细胞外刺激执行mRNA降解研究。LITE可以用于可逆地诱导内源靶的转录，这之后可以停止刺激并且可以跟踪独特靶的降解动力学。
LITE的精确度可以为时间遗传调节提供与实验干预一致的动力。例如，在长时程增强(LTP)中具有可疑牵涉的靶可以在器官型或解剖的神经元培养物中调控，但仅在刺激期间调控以诱导LTP，以便避免干扰细胞的正常发育。类似地，在显示出疾病表型的细胞模型中，怀疑涉及特定疗法的有效性的靶可以仅在治疗期间得到调控。相反，遗传靶可以仅在病理刺激期间得到调控。其中遗传线索对外部实验刺激的定时具有相关性的任何数目的实验可以潜在获益于LITE调控的使用。
体内背景提供使用LITE控制基因表达的同等丰富的机会。如上所述，光诱导性提供了先前无法达到的空间精确度的潜力。利用光极技术的发展，刺激光纤导线可以置于精确的脑区中。刺激区域大小随后可以通过光强度调谐。这可以与LITE的递送结合完成，经由病毒载体，或如果转基因LITE动物是可获得的，则可以消除病毒的使用，同时仍允许调控精确脑区中的基因表达。LITE可以用于透明生物例如固定的斑马鱼中，以允许非常精确的激光诱导的局部基因表达变化。
LITE还可以提供在体内有价值的时间精确度。LITE可以用于改变在特定发育阶段期间的基因表达，例如通过仅在秀丽隐杆线虫(C elegans)生长的特定阶段期间阻遏特定细胞凋亡基因。LITE可以用于将遗传线索定时至特定实验窗。例如，牵涉学习的基因可以仅在完整的啮齿类动物或灵长类动物脑的精确区域中在学习刺激期间过表达或阻遏。进一步地，LITE可以用于诱导仅在疾病发展的特定阶段期间的基因表达变化。例如，癌基因可以仅在肿瘤达到特定大小或转移阶段后过表达。相反，在阿尔茨海默氏病发展中可疑的蛋白质可以仅在动物生命的限定时间点且在特定脑区内敲低。尽管这些例子并未详尽地列出LITE***的潜在应用，但它们突出显示其中LITE可以是有力技术的一些领域。
实施例3
哺乳动物TALE转录阻遏物的开发
申请人开发了哺乳动物TALE阻遏物体系结构，以允许研究者抑制内源基因的转录。TALE阻遏物具有抑制基因以及非编码转录物例如微小RNA表达的潜力，致使它们成为用于测试特异性遗传元件的原因作用的高度希望工具。为了鉴定用于与TALE一起在哺乳动物细胞中使用的合适阻遏结构域，靶向人SOX2基因的启动子的TALE用于评估候选阻遏结构域集合的转录阻遏活性(图12a)。选择跨越一系列真核宿主物种的阻遏结构域，以增加发现有效的合成阻遏物的机会，所述阻遏结构域包括来自秀丽隐杆线虫的PIE-1阻遏结构域(PIE-1)(Batchelder，C.等人Transcriptional repression by the Caenorhabditis elegansgerm-line protein PIE-1.Genes Dev.13，202-212(1999))，来自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的在Ubx基因内的QA结构域(Ubx-QA)(Tour，E.，Hittinger，C.T.&McGinnis，W.Evolutionarily conserved domains required for activation and repressionfunctions of the Drosophila Hox protein Ultrabithorax.Development 132，5271-5281(2005))，来自拟南芥的IAA28阻遏结构域(IAA28-RD)(4)，mSin相互作用结构域(SID)(Ayer，D.E.，Laherty，C.D.，Lawrence，Q.A.，Armstrong，A.P.&Eisenman，R.N.Madproteins contain a dominant transcription repression domain.Mol.Cell.Biol.16，5772-5781(1996))，Tbx3阻遏结构域(Tbx3-RD)，以及来自智人(Homo Sapiens)的Krüppel结合框(KRAB)(Margolin，J.F.等人Kruppel-associated boxes are potenttranscriptional repression domains.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 91，4509-4513(1994))阻遏结构域。因为不同的KRAB截短已知显示出不同水平的转录阻遏(Margolin，J.F.等人Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repressiondomains.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 91，4509-4513(1994))，所以测试三种不同的KRAB截短(图12c)。这些候选TALE阻遏物在HEK 293FT细胞中表达，并且发现携带下述两种广泛使用的哺乳动物转录阻遏结构域的TALE能够阻遏内源SOX2表达：SID(Ayer，D.E.，Laherty，C.D.，Lawrence，Q.A.，Armstrong，A.P.&Eisenman，R.N.Mad proteins contain adominant transcription repression domain.Mol.Cell.Biol.16，5772-5781(1996))和KRAB(Margolin，J.F.等人Kruppel-associated boxes are potent transcriptionalrepression domains.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 91，4509-4513(1994))结构域，而其他结构域对转录活性具有很少的作用(图12c)。为了控制由于TALE结合的SOX2转录的潜在干扰，没有任何效应物结构域，靶向SOX2的TALE DNA结合结构域单独的表达对SOX2的转录活性没有作用(类似于模拟或GFP的表达)(图12c，空条件)。因为SID结构域能够实现比KRAB结构域多26％的内源SOX2基因座的转录阻遏(图12c)，所以决定使用SID结构域用于后续研究。
为了进一步测试SID阻遏物结构域用于下调内源转录的有效性，将SID与来自先前实验的CACNA1C-靶TALE组合(图12d)。使用qRT-PCR，发现用SID替换CACNA1C靶向TALE上的VP64结构域能够阻遏CACNA1C转录。含NH的TALE阻遏物能够实现与含NN的TALE相似水平的转录阻遏(～4倍阻遏)，而使用NK的TALE阻遏物明显更少活性(～2倍阻遏)(图12d)。这些数据证实SID事实上是合适的阻遏结构域，同时还进一步支持NH作为比NK更合适的G靶向RVD。
TALE可以容易地定制为识别内源基因组上的特异性序列。此处，进行一系列筛选以解决TALE工具箱的两个重要局限性。总之，具有不妥协的活性强度以及强TALE阻遏物体系结构的更严格的G特异性RVD的鉴定进一步扩展TALE用于探测哺乳动物转录和基因组功能的效用。
在将SID(mSin相互作用结构域)鉴定为待与TALE一起使用的强大的新型阻遏物结构域后，进一步设计且验证用于与TALE一起在哺乳动物细胞中使用的基于SID结构域的更活跃的阻遏结构域体系结构。该结构域称为SID4X，其是由短接头连接的四个SID结构域的串联重复。为了测试不同的TALE阻遏物体系结构，靶向小鼠(小家鼠)p11(s100a10)基因的启动子的TALE用于评估一系列候选TALE阻遏物体系结构的转录阻遏活性(图13a)。因为不同的TALE截短已知显示出不同水平的转录激活活性，所以测试融合至SID或SID4X结构域的两种不同的TALE截短，一种形式具有侧接DNA结合串联重复的在N和C末端处的136和183个氨基酸，而另一种保留在N和C末端处的240和183个氨基酸(图13b，c)。候选TALE阻遏物在小鼠Neuro2A细胞中表达，并且发现携带SID和SID4X结构域两者的TALE能够使内源p11表达阻遏高达4.8倍，而编码GFP的阴性对照构建体对靶基因的转录没有作用(图13b，c)。为了控制由于TALE结合的p11转录的潜在干扰，如果没有任何效应物结构域，靶向p11的TALE DNA结合结构域的表达(具有与测试的构建体相同的N和C末端截短)对内源p11的转录活性没有作用(图13b，c，空构建体)。
因为具有SID4X结构域的构建体能够实现比依赖TALE DNA结合结构域的截短的SID结构域多167％和66％的内源p11基因座的转录阻遏(图13c)，所以得出结论融合至SID4X结构域，在N和C末端分别具有136和183个氨基酸的截短的TALE DNA结合结构域是有力的TALE阻遏物体系结构，其允许下调靶基因表达且比采用SID结构域的先前设计更活跃。
mSin相互作用结构域(SID)和SID4X结构域对于哺乳动物表达进行密码子优化，且与侧翼NheI和XbaI限制位点(Genscript)一起合成。TALE DNA结合结构域的截短变体是PCR扩增的，且使用NheI和XbaI限制位点融合至SID或SID4X结构域。为了控制由于TALE结合对转录的任何作用，构建使用PCR克隆携带单独的TALE DNA结合结构域的表达载体。所有构建体的编码区均使用Sanger测序完全验证。两种不同类型的TALE体系结构的比较在图14中可见。
实施例4
哺乳动物TALE转录激活物和核酸酶的开发
定制的TALE可以用于广泛多样的基因组改造应用，包括转录调控和基因组编辑。此处，申请人描述了使用分层连接操作，用于快速构建定制的TALE转录因子(TALE-TF)和核酸酶(TALEN)的工具箱。该工具箱促进在1周内能承受和快速构建定制的TALE-TF和TALEN，并且可以容易地按比例扩大以平行构建用于多重靶的TALE。申请人还提供了使用定量逆转录PCR和Surveyor核酸酶，分别用于在哺乳动物细胞中测试定制TALE-TF和TALEN的活性的细节。TALE工具箱允许广泛范围的生物应用。
TALE是由黄单胞菌属物种使用，以调控宿主植物中的基因转录，以促进细菌定殖的天然细菌效应物(Boch，J.&Bonas，U.Xanthomonas AvrBs3 family-type IIIeffectors:discovery and function.Annu.Rev.Phytopathol.48，419–436(2010)和Bogdanove，A.J.，Schornack，S.&Lahaye，T.TAL effectors:finding plant genes fordisease and defense.Curr.Opin.Plant Biol.13，394–401(2010))。蛋白质的关键区域含有DNA识别和结合所需的34-aa序列(称为单体)的串联重复(Romer，P.等人Plant pathogenrecognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistancegene.Science 318，645–648(2007)；Kay，S.，Hahn，S.，Marois，E.，Hause，G.&Bonas，U.Abacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cellsize regulator.Science 318，648–651(2007)；Kay，S.，Hahn，S.，Marois，E.，Wieduwild，R.&Bonas，U.Detailed analysis of the DNA recognition motifs of the Xanthomonastype III effectors AvrBs3 and AvrBs3Deltarep16.Plant J.59，859–871(2009)和Romer，P.等人Recognition of AvrBs3-like proteins is mediated by specificbinding to promoters of matching pepper Bs3 alleles.Plant Physiol.150，1697–1712(2009).)(图8)。已发现天然存在的TALE具有范围为1.5-33.5的可变数目的单体(Boch，J.&Bonas，U.Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors:discovery andfunction.Annu.Rev.Phytopathol.48，419–436(2010))。尽管每个单体的序列是高度保守的，但它们主要在称为重复可变双残基的两个位置(第12和13个位置)中不同。近期报道已发现这两个残基的身份决定每个TALE重复的核苷酸结合特异性，并且简单密码指定每个RVD的靶碱基(NI＝A、HD＝C、NG＝T、NN＝G或A)(Boch，J.等人Breaking the code of DNAbinding specificity of TAL-type III effectors.Science 326，1509–1512(2009)和Moscou，M.J.&Bogdanove，A.J.A simple cipher governs DNA recognition by TALeffectors.Science 326，1501(2009))。因此，每个单体靶向一种核苷酸，并且TALE中的单体的线性序列指定以5′至3′方向的靶DNA序列。在植物基因组内的天然TALE结合位点始终以胸腺嘧啶开始(Boch，J.等人Breaking the code of DNA binding specificity ofTAL-type III effectors.Science326，1509–1512(2009)和Moscou，M.J.&Bogdanove，A.J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science 326，1501(2009))，所述胸腺嘧啶推测由TALE的非重复N末端内的隐藏信号指定。串联重复DNA结合结构域始终以半长度重复(0.5重复，图8)结束。因此，待靶向的DNA序列的长度等于完全重复单体的数目加上二。
在植物中，病原体通常是宿主特异性的。例如，尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporum f.sp.lycopersici)导致番茄枯萎，但仅攻击番茄，并且尖孢镰刀菌小麦专化型(F.oxysporum f.dianthii Puccinia graminis f.sp.tritici)仅攻击小麦。植物具有现有和诱导的防御以抵抗大多数病原体。跨越植物世代的突变和重组事件导致产生敏感性的遗传变异性，尤其当病原体比植物更频繁复制时。在植物中可以存在非宿主抗性，例如，宿主和病原体是不相容的。还可以存在水平抗性，例如针对病原体的所有种族的部分抗性，通常受许多基因控制，和垂直抗性，例如对病原体的一些种族而不是其他种族的完全抗性，通常受少数基因控制。在基因对基因水平上，植物和病原体一起进化，并且一个平衡中的遗传变化改变另一个。相应地，使用天然变异性，育种者组合大多数有用的基因用于得率、质量、均匀性、硬度、抗性。抗性基因的来源包括天然或外来变种、原生变种、野生植物亲属和诱导的突变，例如用诱变剂处理植物材料。使用本发明，植物育种者提供诱导突变的新工具。相应地，本领域技术人员可以分析抗性基因的来源的基因组，并且在具有所需特征或性状的变种采用本发明以诱导抗性基因的产生，具有比先前的诱变剂更多的精确度并且因此加速且改善植物育种计划。
申请人已进一步改善TALE装配***，伴随少数优化，包括使连接衔接子的不同性达到最大，以使错误连接降到最低，并且将分开的消化和连接步骤组合到单个黄金门(Golden Gate)(Engler，C.，Kandzia，R.&Marillonnet，S.A one pot，one step，precisioncloning method with high throughput capability.PLoS ONE 3，e3647(2008)；Engler，C.，Gruetzner，R.，Kandzia，R.&Marillonnet，S.Golden gate shuffling:a one-pot DNAshuffling method based on type IIs restriction enzymes.PLoS ONE 4，e5553(2009)和Weber，E.，Engler，C.，Gruetzner，R.，Werner，S.&Marillonnet，S.A modular cloningsystem for standardized assembly of multigene constructs.PLoS ONE 6，e16765(2011))反应内。简言之，用连接衔接子扩增每个核苷酸特异性单体序列，所述连接衔接子专门指定在TALE串联重复内的单***置。一旦产生该单体文库，它就可以方便地再用于许多TALE的装配。对于需要的每个TALE，适当单体首先连接成六聚体，其随后经由PCR扩增。随后，与适当的TALE克隆主链的第二黄金门消化连接(图8)获得完全装配的序列特异性TALE。主链含有侧面为TALE N和C末端的ccdB负选择盒，当TALE已成功构建时，所述ccdB负选择盒替换为串联重复DNA结合结构域。ccdB针对用空主链转化的细胞选择，从而获得具有***的串联重复的克隆(Cermak，T.等人Efficient design and assembly of custom TALEN andother TAL effector-based constructs for DNA targeting.Nucleic Acids Res.39，e82(2011))。
单体DNA结合结构域的装配可以***适当的TALE-TF或TALEN克隆主链内，以构建定制的TALE-TF和TALEN。通过用合成转录激活结构域VP64替换TALE C末端内的天然激活结构域来构建TALE-TF(Zhang，F.等人Efficient construction of sequence-specific TALeffectors for modulating mammalian transcription.Nat.Biotechnol.29，149–153(2011)；图8)。通过靶向转录起始位点上游的结合位点，TALE-TF以位点特异性方式召募转录复合物且起始基因转录。通过使TALE DNA结合结构域(Miller，J.C.等人A TALEnuclease architecture for efficient genome editing.Nat.Biotechnol.29，143–148(2011))的C末端截短(+63aa)与非特异性FokI核酸内切酶催化结构域融合来构建TALEN(图14)。+63-aa C末端截短也已显示充当足以转录调控的最低限度C末端(Zhang，F.等人Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulatingmammalian transcription.Nat.Biotechnol.29，149–153(2011))。TALEN通过与分开～17个碱基的两个靶序列结合而形成二聚体。在结合位点对之间，FokI催化结构域二聚化且通过引入双链断裂(DSB；图8)充当分子剪刀。通常，DSB通过非同源末端连接(Huertas，P.DNAresection in eukaryotes:deciding how to fix the break.Nat.Struct.Mol.Biol.17，11–16(2010))途径(NHEJ)进行修复，导致小缺失和功能基因敲除。可替代地，TALEN介导的DSB可以刺激同源重组，允许外源供体DNA模板的位点特异性***(Miller，J.C.等人A TALEnuclease architecture for efficient genome editing.Nat.Biotechnol.29，143–148(2011)和Hockemeyer，D.等人Genetic engineering of human pluripotent cells usingTALE nucleases.Nat.Biotechnol.29，731–734(2011))。
连同用VP64激活结构域构建的TALE-TF，本发明的其他实施方案涉及用VP16和p65激活结构域构建的TALE多肽。在图11中提供了这些不同激活结构域对Sox2 mRNA水平的作用的图解比较。
实施例5
图17描述隐花色素2异源二聚体取向对LITE功能性的作用。合成两种形式的Neurogenin 2(Neurog2)LITE，以研究隐花色素2光裂解酶同源区(CRY2PHR)/钙和整联蛋白结合蛋白1(CIB1)二聚体取向的效应。在一种形式中，CIB1结构域融合至TALE(Neurog2)结构域的C末端，而CRY2PHR结构域融合至VP64结构域的N末端。在相反形式中，CRY2PHR结构域融合至TALE(Neurog2)结构域的C末端，而CIB1结构域融合至VP64结构域的N末端。每组质粒在Neuro2a细胞中转染，且在收获用于qPCR分析前进行刺激(466nm，5mW/cm2，每15秒1秒脉冲，12小时)。刺激的LITE和未受刺激的LITE Neurog2表达水平针对来自刺激的GFP对照样品的Neurog2水平标准化。TALE-CRY2PHR/CIB1-VP64 LITE显示出升高的基础活性和更高的光诱导的Neurog2表达，并且提示其对于其中需要更高绝对激活的情况的适合性。尽管TALE-CIB1/CRY2PHR-VP64 LITE的相对光诱导活性低于其相应物，但更低的基础活性提示它在需要最低限度基线激活的应用中的效用。进一步地，与TALE-CRY2PHR构建体相比较，TALE-CIB1构建体在尺寸中更小，这是用于例如病毒包装应用的潜在优点。
图18描述在小鼠皮层神经元培养物中的促代谢性谷氨酸受体2(mGlur2)LITE活性。靶向mGluR2的LITE经由质粒pAAV-人突触蛋白I启动子(hSyn)-HA-TALE(mGluR2)-CIB1和pAAV-hSyn-CRY2PHR-VP64-2A-GFP构建。这些融合构建体随后包装成腺相关病毒载体(AAV)。另外，产生携带hSyn-TALE-VP64-2A-GFP和仅GFP的AAV。将胚胎小鼠(E16)皮层培养物置于聚L-赖氨酸涂布的24孔板上。在5天后，体外神经培养物用TALE(mGluR2)-CIB1和CRY2PHR-VP64 AAV原种的混合物共转导。对照样品用TALE(mGluR2)-VP64 AAV或GFP AAV进行转导。在AAV转导后6天，使用两种光脉冲范式中的任一刺激实验样品：0.5秒/分钟和0.25秒/30秒。将神经元刺激24小时且收获用于qPCR分析。所有mGluR2表达水平针对各自的刺激的GFP对照标准化。数据提示LITE***可以用于在体外诱导原代神经元培养物中的靶基因的光依赖性激活。
图19描述用LITE AAV载体转导原代小鼠神经元。原代小鼠皮层神经元培养物在5天时在体外用AAV载体共转导，所述AAV载体编码hSyn-CRY2PHR-VP64-2A-GFP和hSyn-HA-TALE-CIB1，LITE***的两种组分。左图：在转导后6天时，神经培养物显示出来自hSyn-CRY2PHR-VP64-2A-GFP载体的高GFP表达。右图：将共转导的神经元培养物固定，并且用对于hSyn-HA-TALE-CIB1中的TALE结构域的N末端上的HA表位特异性的抗体染色。红色信号指示HA表达，具有特别强的核信号(在蓝色通道中通过DAPI染色的DNA)。总之，这些图像提示每种LITE组分的表达可以在原代小鼠神经元培养物中实现。
(比例尺＝50um)。
图20描述LITE组分在体内的表达。经由HEK293FT细胞的转染产生携带hSyn-CRY2PHR-VP64的血清型1/2的AAV载体，并且经由肝素柱结合纯化。将载体浓缩用于注射到完整的小鼠脑内。通过立体定向手术和注射，将1uL纯化的AAV原种注射到8周龄的雄性C57BL/6小鼠的海马和下边缘皮层。在体内转导后7天，将小鼠实施安乐死，并且通过多聚甲醛灌注固定脑组织。脑切片在振动切片机上制备且固定用于成像。在海马和下边缘皮层中的强和普遍的GFP信号提示LITE组分CRY2PHR-VP64的有效转导和高表达。
实施例6
通过使用NES元件的改善设计
***受体T2(ERT2)具有泄露问题。即使在不存在4-羟基它莫西芬(4OHT)的情况下，ERT2结构域也进入核，导致通过TAL的靶基因激活的本底水平。NES(出核转运信号)是将蛋白质靶向活细胞的细胞质的肽信号。通过将NES加入现有构建体，申请人旨在不存在4OHT的情况下，阻止ERT2-TAL蛋白质进入核内，由于ERT2结构域的“泄露”而降低本底激活水平。
图21描述改良的构建体设计，其中使用的具体NES肽序列是LDLASLIL。
图22描述在4OH他莫昔芬的不存在和存在下的Sox2 mRNA水平。Y轴是如通过qRT-PCR测量的Sox2 mRNA水平。X轴是在顶部描述的不同构建体设计的小图。加和减号指示0.5uM 4OHT的存在或不存在。
实施例7
使用CRISPR/Cas***的多重基因组改造
致病性遗传变体和元件的功能阐明需要精确的基因组编辑技术。II型原核CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)适应性免疫***已显示促进RNA引导的位点特异性DNA切割。申请人改造了两种不同类型的CRISPR***，并且证实Cas9核酸酶可以通过短RNA指导，以诱导在人和小鼠细胞中的内源基因组基因座处的精确切割。Cas9还可以转换成切口酶，以促进具有最低限度诱变活性的同源性指导的修复。最后，多重引导序列可以编码到单个CRISPR阵列内，以允许在哺乳动物基因组内的几个位点的同时编辑，证实CRISPR技术的容易编程性和广泛应用性。
原核CRISPR适应性免疫***可以重构且改造以介导在哺乳动物细胞中的多路基因组编辑。
需要精确有效的基因组靶向技术，以通过允许个别遗传元件的选择性干扰，允许致病性遗传变异的***逆向改造。尽管基因组编辑技术例如设计者锌指(ZF)(M.H.Porteus，D.Baltimore，Chimeric nucleases stimulate gene targeting in humancells.Science300，763(2003年5月2日)；J.C.Miller等人，An improved zinc-fingernuclease architecture for highly specific genome editing.Nat Biotechnol 25，778(2007年7月)；J.D.Sander等人，Selection-free zinc-finger-nuclease engineeringby context-dependent assembly(CoDA).Nat Methods 8，67(2011年1月)和A.J.Wood等人，Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs.Science 333，307(2011年7月15日)、转录激活物样效应物(TALE)(A.J.Wood等人，Targeted genomeediting across species using ZFNs and TALENs.Science 333，307(2011年7月15日)；M.Christian等人，Targeting DNA double-strand breaks with TAL effectornucleases.Genetics 186，757(2010年10月)；F.Zhang等人，Efficient construction ofsequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol 29，149(2011年2月)；J.C.Miller等人，A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol 29，143(2011年2月)；D.Reyon等人，FLASHassembly of TALENs for high-throughput genome editing.Nat Biotechnol 30，460(2012年5月)；J.Boch等人，Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.Science 326，1509(2009年12月11日)和M.J.Moscou，A.J.Bogdanove，Asimple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science326，1501(2009年12月11日))、和归巢大范围核酸酶(B.L.Stoddard，Homing endonucleasestructure and function.Quarterly reviews of biophysics 38，49(2005年2月))已开始允许靶向基因组修饰，但存在可放大、能承受和容易改造的新技术的需要。此处，申请人报告基于RNA引导的Cas9核酸酶的新的一类精确基因组改造工具的开发(M.Jinek等人，Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity.Science 337，816(2012年8月17日)；G.Gasiunas，R.Barrangou，P.Horvath，V.Siksnys，Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavagefor adaptive immunity in bacteria.Proc Natl Acad Sci U S A 109，E2579(2012年9月25日)和J.E.Garneau等人，The CRISPR/Cas bacterial immune system cleavesbacteriophage and plasmid DNA.Nature 468，67(2010年11月4日))，所述RNA引导的Cas9核酸酶来自II型原核CRISPR适应性免疫***(H.Deveau，J.E.Garneau，S.Moineau，CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions.Annual review ofmicrobiology 64，475(2010)；P.Horvath，R.Barrangou，CRISPR/Cas，the immune systemof bacteria and archaea.Science 327，167(2010年1月8日)；K.S.Makarova等人，Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.Nat Rev Microbiol 9，467(2011年6月)和D.Bhaya，M.Davison，R.Barrangou，CRISPR-Cas systems in bacteriaand archaea:versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.Annu RevGenet 45，273(2011))。
酿脓链球菌SF370 II型CRISPR基因座由四种基因包括Cas9核酸酶以及两种非编码RNA组成：由相同的直接重复(DR)间隔的含tracrRNA和a crRNA前体阵列的核酸酶引导序列(间隔物)(图27)(E.Deltcheva等人，CRISPR RNA maturation by trans-encoded smallRNA and host factor RNase III.Nature 471，602(2011年3月31日))。申请人寻求利用该原核RNA可编程核酸酶***，以通过关键组分的异源表达将靶向双链断裂(DSB)引入哺乳动物染色体中。先前已显示tracrRNA、crRNA前体、宿主因子RNA酶III和Cas9核酸酶的表达是在体外(M.Jinek等人，A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease inadaptive bacterial immunity.Science 337，816(2012年8月17日)和G.Gasiunas，R.Barrangou，P.Horvath，V.Siksnys，Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediatesspecific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.Proc Natl Acad Sci US A 109，E2579(2012年9月25日))和原核细胞(R.Sapranauskas等人，The Streptococcusthermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli.NucleicAcids Res 39，9275(2011年11月)和A.H.Magadan，M.E.Dupuis，M.Villion，S.Moineau，Cleavage of phage DNA by the Streptococcus thermophilus CRISPR3-Cassystem.PLoS One 7，e40913(2012))中的DNA切割必需和足够的。申请人密码子优化酿脓链球菌Cas9(SpCas9)和RNA酶III(SpRNase III)，并且附着核定位信号(NLS)，以确保在哺乳动物细胞中的核区室化。这些构建体在人293FT细胞中的表达揭示两个NLS是将SpCas9靶向核所需的(图23A)。为了重构CRISPR的非编码RNA组分，申请人在RNA聚合酶III U6启动子(图23B)下表达89核苷酸(nt)tracrRNA(图28)。类似地，申请人使用U6启动子以驱动包含侧面为DR的单个引导间隔物的crRNA前体阵列的表达(图23B)。申请人设计起始间隔物，以靶向人EMX1基因座中在NGG之前的30碱基对(bp)位点(原型间隔物)，其是必要的原型间隔物邻近基序(PAM)(图23C和图27)(H.Deveau等人，Phage response to CRISPR-encodedresistance in Streptococcus thermophilus.J Bacteriol 190，1390(2008年2月)和F.J.Mojica，C.Diez-Villasenor，J.Garcia-Martinez，C.Almendros，Short motifsequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defencesystem.Microbiology 155，733(2009年3月))。
为了测试CRISPR***(SpCas9、SpRNase III、tracrRNA和crRNA前体)的异源表达是否可以实现哺乳动物染色体的靶向切割，申请人用CRISPR组分的不同组合转染293FT细胞。因为在哺乳动物DNA中的DSB通过形成***缺失的非同源末端连接(NHEJ)途径而部分修复，所以申请人使用SURVEYOR测定(图29)检测内源靶切割(图23D和图28B)。所有四种所需CRISPR组分的共转染导致原型间隔物的有效切割(图23D和图28B)，其随后通过Sanger测序验证(图23E)。有利的是，SpRNase III不是原型间隔物切割所需的(图23D)，并且89-nttracrRNA在其不存在的情况下进行加工(图28C)。类似地，crRNA前体的成熟不需要RNA酶III(图23D和图30)，提示可以存在帮助crRNA前体成熟的内源哺乳动物RNA酶(M.Jinek，J.A.Doudna，A three-dimensional view of the molecular machinery of RNAinterference.Nature 457，405(2009年1月22日)；C.D.Malone，G.J.Hannon，Small RNAsas guardians of the genome.Cell 136，656(2009年2月20日)和G.Meister，T.Tuschl，Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.Nature 431，343(2004年9月16日))。去除剩余RNA或Cas9组分中的任一种取消CRISPR***的基因组切割活性(图23D)。这些结果限定用于哺乳动物细胞中的有效CRISPR介导的基因组修饰的最低限度三组分***。
接下来，申请人探究通过靶向EMX1基因座内的另外原型间隔物，CRISPR介导的切割在真核细胞中的一般性(图24A)。为了改善共递送，申请人设计表达载体以驱动crRNA前体和SpCas9两者(图31)。平行地，申请人采用近期在体外验证的嵌合crRNA-tracrRNA杂交物(图24B，上)设计(M.Jinek等人，A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science 337，816(2012年8月17日))，其中成熟crRNA经由合成的茎环融合至部分tracrRNA，以模拟成熟crRNA:tracrRNA双链体(图24B，下)。当SpCas9与crRNA前体(DR-间隔物-DR)和tracrRNA共表达时，申请人观察到所有原型间隔物靶的切割。然而，并非所有嵌合RNA设计均可促进其基因组靶的切割(图24C，表1)。申请人随后通过设计靶向人PVALB和小鼠Th基因座的crRNA前体和嵌合RNA，在人和小鼠细胞两者中测试另外的基因组基因座的靶向(图32)。使用crRNA:tracrRNA设计，申请人实现在所有三个小鼠Th和一个PVALB靶处的有效修饰，因此证实CRISPR***在修饰跨越多重生物的不同基因座中的广泛可应用性(表1)。对于相同的原型间隔物靶，嵌合RNA的切割效率低于crRNA:tracrRNA双链体的那些或无法检测。这可能是由于RNA表达和稳定性，通过内源RNAi机制降解，或导致无效Cas9装载或靶识别的二级结构中的差异。
有效基因组编辑需要核酸酶以高精确度和效率靶向特异性基因组基因座。为了研究CRISPR介导的切割的特异性，申请人分析在间隔物及其哺乳动物原型间隔物靶之间的单核苷酸错配(图25A)。申请人观察到PAM的5’至多12-bp的单碱基错配完全取消通过SpCas9的基因组切割，而具有更上游的突变的间隔物保留针对原型间隔物靶的活性(图25B)。这与Cas9特异性的先前细菌和体外研究一致(M.Jinek等人，A programmable dual-RNA-guidedDNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337，816(2012年8月17日)和R.Sapranauskas等人，The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas systemprovides immunity in Escherichia coli.Nucleic Acids Res 39，9275(2011年11月))。此外，CRISPR能够与靶向相同EMX1原型间隔物的一对TALE核酸酶(TALEN)一样有效介导基因组切割(图25，C和D)。
基因组的靶向修饰理想地避免起于易错NHEJ机制的突变。野生型SpCas9能够介导位点特异性DSB，其可以通过NHEJ或同源性指导的修复(HDR)进行修复。申请人改造SpCas9的RuvC I结构域中的天冬氨酸至丙氨酸置换(D10A)，以将核酸酶转换成DNA切口酶(SpCas9n，图26A)(M.Jinek等人，A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.Science 337，816(2012年8月17日)；G.Gasiunas，R.Barrangou，P.Horvath，V.Siksnys，Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediatesspecific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.Proc Natl Acad Sci US A 109，E2579(2012年9月25日)和R.Sapranauskas等人，The Streptococcusthermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli.NucleicAcids Res 39，9275(2011年11月))，因为切割的基因组DNA通常无缝或通过高保真HDR进行修复。SURVEYOR(图26B)和327个扩增子的测序未检测到由SpCas9n诱导的任何***缺失。然而，值得注意的是缺口的DNA在罕见情况下可以经由DSB中间体加工，且导致NHEJ事件(M.T.Certo等人，Tracking genome engineering outcome at individual DNAbreakpoints.Nat Methods 8，671(2011年8月))。申请人随后测试使用同源性修复模板在相同EMX1基因座处Cas9介导的HDR，以接近原型间隔物引入一对限制位点(图26C)。SpCas9和SpCas9n催化修复模板以相似水平整合到EMX1基因座内(图26D)，申请人经由Sanger测序进一步验证这点(图26E)。这些结果证实CRISPR用于促进靶向基因组***的效用。考虑到野生型SpCas9的14-bp(12-bp来自种子序列和2-bp来自PAM)靶特异性(图25B)，切口酶的使用可以降低脱靶突变。
最后，具有阵列的间隔物的CRISPR基因座的天然体系结构(图27)提示多路化基因组改造的可能性。使用编码一对EMX1-和PVALB-靶向间隔物的单个CRISPR阵列，申请人检测到在两个基因座处的有效切割(图26F)。申请人使用针对由119-bp间隔的EMX1内的两种靶的间隔物，通过同时DSB，进一步测试更大基因组区域的靶向缺失，并且观察到1.6％缺失效率(182个扩增子中的3个；图26G)，因此证实CRISPR***可以介导在单个基因组内的多路化编辑。
使用RNA编程序列特异性DNA切割的能力限定新的一类基因组改造工具。此处，申请人已显示酿脓链球菌CRISPR***可以在哺乳动物细胞中异源重构，以刺激有效的基因组编辑；伴随研究已独立地证实在几种人细胞系中CRISPR介导的基因组靶向的高效率(Mali等人)。然而，CRISPR***的几个方面可以进一步改善，以增加其效率和通用性。NGG PAM的需求将酿脓链球菌CRISPR靶空间限制在人基因组中平均每8-bp(图33)，不负责由于染色质和DNA甲基化状态通过crRNA二级结构或基因组可接近性造成的潜在约束。这些局限性中的一些可以通过利用Cas9酶家族及其跨越微生物多样性(K.S.Makarova等人，Evolution andclassification of the CRISPR-Cas systems.Nat Rev Microbiol 9，467(2011年6月))的不同PAM需求(H.Deveau等人，Phage response to CRISPR-encoded resistance inStreptococcus thermophilus.J Bacteriol 190，1390(2008年2月)和F.J.Mojica，C.Diez-Villasenor，J.Garcia-Martinez，C.Almendros，Short motif sequencesdetermine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system.Microbiology155，733(2009年3月))得到克服。事实上，其他CRISPR基因座可能翻译到哺乳动物细胞内；例如，嗜热链球菌LMD-9CRISPR1还可以介导哺乳动物基因组切割(图34)。最后，在哺乳动物细胞中进行多路基因组编辑的能力允许跨越基础科学、生物技术和医学的有力应用(P.A.Carr，G.M.Church，Genome engineering.Nat Biotechnol 27，1151(2009年12月))。
实施例8
使用CRISPR/Cas***的多路基因组编辑：补充材料
细胞培养和转染。人胚胎肾(HEK)细胞系293FT(Life Technologies)维持在达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中在37℃下伴随5％ CO2温育，所述培养基补充有10％胎牛血清(HyClone)、2mM GlutaMAX(Life Technologies)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。小鼠neuro2A(N2A)细胞系(ATCC)用DMEM维持在37℃与5％ CO2下，所述DMEM补充有5％胎牛血清(HyClone)、2mM GlutaMAX(Life Technologies)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
在转染前一天，以200,000细胞/孔的密度，将293FT或N2A细胞种植到24孔板(Corning)内。遵循制造商推荐的方案，使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)转染细胞。对于24孔板的每个孔，使用总共800ng质粒。
用于基因组修饰的Suveryor测定和测序分析。如上所述用质粒DNA转染293FT或N2A细胞。在基因组DNA提取前，细胞在转染后在37℃下温育72小时。遵循制造商的方案，使用QuickExtract DNA提取试剂盒(Epicentre)，提取基因组DNA。简言之，将细胞重悬浮于QuickExtract溶液中，且在65℃下温育15分钟和在98℃下温育10分钟。
PCR扩增关于每种基因的CRISPR靶位点周围的基因组区域，并且遵循制造商的方案，使用QiaQuick Spin Column(Qiagen)纯化产物。使总共400ng纯化的PCR产物与2μl10XTaq聚合酶PCR缓冲液(Enzymatics)和超纯水混合至20μl的最终体积，并且实施再退火过程以允许异源双链体形成：95℃10分钟，以-2℃/秒的95℃至85℃坡度(ramping)，以-0.25℃/秒的85℃至25℃，和25℃保持1分钟。在再退火后，遵循制造商推荐的方案，产物用SURVEYOR核酸酶和SURVEYOR增强子S(Transgenomics)进行处理，并且在4-20Novex TBE聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies)上进行分析。凝胶用SYBR Gold DNA染剂(Life Technologies)染色30分钟，并且用Gel Doc凝胶成像***(Biorad)成像。定量基于相对条带强度。
用于检测同源重组的限制性片段长度多态性测定。HEK 293FT和N2A细胞用质粒DNA转染，且如上所述在基因组DNA提取前，在37℃下温育72小时。使用在同源重组(HR)模板的同源臂外的引物，PCR扩增靶基因组区域。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并且用MinElute GelExtraction Kit(Qiagen)提取。纯化的产物用HindIII(Fermentas)进行消化，并且在6％ Novex TBE聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies)上进行分析。
RNA提取和纯化。HEK 293FT细胞如先前所述维持且转染。通过受胰蛋白酶作用，随后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤来收获细胞。遵循制造商的方案，用TRI试剂(Sigma)提取总细胞RNA。提取的总RNA使用Naonodrop(Thermo Scientific)进行定量，且标准化至相同浓度。
在哺乳动物细胞中的crRNA和tracrRNA表达的RNA印迹分析。将RNA与等体积的2X装载缓冲液(Ambion)混合，加热至95℃5分钟，在冰上冷却1分钟，且随后在将凝胶预运行至少30分钟后，装载到8％变性聚丙烯酰胺凝胶(SequaGel，National Diagnostics)上。将样品以40W限制电泳1.5小时。其后，将RNA在半干转移仪器(Bio-rad)中在室温下以300mA转移至Hybond N+膜(GE Healthcare)共1.5小时。使用在Stratagene UV CrosslinkerStratalinker(Stratagene)上的自交联按钮，使RNA与膜交联。膜在ULTRAhyb-Oligo杂交缓冲液(Ambion)中伴随在42℃下的旋转预杂交30分钟，并且随后加入探针且杂交过夜。探针购自IDT且用[γ-32P]ATP(Perkin Elmer)与T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)标记。将膜用预温的(42℃)2xSSC、0.5％ SDS洗涤一次共1分钟，随后为在42℃下的两次30分钟洗涤。使膜在室温下暴露于荧光屏一小时或过夜，并且随后用磷光显像仪(Typhoon)扫描。
表1.哺乳动物基因组靶的原型间隔物序列和修饰效率。原型间隔物靶基于酿脓链球菌II型CRISPR和嗜热链球菌CRISPR1基因座进行设计，其中其必要PAM针对人和小鼠基因组中的三种不同基因。细胞用Cas9和crRNA前体/tracrRNA或嵌合RNA进行转染。细胞在转染后72小时进行分析。***缺失百分比基于来自所示细胞系的SURVEYOR测定结果进行计算，对于所有原型间隔物靶N＝3，误差是S.E.M.，N.D.，使用SURVEYOR测定无法检测；N.T.，在该研究中未测试。
表2.用于SURVEYOR测定、RFLP测定、基因组测序和RNA印迹的引物和探针的序列。
补充序列
>U6-短tracrRNA(酿脓链球菌SF370)
>U6-长tracrRNA(酿脓链球菌SF370)
>U6-DR-BbsI主链-DR(酿脓链球菌SF370)
>U6-嵌合RNA-BbsI主链(酿脓链球菌SF370)
3xFLAG-NLS-SpCas9-NLS
/>
/>
SpRNase3-mCherry-NLS
/>
>3xFLAG-NLS-SpCas9n-NLS(D10A切口酶突变是有下划线的)
/>
/>
>hEMX1-HR模板-HindIII-NheI
/>
＞NLS-StCsn1-NLS
/>
＞U6-St_tracrRNA(7-97)
>EMX1_TALEN_左
/>
>EMX1_TALEN_右
/>
实施例9
AAV构建体的克隆(构建)
AAV-启动子-TALE-效应物主链的构建。对于AAV-启动子-TALE-效应物主链的构建，通过标准亚克隆方法克隆主链。具体地，载体含有抗生素抗性基因例如氨苄青霉素抗性，以及侧接启动子-TALE-效应物***片段的两个AAV反向末端重复(itr’s)(序列参见下文)。将启动子(hSyn)、效应物结构域(在该实施例中VP64、SID4X或CIB1)/含有具有两个IIS型限制位点(在这种情况下BsaI)的间隔物的TALE基因的N和C末端部分亚克隆到该载体内。为了实现亚克隆，使用聚合酶链反应扩增每种DNA组分，并且随后用特异性限制性酶消化，以产生匹配的DNA粘性末端。载体用DNA限制性酶类似地消化。随后允许所有DNA片段在匹配末端处退火且使用连接酶融合在一起。
个别TALE装配成AAV-启动子-TALE-效应物主链。为了将不同的TALE单体序列掺入上述AAV-启动子-TALE-效应物主链内，策略基于用IIS型限制性酶限制个别单体及其独特突出端的连接，以形成12-16个单体的装配以形成最终TALE，且将其连接到AAV-启动子-TALE-效应物主链内，通过使用N和C末端之间的间隔物中存在的IIS型位点(称为黄金门装配)。该TALE单体装配方法先前已由我们(NE Sanjana，L Cong，Y Zhou，M M Cunniff，GFeng&F Zhang A transcription activator-like effector toolbox for genomeengineering Nature Protocols 7，171–192(2012)doi:10.1038/nprot.2011.431)描述。
通过使用上文概述的一般克隆策略，可以容易地构建含有不同启动子、效应物结构域和TALE单体序列的AAV载体。
核苷酸序列：
左AAV ITR
右AAV ITR
hSyn启动子
TALE N末端(+136AA截短)
TALE C末端(+63AA截短)
氨苄青霉素抗性基因
/>
实施例10
内源哺乳动物转录的光学控制
直接调控内源哺乳动物基因组的转录的能力对于阐明正常基因功能和疾病机制是关键的。此处，申请人描述光诱导的转录效应物(LITE)的开发，所述LITE是整合可定制的TALE DNA结合结构域与来自拟南芥的光敏隐花色素2蛋白质及其相互作用配偶体CIB1的双杂交***。LITE可以在几分钟内激活，介导内源哺乳动物基因表达的可逆双向调节以及靶向外遗传染色质修饰。申请人已在原代小鼠神经元以及在体内清醒行为的小鼠的大脑中应用该***。LITE***建立内源细胞过程的光遗传学的新型模式，并且允许直接测试遗传和外遗传调节的致病作用。
基因表达的动态性质允许在活***中的细胞编程、稳态和环境适应。剖析基因对细胞和生物功能的贡献因此需要允许基因表达的空间和时间控制调控的方法。微生物和植物衍生的光敏蛋白质已改造为光遗传学驱动器，允许使用光(其提供高空间与时间分辨率)来控制许多细胞功能(Deisseroth，K.Optogenetics.Nature methods 8，26-29，doi:10.1038/nmeth.f.324(2011)；Zhang，F.等人The microbial opsin family ofoptogenetic tools.Cell 147，1446-1457，doi:10.1016/j.cell.2011.12.004(2011)；Levskaya，A.，Weiner，O.D.，Lim，W.A.&Voigt，C.A.Spatiotemporal control of cellsignalling using a light-switchable protein interaction.Nature 461，997-1001，doi:10.1038/nature08446(2009)；Yazawa，M.，Sadaghiani，A.M.，Hsueh，B.&Dolmetsch，R.E.Induction of protein-protein interactions in live cells usinglight.Nature biotechnology 27，941-945，doi:10.1038/nbt.1569(2009)；Strickland，D.等人TULIPs:tunable，light-controlled interacting protein tags for cellbiology.Nature methods 9，379-384，doi:10.1038/nmeth.1904(2012)；Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in livingcells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010)；Shimizu-Sato，S.，Huq，E.，Tepperman，J.M.&Quail，P.H.A light-switchable gene promotersystem.Nature biotechnology 20，1041-1044，doi:10.1038/nbt734(2002)；Ye，H.，Daoud-El Baba，M.，Peng，R.W.&Fussenegger，M.A synthetic optogenetictranscription device enhances blood-glucose homeostasis in mice.Science 332，1565-1568，doi:10.1126/science.1203535(2011)；Polstein，L.R.&Gersbach，C.A.Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zincfinger transcription factors.Journal of the American Chemical Society 134，16480-16483，doi:10.1021/ja3065667(2012)；Bugaj，L.J.，Choksi，A.T.，Mesuda，C.K.，Kane，R.S.&Schaffer，D.V.Optogenetic protein clustering and signalingactivation in mammalian cells.Nature methods(2013)和Zhang，F.等人Multimodalfast optical interrogation of neural circuitry.Nature 446，633-639，doi:10.1038/nature05744(2007))。然而，使用光直接调控内源转录调节的通用和强大技术仍是难以实现的。
此处，申请人报告光诱导的转录效应物(LITE)的开发，所述LITE是允许哺乳动物细胞中的内源遗传和外遗传过程的空间与时间精确控制的模块光遗传学***。LITE组合来自黄单胞菌属物种的转录激活物样效应物(TALE)的可编程的DNA结合结构域(Boch，J.等人Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type IIIeffectors.Science 326，1509-1512，doi:10.1126/science.1178811(2009)和Moscou，M.J.&Bogdanove，A.J.Asimple cipher governs DNA recognition by TALeffectors.Science 326，1501，doi:10.1126/science.1178817(2009))与来自拟南芥的光诱导的异源二聚体蛋白质隐花色素2(CRY2)和CIB1(Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010)和Liu，H.等人Photoexcited CRY2 interactswith CIB1 to regulate transcription and floral initiation inArabidopsis.Science 322，1535-1539，doi:10.1126/science.1163927(2008))。它们不需要引入异源遗传元件，不依赖外源化学辅因子，并且显示出快速和可逆的二聚化动力学(Levskaya，A.，Weiner，O.D.，Lim，W.A.&Voigt，C.A.Spatiotemporal control of cellsignalling using a light-switchable protein interaction.Nature 461，997-1001，doi:10.1038/nature08446(2009)；Yazawa，M.，Sadaghiani，A.M.，Hsueh，B.&Dolmetsch，R.E.Induction of protein-protein interactions in live cells usinglight.Nature biotechnology 27，941-945，doi:10.1038/nbt.1569(2009)，Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in livingcells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010)；Shimizu-Sato，S.，Huq，E.，Tepperman，J.M.&Quail，P.H.Alight-switchable gene promoter system.Naturebiotechnology 20，1041-1044，doi:10.1038/nbt734(2002)和Liu，H.等人PhotoexcitedCRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation inArabidopsis.Science 322，1535-1539，doi:10.1126/science.1163927(2008))。如同其他光遗传学工具，LITE可以包装成病毒载体并且遗传靶向探针特异性细胞群体。申请人证实该***在原代神经元以及体内小鼠脑中的应用。
LITE***含有两种独立组分(图36A)：第一种组分是基因组锚，并且由融合至光敏CRY2蛋白质的定制的TALE DNA结合结构域组成(TALE-CRY2)。第二种组分由融合至所需转录效应物结构域的CIB1组成(CIB1-效应物)。为了确保有效的核靶向，申请人将核定位信号(NLS)附着至两个模块。在不存在光的情况下(失活状态)，TALE-CRY2结合靶基因的启动子区，而CIB1-效应物在核区室内保持游离。用蓝光(峰～450nm)照明触发CRY2中的构象变化，且随后将CIB1-效应物(图36A中所示的VP64)召募至靶基因座，以介导转录调控。该模块设计允许每种LITE组分独立地进行改造。例如，相同基因组锚可以与激活或阻遏效应物组合(Beerli，R.R.，Segal，D.J.，Dreier，B.&Barbas，C.F.，3rd.Toward controlling geneexpression at will:specific regulation of the erbB-2/HER-2promoter by usingpolydactyl zinc finger proteins constructed from modular buildingblocks.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 95，14628-14633(1998)和Cong，L.，Zhou，R.，Kuo，Y.-c.，Cunniff，M.&Zhang，F.Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules andtranscriptional repressor domains.Nat Commun 3，968)，以对相同内源基因组基因座发挥正和负转录控制。
为了鉴定最有效的LITE体系结构，申请人将TALE和转录激活物VP64(Beerli，R.R.，Segal，D.J.，Dreier，B.&Barbas，C.F.，3rd.Toward controlling gene expressionat will:specific regulation of the erbB-2/HER-2promoter by using polydactylzinc finger proteins constructed from modular building blocks.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 95，14628-14633(1998)；Zhang，F.等人Efficient construction of sequence-specific TALeffectors for modulating mammalian transcription.Nat Biotechnol 29，149-153，doi:10.1038/nbt.1775(2011)；Miller，J.C.等人ATALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nature biotechnology 29，143-148，doi:10.1038/nbt.1755(2011)和Hsu，P.D.&Zhang，F.Dissecting neural function using targeted genomeengineering technologies.ACS chemical neuroscience 3，603-610，doi:10.1021/cn300089k(2012).)分别融合至CRY2和CIB1的不同截短(Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.Naturemethods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010))，并且通过测量蓝光照明诱导的神经谱系指定转录因子neurogenin 2(Neurog2)的转录变化来评价每种设计的功效(图36B)。申请人评估全长CRY2以及由单独的光裂解酶同源区(CRY2PHR，氨基酸1-498)组成的截短(Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactionsin living cells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010))。对于CIB1，申请人测试全长蛋白质以及仅N末端结构域片段(CIBN，氨基酸1-170)(Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in livingcells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010))。4个最初LITE配对中的3个在Neuro 2a细胞中产生显著的光诱导的Neurog2mRNA上调(p<0.001，图36B)。在这些中，当针对仅GFP对照或未受刺激的LITE样品标准化时，TALE-CRY2PHR::CIB1-VP64获得最高的绝对光介导的mRNA增加(图36B)，并且因此在后续实验中应用。
已建立了有效的LITE体系结构，申请人***优化光刺激参数，包括波长(图40)、工作循环(图41)和光强度(图42和实施例11)(Banerjee，R.等人The信号转导state ofArabidopsis cryptochrome 2contains flavin semiquinone.The Journal ofbiological chemistry 282，14916-14922，doi:10.1074/jbc.M700616200(2007))。申请人还比较激活结构域VP16和p65加上VP64，以测试LITE CIB1-效应物组分的模块性。所有三个结构域均产生显著的光依赖性Neurog2 mRNA上调(p<0.001，图43)。由于其在不存在光刺激的情况下的更低基础活性，申请人选择VP64用于后续实验。
内源基因表达的操纵呈现多种挑战，因为表达速率依赖许多因素，包括调节元件、mRNA加工和转录物稳定性(Moore，M.J.&Proudfoot，N.J.Pre-mRNAprocessing reachesback to transcription and ahead to translation.Cell 136，688-700，doi:10.1016/j.cell.2009.02.001(2009)和Proudfoot，N.J.，Furger，A.&Dye，M.J.Integrating mRNAprocessing with transcription.Cell 108，501-512(2002))。尽管在CRY2和CIB1之间的相互作用在亚秒时间尺度发生(Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediatedinduction ofprotein interactions in living cells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010))，但是LITE介导的激活可能受限于转录的固有动力学。通过测量在30分钟至24小时的光刺激时间过程期间的mRNA水平，申请人研究LITE介导的Neurog2表达的开启动力学(图36C)。Neurog2 mRNA的相对水平早在光刺激开始后30分钟相当大地增加，并且稳定上升直至在12小时饱和，与GFP转染的阴性对照相比较，具有大致20倍上调。类似地，通过将细胞刺激6小时且在停止照明后的多个时间点测量Neurog2转录物的水平，申请人评价***的关闭动力学。Neurog2 mRNA水平在刺激后高达30分钟短暂增加，这是可能起因于残留CRY2PHR-CIB1二聚化或先前召募的RNA聚合酶的效应。其后，Neurog2表达下降，具有～3小时的半衰期，证实转录物在不存在光刺激的情况下回到天然水平。相比之下，基于植物激素脱落酸受体的小分子诱导LITE***(Liang，F.-S.，Ho，W.Q.&Crabtree，G.R.Engineering the ABA Plant Stress Pathway for Regulation ofInduced Proximity.Sci.Signal.4，rs2-，doi:10.1126/scisignal.2001449(2011))显示出更低的开启和关闭动力学(图44)，潜在受限于药物扩散、代谢和清除率。
申请人接下来探究经由病毒转导LITE用于神经元应用的效用。申请人开发了基于腺相关病毒(AAV)的载体用于递送TALE基因和用于AAV生产的简化过程(图37A和B，图45和实施例11)。基于ssDNA的AAV基因组对重组较不敏感，提供相对慢病毒载体的优点(Holkers，M.等人Differential integrity of TALE nuclease genes followingadenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells.Nucleic acidsresearch 41，e63，doi:10.1093/nar/gks1446(2013))。
为了表征用于调控原代小鼠皮层神经元中的转录的AAV介导的TALE递送，申请人构建了靶向全部28个鼠基因座的TALE-VP64转录激活物实验对象组，所述基因座包括涉及神经传递或神经元分化的基因、离子通道亚单位和牵涉神经***疾病的基因。每种靶基因的启动子中的DNA酶I敏感区提供了用于TALE结合序列选择的指导(图46)。申请人证实TALE活性可以使用申请人的AAV-TALE生产过程有效筛选(图45)，并且发现以这种方式选择且使用AAV载体递送到原代神经元内的TALE将广泛多样的基因靶激活至不同程度(图37C)。此外，AAV-TALE的立体定向递送介导在小鼠前额叶皮层中在体内的强表达(图37D，E)。与注射GFP的对照相比较，在小鼠下边缘皮层(ILC)中的TALE(Grm2)-VP64表达诱导Grm2 mRNA水平中的2.5倍增加(图37F)。
已将TALE激活物递送到培养的原代神经元内，申请人接下来寻求使用AAV作为用于递送LITE组分的载体。为了实现这点，申请人需要确保其中包括LITE转基因的每种重组AAV的总病毒基因组大小不超过4.8kb的包装限制(Wu，Z.，Yang，H.&Colosi，P.Effect ofGenome Size on AAV Vector Packaging.Mol Ther 18，80-86(2009))。申请人缩短TALE N和C末端(保留在N末端中的136aa和在C末端中的63aa)，并且交换CRY2PHR(1.5kb)和CIB1(1kb)结构域(TALE-CIB1和CRY2PHR-VP64；图38A)。通过两种AAV载体的组合，经由共转导将这些LITE递送到原代皮层神经元内(图38B；对于>80％共转导效率，个别组分83-92％的递送效率)。申请人测试在2个光脉冲频率与0.8％的降低工作循环下靶向Grm2的LITE，以确保神经元健康(图47)。两种刺激条件均实现Grm2mRNA水平中～7倍光依赖性增加(图38C)。进一步研究验证大量靶基因表达增加可以快速获得(在4小时内4倍上调；图38D)。另外，申请人观察到在刺激后mGluR2蛋白质的显著上调，证实在mRNA水平上由LITE实现的变化转变为蛋白质水平(相对于GFP对照p<0.01，相对于无光条件p<0.05；图38E)。
为了在体内应用LITE***，申请人将携带Grm2靶向TALE-CIB1和CRY2PHR-VP64LITE组分的高浓度AAV载体(1012DNA酶I抗性颗粒/mL)的1:1混合物立体定向递送到野生型C57BL/6小鼠的ILC内。为了在体内提供LITE表达神经元的光学刺激，申请人在注射部位处植入光导纤维插管(图38F和图48)(Zhang，F.等人Optogenetic interrogation of neuralcircuits:technology for probing mammalian brain structures.Nat Protoc 5，439-456，doi:10.1038/nprot.2009.226(2010))。在注射部位处的神经元通过两种病毒有效共转导，其中>80％的转导细胞表达TALE(Grm2)-CIB1和CRY2PHR-VP64(图38G和图49)。手术后8天，申请人通过将固态473nm激光器连接至植入的纤维插管来刺激行为小鼠的ILC。在12小时刺激期(5mW，0.8％工作循环，使用以0.0167Hz的0.5s光脉冲)后，就Grm2 mRNA中的变化分析来自光导纤维插管植入部位的脑组织(图38H)。与未受刺激的ILC相比较，申请人观察到在光刺激后在Grm2 mRNA中的显著增加(p≤0.01)。总之，这些结果证实LITE允许在培养的神经元中和在体内的内源基因表达的光学控制。
由于LITE激活物在体内的无光条件下观察到的基础上调的持续性，申请人进行另一轮优化，旨在鉴定且减弱本底来源，并且改善光介导的基因诱导的效率(基因表达的光/无光比)。仅表达LITE靶向组分TALE-CIB1的神经元产生类似于在表达两种LITE组分的未受刺激的神经元中发现的Grm2 mRNA增加(相对于GFP对照，两者均p<0.001)，而单独的效应物组分CRY2PHR-VP64不显著影响转录(p>0.05，图50)，暗示由LITE引起的本底转录激活可以仅起于DNA靶向组分。
相应地，申请人进行广泛筛选以降低由TALE-CIB1引起的基础靶上调(图51)。优化集中于两种策略：第一种，CIB1是植物转录因子，并且即使在哺乳动物细胞中也可能具有固有调节效应(Liu，H.等人Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to RegulateTranscription and Floral Initiation in Arabidopsis.Science 322，1535-1539，doi:10.1126/science.1163927(2008))。申请人寻求通过缺失在高等植物的碱性螺旋-环-螺旋转录因子中保守的三个CIB1区来消除这些效应(图51)。第二种，申请人旨在阻止TALE-CIB1在不存在光的情况下结合靶基因座。为了实现这点，申请人将TALE-CIB1改造为定位于细胞质，直至与含NLS的CRY2PHR-VP64光诱导的二聚化时(图52)。为了独立地或组合地测试两种策略，申请人评估73种不同的LITE体系结构，且鉴定12个效应物-靶向结构域对(通过图51和图53中的“+”列指示)，具有改善的光诱导效率和降低的总体基线两者(与原始LITE1.0相比较，在无光条件下的mRNA增加倍数；p<0.05)。命名为LITE2.0，掺入两种策略的一种体系结构证实最高的光诱导(光/无光＝20.4)，并且导致与原始体系结构相比较，本底激活的大于6倍降低(图38I)。另一种–LITE1.9.1–产生最低限度的本底mRNA增加(1.06)，同时维持四倍光诱导(图53)。
申请人寻求进一步扩展通过TALE和LITE调控可接近的过程范围。内源转录阻遏通常由染色质修饰酶例如组蛋白甲基转移酶(HMT)和脱乙酰基酶(HDAC)介导。申请人先前已显示mSin3相互作用结构域(SID)，mSin3-HDAC复合物的一部分，可以与TALE融合，以便下调293FT细胞中的靶基因(Beerli，R.R.，Segal，D.J.，Dreier，B.&Barbas，C.F.，3rd.Towardcontrolling gene expression at will:specific regulation of the erbB-2/HER-2promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modularbuilding blocks.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 95，14628-14633(1998)和Cong，L.，Zhou，R.，Kuo，Y.-c.，Cunniff，M.&Zhang，F.Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules andtranscriptional repressor domains.Nat Commun 3，968，doi:http://www.nature.com/ncomms/journal/v3/n7/suppinfo/ncomms1962_S1.html(2012))。希望进一步改善该TALE阻遏物，申请人推论SID的四个重复(类似于VP64的四重VP16串联重复体系结构)(Beerli，R.R.，Segal，D.J.，Dreier，B.&Barbas，C.F.，3rd.Toward controlling gene expressionat will:specific regulation of the erbB-2/HER-2promoter by using polydactylzinc finger proteins constructed from modular building blocks.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 95，14628-14633(1998))，可能增大其效力，以阻遏基因转录。事实上，TALE-SID4X构建体在293FT细胞中与TALE-SID一样两倍有效(图54A和54B)，并且还介导神经元中的有效基因表达(图54C和54D)。
申请人假设TALE介导的组蛋白效应物靶向内源基因座可以诱导特异性外遗传修饰，允许询问外遗传以及转录动力学(图39A)。申请人生成CRY2PHR-SID4X构建体且证实在神经元中光介导的Grm2转录阻遏(图39B和图39C)，伴随在靶向的Grm2启动子处的H3K9乙酰化中的～2倍降低(图39D)。在扩展用于基因座特异性组蛋白修饰的组蛋白残基靶的多样性的努力中，申请人从文献衍生了一组阻遏组蛋白效应物结构域(表6)。从广泛***发育谱中抽取，结构域包括HDAC、组蛋白甲基转移酶(HMT)和组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂、以及HDAC和HMT召募蛋白质。优选小尺寸的蛋白质和功能截短，以促进有效的AAV包装。所得到的外遗传修饰TALE组蛋白效应物融合构建体(epiTALE)在原代神经元和Neuro 2a细胞中测试其分别阻遏Grm2和Neurog2转录的能力(图39E，图39F和图55)。在原代神经元中，使用p<0.05的统计标准，24个epiTALE中的23个成功阻遏grm2的转录。类似地，对于测试的32种组蛋白效应物结构域中的20种，在Neuro 2a细胞中的epiTALE表达导致减少的Neurog2表达(p<0.05)。有希望的epiTALE亚集在原代神经元和Neuro 2a细胞中表达，并且通过ChIP-RT-qPCR定量靶向的内源启动子中的相对组蛋白残基标记水平(图39G，图39H和图56)。在原代神经元或Neuro 2a细胞中，H3K9me1、H4K20me3、H3K27me3、H3K9ac和H4K8ac的水平分别通过衍生自下述的epiTALE加以改变：KYP(拟南芥)，TgSET8(刚地弓形虫(T.gondii))，NUE和PHF19(沙眼衣原体(C.trachomatis)和智人)，Sin3a、Sirt3和NcoR(全部智人)以及hdac8、RPD3和Sir2a(非洲爪蟾(X laevis)、酿酒酵母(S cerevisiae)、恶性疟原虫(Pfalciparum))。这些结构域提供了外遗传效应物的现成来源，以扩展通过LITE的转录和外遗传控制的范围。
实现异源组织例如脑中的空间与时间精确的体内基因调节的能力允许研究者询问关于动态基因调节在与发育、学***台。
方法概括。使用GenJet将LITE构建体转染到Neuro 2A细胞内。携带TALE或LITE构建体的AAV载体用于转导小鼠原代胚胎皮层神经元以及体内的小鼠脑。将RNA提取且逆转录，并且使用基于TaqMan的RT-qPCR测量mRNA水平。发光二极管或固态激光器分别用于组织培养和体内的光递送。
LITE的设计和构建。所有LITE构建体序列均可在实施例11中找到。
Neuro 2a培养和实验。Neuro 2a细胞(Sigma-Aldrich)在含有1:1比的OptiMEM(Life Technologies)与具有GlutaMax和丙酮酸钠的高糖DMEM(Life Technologies)的培养基中生长，所述培养基补充有5％ HyClone热灭活的FBS(Thermo Scientific)、1％青霉素/链霉素(Life Technologies)，并且每2天以1:5传代。在转染前18-20小时，将120,000个细胞铺平板到24孔板的每个孔中。转染前1小时，将培养基更换为补充有5％ HyClone热灭活的FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM。根据制造商的说明书，用1.5μL GenJet(SignaGenLaboratories)转染试剂，以总共1.0μg构建体DNA(以等摩尔比)/孔转染细胞。在转染后24小时和44小时更换培养基，并且在48小时开始光刺激。刺激参数是：5mW/cm2，466nm，7％工作循环(1s光脉冲0.067Hz)共24小时，除非在图例中另有指示。根据制造商的说明书，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取RNA，并且使用qScript(Quanta Biosystems)逆转录1μg RNA/样品。使用对于靶向基因特异性的TaqMan探针以及GAPDH作为内源对照(LifeTechnologies，关于Taqman探针ID参见表3)，通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量相对mRNA水平。ΔΔCt分析用于获得相对于仅用GFP转导且经由光刺激的阴性对照的变化倍数。根据说明书，使用LIVE/DEAD测定试剂盒(Life Technologies)，进行毒性实验。
AAV载体产生。293FT细胞(Life Technologies)在无抗生素的D10培养基(具有GlutaMax和丙酮酸钠、10％热灭活的HyClone FBS和1％1M HEPES的DMEM高糖)中生长，并且每天以1:2-2.5传代。传代总数目保持低于10，并且细胞从不生长超过85％汇合。在转染前一天，将在21.5mL D10培养基中的1x106细胞铺平板到15cm皿内，并且温育18-22小时或直至～80％汇合。为了用作转染试剂，将1mg/mL PEI“Max”(Polysciences)溶解于水中，并且将溶液的pH调整至7.1。对于AAV产生，将10.4μg pDF6辅助质粒、8.7μg pAAV1血清型包装载体和5.2μg携带目的基因的pAAV载体加入434μL无血清DMEM，并且将130μL PEI“Max”溶液加入DMEM稀释的DNA混合物中。使DNA/DMEM/PEI混合物涡旋且在室温下温育15分钟。在温育后，将转染混合物加入22mL完全培养基中，短暂涡旋，并且用于替换293FT细胞的15cm皿的培养基。对于上清液产生，在48小时收获转染上清液，通过0.45μm PVDF滤器(Millipore)过滤，稀释成等分试样，并且冷冻用于在-80℃下贮存。
原代皮层神经元培养。由处于E16的C57BL/6N小鼠胚胎(Charles River Labs)制备解剖的皮层神经元。皮层组织在冰冷的HBSS–(50mL 10x HBSS、435mL dH2O、0.3M HEPESpH 7.3和1％1％青霉素/链霉素)中解剖。将皮层组织用20mL冰冷的HBSS洗涤3X，并且随后在37℃下在具有240μL 2.5％胰蛋白酶(Life Technologies)的8mL HBSS中消化20分钟。随后将皮层用含有1mL FBS的20mL温HBSS洗涤3次。将皮层在2ml HBSS中轻轻研磨，并且以150,000个细胞/孔铺平板到聚D-赖氨酸涂布的24孔板(BD Biosciences)中。神经元维持在Neurobasal培养基(Life Technologies)中，所述培养基补充有1X B27(LifeTechnologies)、GlutaMax(Life Technologies)和1％青霉素/链霉素。
原代神经元转导和光刺激实验。用在DIV 5时的250μL AAV1上清液转导原代皮层神经元。第二天将培养基和上清液替换为常规的完全neurobasal。在AAV转导后6天，将Neurobasal更换为含有1X B27、GlutaMax(Life Technologies)和1％青霉素/链霉素的最小必需培养基(Life Technologies)，以阻止在光刺激期间来自Neurobasal中含有的HEPES和核黄素的光毒性产物形成。
在AAV转导后6天(DIV 11)，用5mW/cm2的强度、0.8％的工作循环(以0.033Hz的250ms脉冲或以0.016Hz的500ms脉冲)、466nm蓝光开始光刺激24小时，除非在图例中另有指示。根据制造商的说明书(Life Technologies)，使用Cells-to-Ct试剂盒，执行RNA提取和逆转录。如上文对于Neuro 2a细胞描述的，使用TaqMan探针，通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量相对mRNA水平。
原代神经元的免疫组织化学。对于原代神经元的免疫组织化学，在收获后将细胞在聚D-赖氨酸/层粘连蛋白涂布的盖玻片(BD Biosciences)上铺平板。如上所述执行AAV1转导。在转导后7天，将神经元用4％多聚甲醛(Sigma Aldrich)在RT下固定15分钟。阻断和渗透化用在DPBS(Life Technologies)中的10％正常山羊血清(Life Technologies)和0.5％ Triton-X100(Sigma-Aldrich)在室温下执行1小时。神经元与一抗在4℃下温育过夜，用DPBS洗涤3X且与二抗在RT下温育90分钟。对于抗体提供者和使用的浓度，参见表4。盖玻片最后使用具有DAPI的Prolong Gold Antifade Reagent(Life Technologies)固定，且在具有X-Cite 120Q光源(Lumen Dynamics)的Axio Scope A.1(Zeiss)上成像。使用AxioCam MRm照相机和AxioVision 4.8.2获得图像。
蛋白质印迹。对于总蛋白质裂解产物的制备，在光刺激(参见上文)后在冰冷的裂解缓冲液(RIPA，Cell信号转导；0.1％ SDS，Sigma-Aldrich；和完全超蛋白酶抑制剂混合物，Roche Applied Science)中收获原代皮层神经元。将细胞裂解产物在Bioruptor超声仪(sonicator)(Diagenode)中在‘M’设置下超声处理5分钟，并且在4℃下以21,000x g离心10分钟。使用RC DC蛋白质测定(Bio-Rad)来测定蛋白质浓度。在非还原条件下，在4-15％Tris-HCl凝胶(Bio-Rad)上分离30-40μg总蛋白质/泳道连同Precision Plus ProteinDual Color Standard(Bio-Rad)。在湿电转移至聚偏氟乙烯膜(Millipore)和在Tris缓冲盐水(TBS，Bio-Rad)中的5％ BLOT-QuickBlocker(Millipore)中封闭膜45分钟后，蛋白质印迹用抗mGluR2(Abcam，1:1.000)和抗α微管蛋白(Sigma-Aldrich 1:20,000)在4℃下探测过夜，随后为洗涤和抗小鼠-IgG HRP抗体温育(Sigma-Aldrich，1:5,000–1:10,000)。关于进一步的抗体细节，参见表4。经由ECL蛋白质印迹底物(SuperSignal West Femto Kit，Thermo Scientific)执行检测。印迹用AlphaImager(Innotech)***进行成像，并且使用ImageJ软件1.46r进行定量。
浓缩且纯化的AAV1/2载体的产生。使用上文对于AAV1上清液产生概述的相同起始步骤，完成用于体内立体定向注射的浓缩且纯化的AAV产生。然而，对于转染，使用相等比例的AAV1和AAV2血清型质粒代替单独的AAV1。每种构建体转染5块板，并且在转染后48小时，用细胞刮棒收获细胞。使用HiTrap肝素亲和柱(GE Healthcare)执行AAV1/2颗粒的纯化(McClure，C.，Cole，K.L.，Wulff，P.，Klugmann，M.&Murray，A.J.Production and titeringof recombinant adeno-associated viral vectors.J Vis Exp，e3348，doi:10.3791/3348(2011))。申请人增加使用Amicon 500μl浓缩柱(100kDa cutoff，Millipore)下至100μl/构建体的最终体积的第二个浓缩步骤，以实现更高的病毒滴度。使用用于WPRE的定制Taqman探针(Life Technologies)，通过qRT-PCR执行AAV的滴定。在qRT-PCR之前，用DNA酶I(New England Biolabs)处理浓缩的AAV，以实现仅DNA酶I抗性颗粒的测量。在DNA酶I热失活后，通过蛋白酶K消化(New England Biolabs)降解病毒包膜。基于具有已知WPRE拷贝数的标准曲线计算病毒滴度。
AAV1/2和光学植入物的立体定向注射。所有动物操作均由MIT动物护理委员会(Committee on Animal Care)批准。成年(10-14周龄)雄性C57BL/6N小鼠通过***/赛拉嗪(100mg/kg***和10mg/kg赛拉嗪)的腹膜内(i.p.)注射进行麻醉，并且给予超前镇痛(Buprenex，1mg/kg，i.p.)。根据批准的操作执行开颅术，并且将1μl AAV1/2在0.35/1.94/-2.94(相对于前囟以mm表示的横向、前和下坐标)处注射到ILC内。在相同手术操作期间，将具有纤维的光学插管(Doric Lenses)单侧植入ILC内，其中光导纤维的末端定位相对于前囟0.35/1.94/-2.64处。使用Metabond牙科粘固剂(Parkell Inc)和Jet义齿修复(Langdental)，将插管固定至头盖骨，以构建在其周围的稳定锥体。将切口缝合且施用适当的术后镇痛剂手术后持续三天。
在ILC脑切片上的免疫组织化学。小鼠用致命剂量的***/赛拉嗪麻醉剂进行注射，并且用PBS和4％多聚甲醛(PFA)经心脏灌注。脑另外在4％ PFA中在4℃下固定过夜，并且随后转移至30％蔗糖用于在室温下冷冻保存过夜。随后将脑转移到Tissue-Tek OptimalCutting Temperature(OCT)Compound(Sakura Finetek)内，并且在-80℃下冷冻。18μm切片在低温恒温器(Leica Biosystems)上切割，并且固定到Superfrost Plus玻璃载玻片(Thermo Fischer)上。切片用4％ PFA后固定15分钟，并且如上文对于原代神经元所述的执行免疫组织化学。
光刺激和在ILC中的mRNA水平分析。手术后8天，使用473nm光源(OEM LaserSystems)刺激清醒且自由活动的小鼠，所述光源经由纤维插接电缆和旋转关节连接至光学植入物。刺激参数与用于原代神经元的相同：5mW(总输出)，0.8％工作循环(以0.016Hz的500ms光脉冲)，总共12小时。实验条件包括转导构建体和光刺激在表5中列出。
在光刺激结束后，使用CO2使小鼠实施安乐死，并且前额叶皮层(PFC)在冰上快速解剖，并且在RNA later(Qiagen)中在4℃下温育过夜。200μm切片在RNA later中在4℃下在振动切片机(Leica Biosystems)上切割。切片随后在玻璃盖玻片上在干冰上冷冻，并且病毒转导的ILC在荧光立体显微镜(Leica M165 FC)下鉴定。提取与光导纤维束终点直接垂直定位的ILC的0.35mm直径穿孔(Harris单芯，Ted Pella)。随后使用在50μl Cells-to-CtRNA裂解缓冲液中的无RNA酶团块研棒研磨器(Kimble Chase)，使脑穿孔样品匀浆化，并且如对于原代神经元样品所述执行RNA提取、逆转录和qRT-PCR。
染色质免疫沉淀。神经元或Neuro2a细胞如上所述进行培养且转导或转染。如先前描述的制备ChIP样品(Blecher-Gonen，R.等人High-throughput chromatinimmunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNAinteractions and epigenomic states.Nature protocols 8，539-554(2013))，伴随对于细胞数目和细胞类型的微小调整。细胞以24孔形式收获，以96孔形式洗涤，并且转移至微量离心管用于裂解。样品细胞通过用Biorupter超声处理装置的水浴超声处理直接裂解21分钟，使用30s开/关循环(Diagenode)。qPCR用于评价在靶向基因座处的组蛋白标记的富集。
统计分析。所有实验均用最低限度两次独立的生物重复执行。统计分析用Prism(GraphPad)执行，当比较两种条件时，使用斯氏双尾t检验，当多重样品彼此比较时，使用具有Tukey事后分析的ANOVA，并且当比较多重样品与阴性对照时，使用具有Dunnett事后分析的ANOVA。
实施例11
对实施例10的补充信息：内源哺乳动物转录的光学控制
光刺激硬件-在体外。体外光刺激实验使用定制构建的LED光刺激装置执行。所有电子元件均固定到定制的印刷电路板(ExpressPCB)上。具有峰466nm的蓝色LED(型号#:YSL-R542B5C-A11，China Young Sun LED Technology；由SparkFun Electronics分配为‘LED–超亮蓝(Super Bright Blue)’COM-00529)，以与Corning 24孔板的孔对齐的三个一组排列。LED电流由25mADynaOhm驱动器(LEDdymanics#4006-025)调节。LED阵列的列经由Arduino UNO微控制器板由TTL控制(Fairchild Semiconductor PN2222BU-ND)解决。光输出经由脉冲宽度调控进行调控。光输出从阵列上方80mm的距离进行测量，使用ThorlabsPM100D功率计和S120VC光电二极管检测器。为了提供用于通风的空间且使光场均匀度达到最大，将高80mm的通风间隔物置于LED阵列和24孔样品板之间。风扇(EvercoolEC5015M12CA)沿间隔物单元的一个壁固定，而相对壁构造有间隙以允许增加的气流。
使用ImageJ软件的测定的定量。LIVE/DEAD(Life Technologies)染色的细胞的图像通过荧光显微镜检查进行捕获并且如下加工：扣除本底(加工→扣除本底)。设置基于荧光面积的阈值以确保细胞状态的准确鉴定(图像→调整→阈值)。执行分段分析以允许个别细胞的自动化计数(加工→二元→分水岭)。最后，将碎片信号过滤且计数细胞(分析→分析颗粒)。毒性测定为死细胞的百分比。
化学诱导的TALE。Neuro2A细胞在含有1:1比的OptiMEM(Life Technologies)与具有GlutaMax和丙酮酸钠的高糖DMEM(Life Technologies)的培养基中生长，所述培养基补充有5％ HyClone热灭活的FBS(Thermo Scientific)、1％青霉素/链霉素(LifeTechnologies)和25mM HEPES(Sigma Aldrich)。在转染前18-24小时，将150,000个细胞铺平板到24孔板的每个孔中。根据制造商推荐的方案，用总共1μg构建体DNA(以等摩尔比)/孔和2μL Lipofectamine 2000(Life Technologies)转染细胞。在转染后12小时更换培养基。对于动力学测试，化学诱导在转染后24小时开始，此时脱落酸(ABA，Sigma Aldrich)加入新鲜培养基至250μM的最终浓度。根据制造商的说明书，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取RNA，并且使用qScript(Quanta Biosystems)逆转录1μg RNA/样品。使用对于靶向基因特异性的Taqman探针以及小鼠GAPDH作为内源对照(Life Technologies，关于Taqman探针ID参见补充表2)，通过定量实时PCR(qRT-PCR)测量相对mRNA水平。ΔΔCt分析用于获得相对于其中对细胞实施用GFP的模拟转染的阴性对照的变化倍数。
Cas9转染效应物。在种植到24孔皿内24小时后，使用Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)，用突变型Cas9融合蛋白和合成引导RNA(sgRNA)共转染HEK 293FT细胞。转染后72小时，纯化总RNA(RNeasy Plus，Qiagen)。将1ug RNA逆转录成cDNA(qScript，QuantaBioSciences)。定量实时PCR根据制造商的方案(Life Technologies)完成，并且对于hKlf4(Hs00358836_m1)、hSox2(Hs01053049_s1)和内源对照GAPDH(Hs02758991_g1)，使用TaqMan测定一式三份执行。
将hSpCas9激活物质粒克隆到慢病毒载体内在hEF1a启动子(pLenti-EF1a-Cas9-NLS-VP64)的表达下。将hSpCas9阻遏物质粒克隆到相同载体内(pLenti-EF1a-SID4x-NLS-Cas9-NLS)。靶向KLF4基因座的引导序列(20bp)是：GCGCGCTCCACACAACTCAC、GCAAAAATAGACAATCAGCA、GAAGGATCTCGGCCAATTTG。用于靶向SOX2基因座的引导RNA的间隔物序列是：GCTGCCGGGTTTTGCATGAA、CCGGGCCCGCAGCAAACTTC、GGGGCTGTCAGGGAATAAAT。
光遗传学致动器。微生物和植物衍生的光敏蛋白质已改造为光遗传学致动器，以允许细胞功能的光学控制，所述细胞功能包括膜电位(Deisseroth，K.Optogenetics.Nature methods 8，26-29，doi:10.1038/nmeth.f.324(2011)；Zhang，F.等人The microbial opsin family of optogenetic tools.Cell 147，1446-1457，doi:10.1016/j.cell.2011.12.004(2011)和Yizhar，O.，Fenno，L.E.，Davidson，T.J.，Mogri，M.&Deisseroth，K.Optogenetics in neural systems.Neuron 71，9-34，doi:10.1016/j.neuron.2011.06.004(2011))、细胞内生物化学信号转导(Airan，R.D.，Thompson，K.R.，Fenno，L.E.，Bernstein，H.&Deisseroth，K.Temporally precise in vivo control ofintracellular signalling.Nature 458，1025-1029，doi:10.1038/nature07926(2009))、蛋白质相互作用(Levskaya，A.，Weiner，O.D.，Lim，W.A.&Voigt，C.A.Spatiotemporalcontrol of cell signalling using a light-switchable proteininteraction.Nature 461，997-1001，doi:10.1038/nature08446(2009)；Yazawa，M.，Sadaghiani，A.M.，Hsueh，B.&Dolmetsch，R.E.Induction of protein-proteininteractions in live cells using light.Nat Biotechnol 27，941-945，doi:10.1038/nbt.1569(2009)；Strickland，D.等人TULIPs:tunable，light-controlled interactingprotein tags for cell biology.Nature methods 9，379-384，doi:10.1038/nmeth.1904(2012)和Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of proteininteractions in living cells.Nature methods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010))、以及异源基因表达(Yazawa，M.，Sadaghiani，A.M.，Hsueh，B.&Dolmetsch，R.E.Induction of protein-protein interactions in live cells using light.NatBiotechnol 27，941-945，doi:10.1038/nbt.1569(2009)；Kennedy，M.J.等人Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.Naturemethods 7，973-975，doi:10.1038/nmeth.1524(2010)；Shimizu-Sato，S.，Huq，E.，Tepperman，J.M.&Quail，P.H.Alight-switchable gene promoter system.NatBiotechnol 20，1041-1044，doi:10.1038/nbt734(2002)；Ye，H.，Daoud-El Baba，M.，Peng，R.W.&Fussenegger，M.A synthetic optogenetic transcription device enhancesblood-glucose homeostasis in mice.Science 332，1565-1568，doi:10.1126/science.1203535(2011)；Wang，X.，Chen，X.&Yang，Y.Spatiotemporal control of geneexpression by a light-switchable transgene system.Nature methods 9，266-269，doi:10.1038/nmeth.1892(2012)和Polstein，L.R.&Gersbach，C.A.Light-induciblespatiotemporal control of gene activation by customizable zinc fingertranscription factors.J Am Chem Soc 134，16480-16483，doi:10.1021/ja3065667(2012))。
环境光暴露：所有细胞在除了刺激期间之外的所有时间均在低光水平(<0.01mW/cm2)下进行培养。采取这些防范是因为发现房间中的环境光(0.1-0.2mW/cm2)显著激活LITE***。在体内实验期间不采取专门防范使动物屏蔽光–即使假定在植入的光导纤维内的理想传播，由于环境光在纤维末端处的光透过估计为<0.01mW(基于200μm纤芯直径和0.22数值口径)。
在Neuro2A细胞中的光刺激参数的优化：为了使近UV诱导的细胞毒性降到最低，申请人选择466nm蓝色LED来激活TALE-CRY2，波长轻微地从450nm的CRY2最大吸收红移，但仍维持超过80％活性(Banerjee，R.等人The signaling state of Arabidopsiscryptochrome 2contains flavin semiquinone.J Biol Chem 282，14916-14922，doi:10.1074/jbc.M700616200(2007))(图42)。为了使光暴露降到最低，申请人选择弱刺激方案(以0.067Hz的1s光脉冲，～7％工作循环)。这基于申请人的发现：经过广泛范围的工作循环参数，光工作循环对LITE介导的转录激活没有显著作用(1.7％至100％工作循环，图41)。用从0到10mW/cm2的一系列光强度照明揭示Ngn2 mRNA水平作为直到5mW/cm2的强度的函数增加。然而，在Ngn2 mRNA水平中的增加在10mW/cm2时下降(图36C)，提示更高强度的光可以对LITE功能或细胞生理学具有有害作用。为了更佳地表征该观察，申请人用对于活细胞的钙黄绿素复染剂执行乙啶同源二聚体-1细胞毒性测定，并且发现在10mW/cm2的更高刺激强度时显著更高百分比的乙啶阳性细胞。相反，来自5mW/cm2刺激的乙啶阳性细胞计数与未受刺激的对照无法区分。因此，5mW/cm2看起来对于实现强LITE激活同时维持低细胞毒性是最佳的。
在原代神经元中光诱导的毒性的降低：在神经元中LITE的最初施加揭示培养的神经元对蓝光比Neuro 2a细胞敏感得多。申请人先前对于Neuro 2a细胞优化的刺激参数(466nm，5mW/cm2强度，7％工作循环伴随以0.067Hz的1s光脉冲，总共24小时)在原代神经元中引起>50％毒性。申请人因此测试对于更低工作循环的存活，因为申请人先前已观察到广泛范围的工作循环对LITE介导的转录激活具有很少的作用(图41)。以相同光强度(5mW/cm2)的0.8％降低工作循环(以0.0167Hz的0.5s光脉冲)足以维持高存活率，其与未受刺激的培养物的那种无法区分(图47)。
在体内实验中的光传播和毒性。先前研究已研究不同波长的光在脑组织中的传播效率。对于473nm光(在该研究中使用的波长)，在经过0.35mm组织后存在>90％减弱(Witten，Ilana B.等人Recombinase-Driver Rat Lines:Tools，Techniques，andOptogenetic Application to Dopamine-Mediated Reinforcement.Neuron 72，721-733，doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2011.10.028(2011))。基于0.35mm组织(在该研究中使用的脑穿孔器的直径)的组织深度和5mW的总功率输出，评估预计的5mW/cm2光功率密度。在体内使用的光刺激工作循环与用于原代神经元的那种相同(0.8％，以0.0167Hz0.5s)(图47)。
CRY2吸收光谱。CRY2的吸收光谱的图解显示于图42中。光谱显示在超过480nm的吸收中的急剧下降(Banerjee，R.等人The Signaling State of Arabidopsis Cryptochrome2Contains Flavin Semiquinone.Journal of Biological Chemistry 282，14916-14922，doi:10.1074/jbc.M700616200(2007))。波长>500nm基本上不吸收，这可以用于使用黄光或红光敏感蛋白质的未来多峰光学控制。
AAV1上清液过程的开发。常规AAV颗粒生成需要费力的生产和纯化过程，并且平行测试许多构建体是不实际的(Grieger，J.C.，Choi，V.W.&Samulski，R.J.Production andcharacterization of adeno-associated viral vectors.Nat Protoc 1，1412-1428，doi:10.1038/nprot.2006.207(2006))。在该研究中，简单但高度有效的AAV生产过程使用来自经转染的293FT细胞的过滤上清液(图43)。近期报告指示在293FT细胞中产生的AAV颗粒不仅可以在细胞质中发现其，还可以在培养基中以相当大的量发现(Lock M，A.M.，Vandenberghe LH，Samanta A，Toelen J，Debyser Z，Wilson JM.Rapid，Simple，andVersatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors atScale.Human Gene Therapy 21，1259-1271，doi:10.1089/hum.2010.055(2010))。在宿主细胞的上清液和细胞溶质之间的病毒颗粒比根据AAV血清型而改变，并且如果聚乙烯亚胺(PEI)用于转染病毒包装质粒，则分泌增强(Lock M，A.M.，Vandenberghe LH，Samanta A，Toelen J，Debyser Z，Wilson JM.Rapid，Simple，and Versatile Manufacturing ofRecombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.Human Gene Therapy 21，1259-1271，doi:10.1089/hum.2010.055(2010))。在目前的研究中，发现用携带TALE的AAV载体(图38A)转染且使用AAV1血清型包装的2x105 293FT细胞，能够产生以5.6±0.24x1010DNA酶I抗性基因组拷贝(gc)/mL浓度的250μl AAV1。250μl过滤的上清液能够以80-90％的效率转导150,000个原代皮层神经元(图38B和图43)。该过程还成功适合96孔形式，允许由平行的高达96种不同构建体产生125ul AAV1上清液。35ul上清液随后可以用于转导在96孔形式中培养的原代神经元的一个孔，允许来自单个孔的生物一式三份转导。
表3|关于所有Taqman探针(Life Technologies)的产品信息
表4在该研究中使用的克隆、产品编号和抗体浓度
表5用于CHIP-qPCR的qPCR引物
表6由TALE靶向的基因组序列
5-HTIB TATCTGAACTCTCC
5-HTT TGTCTGTCTTGCAT
Arc TGGCTGTTGCCAGG
BDNF TACCTGGAGCTAGC
c-Fos TACACAGGATGTCC
DNMT3a TTGGCCCTGTGCAG
DNMT3b TAGCGCAGCGATCG
gad65 TATTGCCAAGAGAG
gad67 TGACTGGAACATAC
GR(GCR，NR3C1) TGATGGACTTGTAT
HAT1 TGGACCTTCTCCCT
HCRTR1 TAGGTCTCCTGGAG
HCRTR2 TGGCTCAGGAACTT
HDAC1 TTCTCTAAGCTGCC
HDAC2 TGAGCCCTGGAGGA
HDAC4 TGCCTAAGATGGAG
JMJD2A TGTAGTGAGTGTTC
MCH-R1 TGTCTAGGTGATGT
NET TCTCTGCTAGAAGG
Scnla TCTAGGTCAAGTGT
SIRT1 TCCTCTGCTCCGCT
tet1 TCTAGGAGTGTAGC
tet3 TGCCTGGCTGCTGG
5-HT1B TATCTGAACTCTCC
Grm2 TCAGAGCTGTCCTC
Grm5 TGCAAGAGTAGGAG
5-HT2A TAGTGACTGATTCC
Grin2a TTGGAGGAGCACCA
Neurog2 TGAATGATGATAATAC
。
表7用于小鼠下边缘皮质(ILC)中的体内LITE介导的Grm2激活的病毒转导和光刺激参数。对于三种实验条件，在同侧表达LITE的半球中的Grm2 mRNA水平与对侧表达mCherry的对照半球进行比较。
表8 HDAC召募者效应物结构域。
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表9HDAC效应物结构域。
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表10组蛋白甲基转移酶(HMT)效应物结构域。
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表11组蛋白甲基转移酶(HMT)召募者效应物结构域。
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表12组蛋白甲基转移酶抑制剂效应物结构域。
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补充序列
＞TALE(Ngn2)-NLS-CRY2
＞TALE(Ngn2)-NLS-CRY2PHR
/>
＞CIB1-NLS-VP64_2A_GPP
＞CIBN-NLS-VP64_2A_GFP
＞CIB1-NLS-VP16_2A_GFP
＞CIB1-NLS-p65_2A_GFP
/>
＞＞A-TALE(12聚体)-NLS-VP64_2A_GFP
＞HA-TALE(12聚体)-NLS-SID4X_2A_phiLOV2.1
＞HA-TALE(12聚体)-NLS-CIB1
＞CRY2PHR-NLS-VP64_2A_GFP
＞CRY2PHR-NLS-SID4X_2A__phiLOV2.1
＞TALE(KLF4)-NLS-CRY2PHR
＞HA-NLS-TALE(pll，N136)-SID
/>
＞HA-NLS-TALEtpll，N136)-SID4X
＞HA-TALE(ng2.C63)-GS-cibl-mmNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-wNES-cib1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-mNES-cib1-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-ptk2NES-cib1-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-mapkkNES-cib1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-cib1Δ3-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-wNLS-cib1Δ3-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-mNLS-eib1Δ3-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-cibl-mutNLS-mutHLH
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-wNES-cib1-mutNLS-mutbHLH
＞HA-TALE(ng2，(C63)-GS-cib1Δ1-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-wNLS-cib1Δ1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-cib1Δ2-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-wNES-cib1Δ2-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-NLS-cib1-mutNLS-mutbHLH
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-NLS-cib1Δ1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-NLS-cib1Δ2-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-iNES1-cib1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-iNES2-cib1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-iNES3-cib1-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-iNES4-cib1-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-iNES5-cib1-mutNLS
/>
＞HA-TALE(ng2，C63)-GS-iNES6--cib1-mutNLS
＞HA-TALE(ng2，C63)-NLS-cib1Δ1
＞HA-TALE(ng2，C63)-NLS-cib1Δ2
/>
＞α-输入蛋白-NLS-CRY2PHR-NLS-VP64_2A_GFP
＞mutNES-CRY2PHR-NLs-VP64_2A_GFP
＞CRY2PHR-NLS-VP64-NLS_2A_GFP
＞Neurog2-TALE(N240，C63)-PYL
＞ABI-NLS-VP64
＞bSpCas9(D10A，H840A)-接头-NLS-VP64
＞SID4X-NLS-FLAG-接头-hSpCas9(D10A，H840A)-NLS
/>
外遗传效应物结构域序列
＞hs_NCoR
＞pf_Sir2A
＞nc_DIM5
＞sc_HST2
＞hs_SIRT3
＞hs_NIPP1
＞ct_NUE
＞hs_MBD2b
＞ca_HST2
＞hs_PHF19
＞hs_HDAC11
＞ml_MesoLo4
＞pbcvl_vSET
＞at_KYP
＞tg_TgSET8
＞hs_SIRT6
＞ce_Setl
＞mm_G9a
＞hs_SIRT5
＞x1_HDAC8
＞mm_HP1a
＞at_HDT1
＞mm_SAll
＞hs_SETD8
＞sc_RPD3
/>
＞cc_CobB
＞hs_SUV39H1
＞hs_RCOR1
＞hs_sin3a
＞at_SUVR4
＞rn_MeCP2_NLS
＞mm_SET-TAFIB
＞ce_Set4
光刺激硬件控制脚本
下述Arduino脚本用于允许光刺激的24孔板的每个4孔列的个别控制
/>
/>
/>
/>
实施例12
内源哺乳动物转录的光学控制
为了测试AAV介导的TALE递送用于调控原代小鼠皮层神经元中的转录的功效，申请人构建了靶向三种小鼠神经递质受体的基因组基因座的六个TALE-DNA结合结构域：Grm5、Grin2a和Grm2，其分别编码mGluR5、NMDA亚单位2A和mGluR2(图58)。为了增加靶位点可接近性的可能性，申请人使用来自UCSC基因组浏览器的小鼠皮层DNA酶I敏感性数据，以鉴定假定的开放染色质区。每种靶基因的启动子中的DNA酶I敏感区提供了用于选择TALE结合序列的指导(图46)。对于每种TALE，申请人采用VP64作为转录激活物或mSin3相互作用结构域(SID)的四重串联重复(Beerli，R.R.，Segal，D.J.，Dreier，B.&Barbas，C.F.，3rdToward controlling gene expression at will：specific regulation of the erbB-2/HER-2promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed frommodular building blocks.Proc Natl Acad Sci U S A 95，14628-14633(1998)和Ayer，D.E.，Laherty，C.D.，Lawrence，Q.A.，Armstrong，A.P.&Eisenman，R.N.Mad proteinscontain a dominant transcription repression domain.Molecular and CellularBiology 16，5772-5781(1996))作为阻遏物。申请人先前已显示融合至TALE的单个SID有效下调293FT细胞中的靶基因(Cong，L.，Zhou，R.，Kuo，Y.-c.，Cunniff，M.&Zhang，F.Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules andtranscriptional repressor domains.Nat Commun 3，968(2012))。希望进一步改善该TALE阻遏物，申请人推论SID的四个重复(类似于成功的VP64的四重VP16串联重复体系结构)(Beerli，R.R.，Segal，D.J.，Dreier，B.&Barbas，C.F.，3rd Toward controlling geneexpression at will:specific regulation of the erbB-2/HER-2promoter by usingpolydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks.ProcNatl Acad Sci U S A 95，14628-14633(1998)，可能增大其阻遏活性。事实确实如此，因为TALE-SID4X构建体使293FT细胞中的阻遏超过TALE-SID～2倍(图54)。
申请人发现六种TALE-VP64构建体中的四种(T1、T2、T5和T6)分别使其在AAV转导的原代神经元中的靶基因Grm5和Grm2有效激活高达3和8倍(图58)。类似地，六种TALE-SID4X阻遏物的四种(T9、T10、T11、T12)分别使其内源靶Grin2a和Grm2的表达降低高达2和8倍(图58)。总之，这些结果指示组成性TALE可以正或负调控神经元中的内源靶基因表达。值得注意的是，通过给定TALE的有效激活或阻遏不预测其在相反方向中的转录调控的效率。因此，可能需要筛选多重TALE以鉴定对于特定基因座最有效的TALE。
对于LITE的神经元应用，基于申请人的6种组成性TALE激活物的比较，申请人选择Grm2 TALE(T6)，其显示出在原代神经元中的靶上调的最强水平(图58)。申请人使用具有0.8％的相同工作循环的两个光脉冲频率研究其功能。两种刺激条件均实现Grm2 mRNA水平中的～7倍光依赖性增加(图38C)。进一步的研究证实显著靶基因表达增加可以快速获得(在4小时内4倍上调；图38D)。另外，申请人观察到在刺激后mGluR2蛋白质的显著上调，证实在mRNA水平上由LITE实现的变化转变为蛋白质结构域(图38E)。总之，这些结果证实LITE允许神经元中的内源基因表达的时间精确的光学控制。
作为申请人的先前实现的LITE激活物的致意(compliment)，申请人接下来基于TALE-SID4X构建体改造LITE阻遏物。组成性Grm2 TALE(T11和T12，图59A)介导最高水平的转录阻遏，并且选择作为LITE阻遏物(图59A，B)。两种光诱导的阻遏物均介导Grm2表达的显著下调，对于T11和T12分别为1.95倍和1.75倍降低，证实神经元中光学控制的阻遏的可行性(图38G)。
为了使用AAV将LITE递送到神经元内，申请人必须确保其中包括LITE转基因的总病毒基因组大小不超过4.8kb(Wu，Z.，Yang，H.&Colosi，P.Effect of Genome Size on AAVVector Packaging.Mol Ther 18，80-86(2009)和Dong JY，F.P.，Frizzell RAQuantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.Human Gene Therapy 7，2101-2112(1996))。为此，申请人缩短TALE N和C末端(保留在N末端中的136aa和在C末端中的63aa)，并且交换CRY2PHR和CIB1结构域(TALE-CIB1和CRY2PHR-VP64；图38A)。该交换允许LITE的每种组分配合到AAV载体内，并且不降低光介导的转录调控的功效(图60)。通过两种AAV载体的组合，经由共转导可以将这些LITE有效递送到原代皮层神经元内(图38B；对于具有＞80％共转导效率的个别组分为83-92％的递送效率)。
实施例13
诱导慢病毒Cas9
慢病毒制备。在克隆pCasES10(其含有慢病毒转移质粒主链)后，在具有10％胎牛血清和不含抗生素的DMEM中转染前，处于低传代(p＝5)的HEK293FT在T-75烧瓶中种植至50％汇合。在20小时后，将培养基更换为OptiMEM(无血清)培养基，并且转染在4小时后完成。细胞用10ug慢病毒转移质粒(pCasES10)和下述包装质粒进行转染：5ug pMD2.G(VSV-g假型)和7.5ug psPAX2(gag/pol/rev/tat)。转染在具有阳离子脂质递送试剂(50uLLipofectamine 2000和100ul Plus试剂)的4mL OptiMEM中完成。在6小时后，将培养基更换为具有10％胎牛血清的无抗生素DMEM。
慢病毒纯化。在48小时后收获病毒上清液。上清液首先清除碎片且通过0.45um低蛋白质结合(PVDF)滤器过滤。它们随后在超速离心机中以24,000rpm旋转2小时。将病毒团块重悬浮于50ul DMEM中在4℃下过夜。它们随后进行等分且立即在-80℃下冷冻。
使用FACS的克隆分离。对于HEK293FT和HUES64人胚胎干细胞的克隆分离，细胞在具有1ul或5ul纯化病毒的悬浮液中感染。感染后二十四小时，将1uM强力霉素加入细胞培养基中。在多24或48小时后，细胞在BD FACSAria IIu仪器上经历荧光辅助细胞分选(FACS)，以分离在强力霉素处理后强表达EGFP(和因此Cas9)的单一细胞。细胞批量铺平板或铺平板到个别孔内，以允许用整合的诱导Cas9选择克隆群体用于进一步使用。分选效率始终>95％，并且在种植后立即显现细胞，以验证EGFP荧光。
图61描述Tet Cas9载体设计
图62描述在293FT细胞中的载体和EGFP表达。
pCasES020诱导Cas9的序列：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
1.改变细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其包括：
(a)使所述基因组基因座与包含脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽的非天然存在或经改造的组合物接触，所述脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
(b)施加所述能源；和
(c)测定所述基因组基因座的表达是改变的。
2.根据段落1的方法，其中所述至少一种或多种效应物结构域选自转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录-蛋白质召募结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域和抗体呈现结构域。
3.根据段落2的方法，其中所述至少一种或多种效应物结构域是核酸酶结构域或重组酶结构域。
4.根据段落3的方法，其中所述核酸酶结构域是非特异性FokI核酸内切酶催化结构域。
5.根据段落1-4中任一项的方法，其中所述能量敏感蛋白质是隐花色素-2(CRY2)。
6.根据段落1-5中任一项的方法，其中所述相互作用配偶体是隐花色素相互作用碱性螺旋-环-螺旋(CIB1)。
7.根据段落1-6中任一项的方法，其中所述能源选自：电磁辐射、声能或热能。
8.根据段落7的方法，其中所述电磁辐射是可见光的组分。
9.根据段落8的方法，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
10.根据段落8的方法，其中所述可见光的组分是蓝光。
11.根据段落1的方法，其中所述施加能源包括用强度至少6.2mW/cm2的蓝光刺激。
12.根据段落1-11中任一项的方法，其中所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，和
其中至少一个RVD选自NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA和NC，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
13.根据段落12的方法，其中z是至少10-26。
14.根据段落12的方法，其中
X1-11中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸1-11所示的12个邻接氨基酸的序列，或者
X 14-34或X14-35中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸12-32或12-33所示的21或22个邻接氨基酸的序列。
15.根据段落12的方法，其中所述至少一个RVD选自(a)用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS；(b)用于识别腺嘌呤(A)的SI；(c)用于识别胸腺嘧啶(T)的HG、KG、RG；(d)用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD；(e)用于识别A或G的NV；以及(f)用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
16.根据段落15的方法，其中
用于识别G的RVD是RN、NH、RH或KH；或者
用于识别A的RVD是SI；或者
用于识别T的RVD是KG或RG；和
用于识别C的RVD是SD或RD。
17.根据段落12的方法，其中存在下述中的至少一个
在X1-4处的[LTLD]或[LTLA]或[LTQV]，或者
在位置X30-33或X31-34或X32-35处的[EQHG]或[RDHG]。
18.根据段落1-17中任一项的方法，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
19.根据段落1-18中任一项的方法，其中所述目的基因组基因座与编码下述的基因相关：分化因子、转录因子、神经递质转运蛋白、神经递质合酶、突触蛋白质、可塑性蛋白质、突触前活性区带蛋白质、突触后密度蛋白质、神经递质受体、外遗传改性剂、神经命运规范因子、轴突导向分子、离子通道、CpG结合蛋白、泛素化蛋白质、激素、同源框蛋白质、生长因子、癌基因或原癌基因。
20.抑制细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其包括：
(a)使所述基因组基因座与包含DNA结合多肽的非天然存在或经改造的组合物接触，所述DNA结合多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
(b)施加所述能源；和
(c)测定所述基因组基因座的表达是阻遏的。
21.根据段落20的方法，其中所述多肽包括至少一个SID阻遏物结构域。
21.根据段落21的方法，其中所述多肽包括至少四个SID阻遏物结构域。
23.根据段落21的方法，其中所述多肽包括SID4X阻遏物结构域。
24.根据段落20的方法，其中所述多肽包括KRAB阻遏物结构域。
25.根据段落20-24中任一项的方法，其中所述能量敏感蛋白质是隐花色素-2(CRY2)。
26.根据段落20-25中任一项的方法，其中所述相互作用配偶体是隐花色素相互作用碱性螺旋-环-螺旋(CIB1)。
27.根据段落20-26中任一项的方法，其中所述能源选自：电磁辐射、声能或热能。
28.根据段落20的方法，其中所述电磁辐射是可见光的组分。
29.根据段落28的方法，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
30.根据段落28的方法，其中所述可见光的组分是蓝光。
31.根据段落20的方法，其中所述施加能源包括用强度至少6.2mW/cm2的蓝光刺激。
32.根据段落20-31的方法，其中所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，和
其中至少一个RVD选自NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA和NC，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
33.根据段落32的方法，其中z是至少10-26。
34.根据段落32的方法，其中
X1-11中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸1-11所示的11个邻接氨基酸的序列，或者
X 14-34或X14-35中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸12-32或12-33所示的21或22个邻接氨基酸的序列。
35.根据段落20-34中任一项的方法，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
36.根据段落20-35中任一项的方法，其中所述目的基因组基因座是与编码分化因子或离子通道的组分的基因相关的基因组基因座。
37.根据段落36的方法，其中所述分化因子是SRY-box-2(SOX2)，并且由基因SOX2编码。
38.根据段落36的方法，其中所述分化因子是p11，并且由基因p11编码。
39.根据段落36的方法，其中所述离子通道的组分是CACNA1C，并且由基因CACNA1C编码。
40.激活细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其包括：
(a)使所述基因组基因座与包含DNA结合多肽的非天然存在或经改造的组合物接触，所述DNA结合多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个TALE单体和至少一个或多个半单体，或者
至少一种或多种激活物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和
(ii)包含与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种激活物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
(b)施加所述能源；和
(c)测定所述基因组基因座的表达是激活的。
41.根据段落40的方法，其中所述多肽包括至少一个VP16或VP64激活物结构域。
42.根据段落40的方法，其中所述多肽包括至少一个p65激活物结构域。
43.根据段落40-42中任一项的方法，其中所述能量敏感蛋白质是CRY2。
44.根据段落40-43中任一项的方法，其中所述相互作用配偶体是CIB1。
45.根据段落40的方法，其中所述能源选自：电磁辐射、声能或热能。
46.根据段落45的方法，其中所述电磁辐射是可见光的组分。
47.根据段落46的方法，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
48.根据段落46的方法，其中所述可见光的组分是蓝光。
49.根据段落40的方法，其中所述施加能源包括用强度至少6.2mW/cm2的蓝光刺激。
50.根据段落40-49中任一项的方法，其中所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，和
其中至少一个RVD选自NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA和NC，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
51.根据段落50的方法，其中z是至少10-26。
52.根据段落50的方法，其中
X1-11中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸1-11所示的11个邻接氨基酸的序列，或者
X 14-34或X14-35中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸12-32或12-33所示的21或22个邻接氨基酸的序列。
53.根据段落40-52中任一项的方法，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
54.根据段落40-53中任一项的方法，其中所述目的基因组基因座是与编码分化因子、外遗传调节物或离子通道的组分的基因相关的基因组基因座。
55.根据段落54的方法，其中所述分化因子是Neurogenin-2，并且由基因NEUROG2编码。
56.根据段落54的方法，其中所述分化因子是Kreuppel样因子4，并且由基因KLF-4编码。
57.根据段落54的方法，其中所述外遗传调节物是Tet甲基胞嘧啶双加氧酶1，并且由基因tet-1编码。
58.根据段落54的方法，其中所述离子通道的组分是CACNA1C，并且由基因CACNA1C编码。
59.用于诱导改变细胞中的基因组基因座表达的非天然存在或经改造的组合物，其中所述组合物包含DNA结合多肽，其包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
其中所述多肽由密码子优化的核酸分子编码且翻译，从而使得所述多肽优先结合所述基因组基因座的DNA，和
其中所述多肽在施加所述能源后改变所述基因组基因座的表达。
60.根据段落1的组合物，其中所述至少一种或多种效应物结构域选自转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录-蛋白质召募结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域和抗体呈现结构域。
61.根据段落59的组合物，其中所述至少一种或多种效应物结构域是核酸酶结构域或重组酶结构域。
62.根据段落61的组合物，其中所述核酸酶结构域是非特异性FokI核酸内切酶催化结构域。
63.根据段落59-62中任一项的组合物，其中所述能量敏感蛋白质是隐花色素-2(CRY2)。
64.根据段落59-63中任一项的组合物，其中所述相互作用配偶体是隐花色素相互作用碱性螺旋-环-螺旋(CIB1)。
65.根据段落59-64中任一项的组合物，其中所述能源选自：电磁辐射、声能或热能。
66.根据段落65的组合物，其中所述电磁辐射是可见光的组分。
67.根据段落66的组合物，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
68.根据段落66的组合物，其中所述可见光的组分是蓝光。
69.根据段落59的组合物，其中所述施加能源包括用强度至少6.2mW/cm2的蓝光刺激。
70.根据段落59-69中任一项的组合物，其中所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，和
其中至少一个RVD选自NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA和NC，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
71.根据段落70的组合物，其中z是至少10-26。
72.根据段落70的组合物，其中
X1-11中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸1-11所示的12个邻接氨基酸的序列，或者
X14-34或X14-35中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸12-32或12-33所示的21或22个邻接氨基酸的序列。
73.根据段落70的组合物，其中所述至少一个RVD选自(a)用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS；(b)用于识别腺嘌呤(A)的SI；(c)用于识别胸腺嘧啶(T)的HG、KG、RG；(d)用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD；(e)用于识别A或G的NV；以及(f)用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
74.根据段落73的组合物，其中
用于识别G的RVD是RN、NH、RH或KH；或者
用于识别A的RVD是SI；或者
用于识别T的RVD是KG或RG；和
用于识别C的RVD是SD或RD。
75.根据段落70的组合物，其中存在下述中的至少一个
在X1-4处的[LTLD]或[LTLA]或[LTQV]，或者
在位置X30-33或X31-34或X32-35处的[EQHG]或[RDHG]。
76.根据段落59-75中任一项的组合物，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
77.根据段落59-76中任一项的组合物，其中所述目的基因组基因座与编码下述的基因相关：分化因子、转录因子、神经递质转运蛋白、神经递质合酶、突触蛋白质、可塑性蛋白质、突触前活性区带蛋白质、突触后密度蛋白质、神经递质受体、外遗传改性剂、神经命运规范因子、轴突导向分子、离子通道、CpG结合蛋白、泛素化蛋白质、激素、同源框蛋白质、生长因子、癌基因或原癌基因。
78.用于诱导阻遏细胞中的基因组基因座表达的非天然存在或经改造的组合物，其中所述组合物包含DNA结合多肽，其包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种阻遏物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种阻遏物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
其中所述多肽由密码子优化的核酸分子编码且表达，从而使得所述多肽优先结合所述基因组基因座的DNA，和
其中所述多肽在施加所述能源后阻遏所述基因组基因座的表达。
79.根据段落78的组合物，其中所述多肽包括至少一个SID阻遏物结构域。
80.根据段落79的组合物，其中所述多肽包括至少四个SID阻遏物结构域。
81.根据段落78的组合物，其中所述多肽包括SID4X阻遏物结构域。
82.根据段落78的组合物，其中所述多肽包括KRAB阻遏物结构域。
83.根据段落78-82中任一项的组合物，其中所述能量敏感蛋白质是隐花色素-2(CRY2)。
84.根据段落78-83中任一项的组合物，其中所述相互作用配偶体是隐花色素相互作用碱性螺旋-环-螺旋(CIB1)。
85.根据段落78-84中任一项的组合物，其中所述能源选自：电磁辐射、声能或热能。
86.根据段落78的组合物，其中所述电磁辐射是可见光的组分。
87.根据段落86的组合物，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
88.根据段落86的组合物，其中所述可见光的组分是蓝光。
89.根据段落78的组合物，其中所述施加能源包括用强度至少6.2mW/cm2的蓝光刺激。
90.根据段落78-89中任一项的组合物，其中所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，和
其中至少一个RVD选自NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA和NC，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
91.根据段落90的组合物，其中z是至少10-26。
92.根据段落90的组合物，其中
X1-11中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸1-11所示的11个邻接氨基酸的序列，或者
X14-34或X14-35中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸12-32或12-33所示的21或22个邻接氨基酸的序列。
93.根据段落78-92中任一项的组合物，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
94.根据段落78-93中任一项的组合物，其中所述目的基因组基因座是与编码分化因子或离子通道的组分的基因相关的基因组基因座。
95.根据段落94的组合物，其中所述分化因子是SRY-box-2(SOX2)，并且由基因SOX2编码。
96.根据段落94的组合物，其中所述分化因子是p11，并且由基因p11编码。
97.根据段落95的组合物，其中所述离子通道的组分是CACNA1C，并且由基因CACNA1C编码。
98.用于诱导激活细胞中的目的基因组基因座表达的非天然存在或经改造的组合物，其中所述组合物包含DNA结合多肽，所述多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
其中所述多肽由密码子优化的核酸分子编码且表达，从而使得所述多肽优先结合所述基因组基因座的DNA，和
其中所述多肽在施加所述能源后激活所述基因组基因座的表达。
99.根据段落98的组合物，其中所述多肽包括至少一个VP16或VP64激活物结构域。
100.根据段落98的组合物，其中所述多肽包括至少一个p65激活物结构域。
101.根据段落98-100中任一项的组合物，其中所述能量敏感蛋白质是CRY2。
102.根据段落98-101中任一项的组合物，其中所述相互作用配偶体是CIB1。
103.根据段落98的组合物，其中所述能源选自：电磁辐射、声能或热能。
104.根据段落103的组合物，其中所述电磁辐射是可见光的组分。
105.根据段落104的组合物，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
106.根据段落104的组合物，其中所述可见光的组分是蓝光。
107.根据段落98的组合物，其中所述施加能源包括用强度至少6.2mW/cm2的蓝光刺激。
108.根据段落98-107中任一项的组合物，其中所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，和
其中至少一个RVD选自NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NA和NC，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
109.根据段落108的组合物，其中z是至少10-26。
110.根据段落108的组合物，其中
X1-11中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸1-11所示的11个邻接氨基酸的序列，或者
X 14-34或X14-35中的至少一个是如图9的序列(X1-11-X14-34或X1-11-X14-35)中的氨基酸12-32或12-33所示的21或22个邻接氨基酸的序列。
111.根据段落98-110中任一项的组合物，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
112.根据段落98-111中任一项的组合物，其中所述目的基因组基因座是与编码分化因子、外遗传调节物、离子通道的组分或阻遏物的基因相关的基因组基因座。
113.根据段落112的组合物，其中所述分化因子是Neurogenin-2，并且由基因NEUROG2编码。
114.根据段落112的组合物，其中所述分化因子是Kreuppel样因子4，并且由基因KLF-4编码。
115.根据段落112的组合物，其中所述外遗传调节物是Tet甲基胞嘧啶双加氧酶1，并且由基因tet-1编码。
116.根据段落112的组合物，其中所述离子通道的组分是CACNA1C，并且由基因CACNA1C编码。
117.根据段落112的组合物，其中所述阻遏物是促代谢性谷氨酸受体，并且由基因mGlur2编码。
118.根据段落98-117中任一项的组合物，其中所述表达是化学诱导的。
119.根据段落118的组合物，其中所述化学诱导表达***是由4-羟基他莫昔芬(4OHT)诱导的基于***(ER)的***。
120.根据段落119的组合物，其中所述组合物进一步包含出核转运信号(NES)。
121.段落120的组合物，其中所述NES具有LDLASLIL的序列。
122.编码根据段落98-121中任一项的组合物的核酸。
123.段落122的核酸，其中所述核酸包含启动子。
124.根据段落123的核酸，其中所述启动子是人突触蛋白I启动子(hSyn)。
125.根据段落122-124中任一项的核酸，其中所述核酸包装成腺相关病毒载体(AAV)。
126.改变目的基因组基因座表达的诱导方法，其包括：
(a)使所述基因组基因座与包含DNA结合多肽的非天然存在或经改造的组合物接触，所述DNA结合多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
(b)施加所述能源；和
(c)测定所述基因组基因座的表达是改变的。
127.用于诱导改变基因组基因座表达的非天然存在或经改造的组合物，其中所述组合物包含DNA结合多肽，其包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，
其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合；
其中所述多肽优先结合所述基因组基因座的DNA，和
其中所述多肽在施加所述能源后改变所述基因组基因座的表达。
128.用于干扰细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其包括：
(a)使所述基因组基因座与包含脱氧核糖核酸(DNA)结合多肽的非天然存在或经改造的组合物接触；
(b)施加诱导物来源；和
(c)确定干扰所述基因组基因座的表达已发生。
129.段落128的方法，其中干扰表达是改变表达(上或下)，改变表达结果(例如用核酸酶)或消除表达转变，例如改变对依赖选项的表达。
130.段落128或129的方法，其中所述诱导物来源是能源(例如波或热)或小分子。
131.段落126-130中任一项的方法，其中所述DNA结合多肽包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因组基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过能源诱导后与相互作用配偶体结合。
132.用于干扰细胞中的目的基因组基因座表达的诱导方法，其包括：
(a)使所述基因组基因座与载体***接触，所述载体***包含一种或多种载体，所述载体包含
I.与CRISPR/Cas***嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列可操作地连接的第一调节元件，其中所述多核苷酸序列包含
(a)能够与真核细胞中的靶序列杂交的引导序列，
(b)tracr匹配序列，和
(c)tracr序列，以及
II.与编码CRISPR酶的酶编码序列可操作地连接的第二调节诱导元件，其包含至少一种或多种核定位序列，
其中(a)、(b)和(c)以5'至3'方向排列，
其中组分I和II位于所述***的相同或不同载体上，
其中当转录时，所述tracr匹配序列与tracr序列杂交，并且所述引导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合，和
其中所述CRISPR复合物包含与下述复合的CRISPR酶：(1)与靶序列杂交的引导序列，和(2)与tracr序列杂交的tracr匹配序列，
其中编码所述CRISPR酶的所述酶编码序列进一步编码异源功能结构域；
(b)施加诱导物来源；和
(c)确定干扰所述基因组基因座的表达已发生。
133.段落138的方法，其中干扰表达是改变表达(上或下)，改变表达结果(例如用核酸酶)或消除表达转变，例如改变对依赖选项的表达。
134.段落132或133的方法，其中所述诱导物来源是化学品。
135.段落132-134中任一项的方法，其中所述载体是慢病毒。
136.段落132-135中任一项的方法，其中所述第二调节诱导元件包含四环素依赖性调节***。
137.段落132-135中任一项的方法，其中所述第二调节诱导元件包含cumate基因开关***。
138.段落1-137中任一项的组合物、核酸或方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
139.段落138的组合物、核酸或方法，其中所述真核细胞是动物细胞。
140.段落139的组合物、核酸或方法，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
本发明还涉及下述方案：
1.一种非天然存在或经改造的TALE或CRISPR-Cas***，其包含至少一种开关，其中所述TALE或CRISPR-Cas***的活性通过与关于开关的至少一种诱导物能源接触而加以控制。
2.根据方案1的***，其中关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性得到激活、增强、终止或阻遏。
3.根据前述方案中任一项的***，其中与所述至少一种诱导物能源的接触导致第一效应和第二效应。
4.根据方案3的***，其中所述第一效应是入核转运、出核转运、次级组分(例如效应物分子)的召募、(蛋白质、DNA或RNA的)构象变化、切割、货物(例如笼装分子或辅因子)释放、结合或解离中的一种或多种。
5.根据方案3的***，其中所述第二效应是关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性的激活、增强、终止或阻遏中的一种或多种。
6.根据方案3-5中任一项的***，其中所述第一效应和所述第二效应级联发生。
7.根据前述方案中任一项的***，其中所述TALE或CRISPR-Cas***进一步包含至少一种核定位信号(NLS)、出核转运信号(NES)、功能结构域、弹性接头、突变、缺失、改变或截短。
8.根据方案7的***，其中所述NLS、NES或功能结构域中的一种或多种有条件地激活或失活。
9.根据方案7的***，其中所述突变是转录因子同源区中的突变、DNA结合结构域中的突变(例如碱性螺旋环螺旋的碱性残基突变)、内源NLS中的突变或内源NES中的突变的一种或多种。
10.根据前述方案中任一项的***，其中所述诱导物能源是热、超声、电磁能或化学品。
11.根据前述方案中任一项的***，其中所述诱导物能源是抗生素、小分子、激素、激素衍生物、类固醇或类固醇衍生物。
12.根据前述方案中任一项的***，其中所述诱导物能源是脱落酸(ABA)、多西环素(DOX)、cumate、雷帕霉素、4-羟基他莫昔芬(4OHT)、***或蜕皮激素。
13.根据前述方案中任一项的***，其中所述至少一种开关选自基于抗生素的诱导***、基于电磁能的诱导***、基于小分子的诱导***、基于核受体的诱导***和基于激素的诱导***。
14.根据前述方案中任一项的***，其中所述至少一种开关选自四环素(Tet)/DOX诱导***、光诱导***、ABA诱导***、cumate阻遏物/操纵子***、4OHT/***诱导***、基于蜕皮激素的诱导***和FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导***。
15.根据方案10的***，其中所述诱导物能源是电磁能。
16.根据方案15的***，其中所述电磁能是可见光的组分。
17.根据方案16的***，其中所述所述可见光的组分具有在450nm-700nm范围内的波长。
18.根据方案17的***，其中所述所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
19.根据方案18的***，其中所述可见光的组分是蓝光。
20.根据方案19的***，其中所述蓝光具有至少0.2mW/cm2的强度。
21.根据方案19的***，其中所述蓝光具有至少4mW/cm2的强度。
22.根据方案17的***，其中所述所述可见光的组分具有在620-700nm范围内的波长。
23.根据方案22的***，其中所述可见光的组分是红光。
24.根据方案7的***，其中所述至少一种功能结构域选自：转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA羟甲基化酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录调节蛋白(或转录复合物召募)结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域、抗体呈现结构域、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰酶的召募者；组蛋白修饰酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、组蛋白激酶、组蛋白磷酸酶、组蛋白核糖基酶、组蛋白脱核糖基酶、组蛋白泛素酶、组蛋白去泛素酶、组蛋白生物素酶和组蛋白尾部蛋白酶的抑制剂。
25.前述方案中任一项的***用于干扰目的基因组或表观基因组基因座的用途。
26.方案1-24中任一项的***用于制备药物组合物的用途。
27.一种控制非天然存在或经改造的TALE或CRISPR-Cas***的方法，其包括提供包含至少一种开关的所述TALE或CRISPR-Cas***，其中所述TALE或CRISPR-Cas***的活性通过与关于开关的至少一种诱导物能源接触而加以控制。
28.根据方案27的方法，其中关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性得到激活、增强、终止或阻遏。
29.根据方案27或28的方法，其中与所述至少一种诱导物能源的接触导致第一效应和第二效应。
30.根据方案29的方法，其中所述第一效应是入核转运、出核转运、次级组分(例如效应物分子)的召募、(蛋白质、DNA或RNA的)构象变化、切割、货物(例如笼装分子或辅因子)释放、结合或解离中的一种或多种。
31.根据方案29的方法，其中所述第二效应是关于至少一种开关的控制或者所述TALE或CRISPR-Cas***的活性的激活、增强、终止或阻遏中的一种或多种。
32.根据方案29-31中任一项的方法，其中所述第一效应和所述第二效应级联发生。
33.根据方案27-32中任一项的方法，其中所述TALE或CRISPR-Cas***进一步包含至少一种核定位信号(NLS)、出核转运信号(NES)、功能结构域、弹性接头、突变、缺失、改变或截短。
34.根据方案33的方法，其中所述NLS、NES或功能结构域中的一种或多种有条件地激活或失活。
35.根据方案33的方法，其中所述突变是转录因子同源区中的突变、DNA结合结构域中的突变(例如使碱性螺旋环螺旋的碱性残基突变)、内源NLS中的突变或内源NES中的突变的一种或多种。
36.根据方案27-35中任一项的方法，其中所述诱导物能源是热、超声、电磁能或化学品。
37.根据方案27-36中任一项的方法，其中所述诱导物能源是抗生素、小分子、激素、激素衍生物、类固醇或类固醇衍生物。
38.根据方案27-37中任一项的方法，其中所述诱导物能源是脱落酸(ABA)、多西环素(DOX)、cumate、雷帕霉素、4-羟基他莫昔芬(4OHT)、***或蜕皮激素。
39.根据方案27-38中任一项的方法，其中所述至少一种开关选自基于抗生素的诱导***、基于电磁能的诱导***、基于小分子的诱导***、基于核受体的诱导***和基于激素的诱导***。
40.根据方案27-39中任一项的方法，其中所述至少一种开关选自四环素(Tet)/DOX诱导***、光诱导***、ABA诱导***、cumate阻遏物/操纵子***、4OHT/***诱导***、基于蜕皮激素的诱导***和FKBP12/FRAP(FKBP12-雷帕霉素复合物)诱导***。
41.根据方案36的方法，其中所述诱导物能源是电磁能。
42.根据方案41的方法，其中所述电磁能是可见光的组分。
43.根据方案42的方法，其中所述可见光的组分具有在450nm-700nm范围内的波长。
44.根据方案43的方法，其中所述可见光的组分具有在450nm-500nm范围内的波长。
45.根据方案44的方法，其中所述可见光的组分是蓝光。
46.根据方案45的方法，其中所述蓝光具有至少0.2mW/cm2的强度。
47.根据方案45的方法，其中所述蓝光具有至少4mW/cm2的强度。
48.根据方案43的方法，其中所述所述可见光的组分具有在620-700nm范围内的波长。
49.根据方案48的方法，其中所述可见光的组分是红光。
50.根据方案33的方法，其中所述至少一种功能结构域选自：转座酶结构域、整合酶结构域、重组酶结构域、解离酶结构域、转化酶结构域、蛋白酶结构域、DNA甲基转移酶结构域、DNA羟甲基化酶结构域、DNA脱甲基酶结构域、组蛋白乙酰化酶结构域、组蛋白脱乙酰基酶结构域、核酸酶结构域、阻遏物结构域、激活物结构域、核定位信号结构域、转录调节蛋白(或转录复合物召募)结构域、细胞摄取活性相关结构域、核酸结合结构域、抗体呈现结构域、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰酶的召募者；组蛋白修饰酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、组蛋白激酶、组蛋白磷酸酶、组蛋白核糖基酶、组蛋白脱核糖基酶、组蛋白泛素酶、组蛋白去泛素酶、组蛋白生物素酶和组蛋白尾部蛋白酶的抑制剂。
51.根据前述方案中任一项的***或方法，其中所述TALE***包含DNA结合多肽，其包含：
(i)与能量敏感蛋白质或其片段连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因座的至少五个或更多个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，或者至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过诱导物能源诱导后经历构象变化，允许其结合相互作用配偶体，和/或
(ii)与相互作用配偶体连接的DNA结合结构域，其包含特别排序以靶向目的基因座的至少一个或多个TALE单体或半单体，或者
至少一种或多种效应物结构域，其中所述能量敏感蛋白质或其片段在通过诱导物能源诱导后与相互作用配偶体结合。
52.方案51的***或方法，其中所述DNA结合多肽包含
(a)N末端封盖区，
(b)包含特别排序以靶向目的基因座的至少5-40个转录激活物样效应物(TALE)单体和至少一个或多个半单体，和
(c)C末端封盖区，
其中(a)、(b)和(c)以预定N末端至C末端取向排列，
其中所述基因组基因座包含靶DNA序列5′-T0N1N2…Nz Nz+1 -3′，其中T0和N＝A、G、T或C，
其中所述靶DNA序列与所述DNA结合结构域结合，并且所述DNA结合结构域包含(X1-11-X12X13-X14-33或34或35)z，
其中X1-11是11个邻接氨基酸的链，
其中X12X13是重复可变双残基(RVD)，
其中X14-33或34或35是21、22或23个邻接氨基酸的链，
其中z是至少5-40，其中所述多肽由密码子优化的核酸分子编码且翻译，从而使得所述多肽优先与所述目的基因座的DNA结合。
53.方案52的***或方法，其中
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的147个邻接氨基酸，或
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的68个邻接氨基酸，或
N末端封盖区或其片段包含野生型N末端封盖区的136个邻接氨基酸，和
C末端封盖区或其片段包含野生型C末端封盖区的183个邻接氨基酸。
54.方案52的***或方法，其中至少一个RVD选自(a)用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN；(b)用于识别腺嘌呤(A)的NI、KI、RI、HI、SI；(c)用于识别胸腺嘧啶(T)的NG、HG、KG、RG；(d)用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD、HD、ND、KD、YG；(e)用于识别A或G的NV、HN；以及(f)用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
55.方案54的***或方法，其中至少一个RVD选自(a)用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS；(b)用于识别腺嘌呤(A)的SI；(c)用于识别胸腺嘧啶(T)的HG、KG、RG；(d)用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD；(e)用于识别A或G的NV、HN以及(f)用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)意指在X13处的氨基酸不存在。
56.方案55的***或方法，其中
用于识别G的RVD是RN、NH、RH或KH；或者
用于识别A的RVD是SI；或者
用于识别T的RVD是KG或RG；和
用于识别C的RVD是SD或RD。
57.方案52的***或方法，其中存在下述中的至少一个
在X1-4处的[LTLD]或[LTLA]或[LTQV]，或者
在位置X30-33或X31-34或X32-35处的[EQHG]或[RDHG]。
58.根据方案51-57中任一项的***或方法，其中所述TALE***包装成AAV或慢病毒载体。
59.根据方案1-50中任一项的***或方法，其中所述CRISPR***包含载体***，其包含：
a)与靶向目的基因座的CRISPR-Cas***引导RNA可操作地连接的第一调节元件，
b)与Cas蛋白质可操作地连接的第二调节诱导元件，
其中组分(a)和(b)位于所述***的相同或不同载体上，
其中所述引导RNA靶向目的基因座的DNA，其中所述Cas蛋白质和所述引导RNA并非天然一起出现。
60.根据方案59的***或方法，其中所述Cas蛋白质是Cas9酶。
61.根据方案59或60的***或方法，其中所述载体是AAV或慢病毒。
***
已详细描述了本发明的优选实施方案，应当理解由上述段落限定的本发明并不限于上文说明书中所示的具体细节，因为其许多显而易见的变化是可能的，而不背离本发明的精神或范围。

Claims (30)

1.CRISPR-Cas复合物，包含：
-Cas9，其中所述Cas9包含两个或更多个核定位信号；
-与tracr匹配序列连接的引导序列，和
-能够与tracr匹配序列的全部或一部分杂交的tracr序列；
其中所述引导序列被设计为与真核细胞中的靶序列具有互补性并能够指导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。
2.CRISPR-Cas载体***，包括：
(a)第一调节元件，其与编码下列序列的一个或更多个序列可操作地连接：(1)与tracr匹配序列连接的引导序列，和(2)能够与tracr匹配序列的全部或一部分杂交的tracr序列；
(b)第二调节元件，其与编码Cas9的序列可操作地连接，其中所述Cas9包含两个或更多个核定位信号；
其中组分(a)和(b)位于所述***的相同或不同载体上，并且其中所述引导序列被设计为与真核细胞中的靶序列具有互补性。
3.根据权利要求2的CRISPR-Cas载体***，其中编码Cas9的序列对于在真核细胞中的表达进行密码子优化。
4.根据权利要求2的CRISPR-Cas载体***，其包含两个或更多个引导序列。
5.根据权利要求2的CRISPR-Cas载体***，其中所述相同或不同载体是一个或更多个病毒载体。
6.根据权利要求5的CRISPR-Cas载体***，其中所述一个或更多个病毒载体是一个或更多个逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、甲病毒或单纯疱疹病毒。
7.根据权利要求2的CRISPR-Cas载体***，其中组分(a)和(b)位于相同载体上。
8.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中所述核定位信号独立地选自PKKKRKV(SEQ ID NO:1)、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:2)、PAAKRVKLD(SEQ ID NO:3)、RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:4)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:5)、RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:6)、VSRKRPRP(SEQ ID NO:7)、PPKKARED(SEQ ID NO:8)、POPKKKPL(SEQ ID NO:9)、SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:10)、DRLRR(SEQ ID NO:11)、PKQKKRK(SEQ ID NO:12)、RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:13)、REKKKFLKRR(SEQ ID NO:14)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ IDNO:15)和RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:16)。
9.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中至少一个核定位信号是PKKKRKV(SEQ ID NO:1)。
10.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中Cas9在氨基端包括至少一个核定位信号，并且在羧基端包括至少一个核定位信号。
11.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中Cas9指导含有靶序列的靶多核苷酸的两条链的切割。
12.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中Cas9包含催化结构域中的至少一个突变；优选其中所述突变选自D10A、H840A、N854A或N863A。
13.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中Cas9是酿脓链球菌Cas9。
14.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中Cas9是嗜热链球菌Cas9。
15.根据权利要求1-7任一项的CRISPR-Cas复合物或CRISPR-Cas载体***，其中tracr匹配序列与tracr序列连接形成嵌合RNA，其中所述嵌合RNA从5’至3’包含引导序列、tracr匹配序列和tracr序列。
16.分离的真核细胞，其包含CRISPR-Cas复合物，所述CRISPR-Cas复合物包含：
-Cas9，其中所述Cas9包含两个或更多个核定位信号；
-与tracr匹配序列连接的引导序列，和
-能够与tracr匹配序列的全部或一部分杂交的tracr序列；
其中所述引导序列被设计为与真核细胞中的靶序列具有互补性并能够指导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。
17.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中所述核定位信号独立地选自PKKKRKV(SEQID NO:1)、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:2)、PAAKRVKLD(SEQ ID NO:3)、RQRRNELKRSP(SEQID NO:4)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:5)、RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:6)、VSRKRPRP(SEQ ID NO:7)、PPKKARED(SEQID NO:8)、POPKKKPL(SEQ ID NO:9)、SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:10)、DRLRR(SEQ ID NO:11)、PKQKKRK(SEQ ID NO:12)、RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:13)、REKKKFLKRR(SEQ ID NO:14)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:15)和RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:16)。
18.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中至少一个核定位信号是PKKKRKV(SEQIDNO:1)。
19.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中Cas9在氨基端包括至少一个核定位信号，并且在羧基端包括至少一个核定位信号。
20.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中Cas9指导含有靶序列的靶多核苷酸的两条链的切割。
21.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中Cas9包含催化结构域中的至少一个突变；优选其中所述突变选自D10A、H840A、N854A或N863A。
22.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中Cas9是酿脓链球菌Cas9。
23.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中Cas9是嗜热链球菌Cas9。
24.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中tracr匹配序列与tracr序列连接形成嵌合RNA，其中所述嵌合RNA从5’至3’包含引导序列、tracr匹配序列和tracr序列。
25.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中所述CRISPR-Cas复合物位于所述分离的真核细胞的细胞核中。
26.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中所述分离的真核细胞包含两个或更多个不同的引导序列。
27.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中所述分离的真核细胞进一步包含用于同源性指导的修复的模板多核苷酸。
28.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中所述分离的真核细胞是人细胞或哺乳动物细胞。
29.根据权利要求16的分离的真核细胞，其中所述引导序列与原型间隔物邻近基序(PAM)邻近的靶序列杂交，并且所述tracr匹配序列与所述tracr序列杂交。
30.根据权利要求29的分离的真核细胞，其中所述CRISPR-Cas复合物在靶序列中产生切割。
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