CN111748543A - 免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程菌、构建方法与应用 - Google Patents

免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程菌、构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程菌、构建方法与应用，其中，所述免疫调节蛋白突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ‑8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明在保证免疫调节活性和抗肿瘤活性基本不变的基础上，实现进一步提高了重组LZ‑8的热稳定性以及提高重组LZ‑8成药的稳定性，一方面，该免疫调节蛋白突变体的热稳定性提升幅度大，与野生型LZ‑8相比，F8W相变温度Tm上升1.86℃，相转变焓值ΔH提高39.19kJ/mol；另一方面，该免疫调节蛋白突变体具有与野生型LZ‑8一致的免疫调节活性以及抗肿瘤活性，相对现有技术更具有应用和开发价值。

Description

免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程 菌、构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、基因工程菌与应用。
背景技术
灵芝免疫调节蛋白LZ-8是灵芝子实体中富含的一种具有免疫调节活性的二聚体蛋白质，临床前研究证实LZ-8具有多种免疫调节和抗肿瘤活性，如：能够促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖；促进T细胞分泌多种细胞因子；能够抑制小鼠体内外肺癌、胃癌和肝癌的生长；能够显著提高肿瘤DNA疫苗的抗肿瘤活性；能够减轻局部和全身过敏反应；能够减缓糖尿病进展；能够减轻移植物抗宿主反应，等等。因此，LZ-8在肿瘤治疗和自身免疫性疾病治疗领域有着巨大开发潜力。野生灵芝产量低，价格高，不适合作为灵芝免疫调节蛋白LZ-8的生产来源。人工栽培灵芝生产周期长，工艺复杂，也无法满足工业化生产的需要。随着基因工程和生物制药工程技术的飞速发展，采用基因工程菌株，强化目的基因转录和翻译，可以实现目的蛋白的高效表达和活性分泌，能有效提高灵芝免疫调节蛋白LZ-8的生产规模。
然而，在灵芝免疫调节蛋白LZ-8生产过程中，由于机械破碎、搅拌、错流式膜过滤等操作的存在，不可避免造成蛋白质溶液局部升温，引发蛋白质解折叠乃至变性，严重影响了最终产物的效价和均质性，因此，提高LZ-8分子热稳定性，对于生产出质量可靠，适用于新药申报的LZ-8分子，具有重要现实意义。通过分子改造技术寻求热稳定性提高，药理活性不变或提高的LZ-8突变体，是解决方案之一。研究人员在前期工作中，对灵芝免疫调节蛋白LZ-8进行了酵母菌的异源表达，获得了具有免疫调节活性和抗肿瘤活性的重组LZ-8分子。但现有技术在保证重组LZ-8生物学活性不变或提高的基础上，无法进一步提高重组LZ-8的热稳定性，导致重组LZ-8成药的稳定性差。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种免疫调节蛋白突变体，旨在解决现有技术在保证重组LZ-8生物学活性不变或提高的基础上，无法进一步提高重组LZ-8的热稳定性，导致重组LZ-8成药的稳定性差的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种免疫调节蛋白突变体，所述免疫调节蛋白突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
本发明实施例的另一目的在于一种免疫调节蛋白突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明实施例的另一目的在于一种含有所述核苷酸序列的重组质粒载体。
本发明实施例的另一目的在于一种表达所述免疫调节蛋白突变体的基因工程菌。
本发明实施例的另一目的在于一种所述免疫调节蛋白突变体的构建方法，所述构建方法包括：
根据免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列以及核苷酸序列，设计定点突变的引物F8W-F/R；所述引物F8W-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物F8W-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
根据所述定点突变的引物，对携带角蛋白酶LZ-8基因的质粒进行定点突变PCR获得目的突变体质粒；
将所述目的突变体质粒进行PCR扩增，得重组质粒；
将所述重组质粒转入真菌中，进行突变体蛋白的表达，即得。
本发明实施例的另一目的在于一种所述免疫调节蛋白突变体在免疫调节剂制备、免疫佐剂制备、肿瘤治疗或者自身免疫性疾病治疗领域的应用。
本发明实施例提供的免疫调节蛋白突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；一方面，该免疫调节蛋白突变体的热稳定性提升幅度大，与野生型LZ-8相比，F8W相变温度Tm上升1.86℃，相转变焓值ΔH提高39.19kJ/mol；另一方面，该免疫调节蛋白突变体具有与野生型LZ-8一致的免疫调节活性，对Balb/c小鼠脾细胞具有促有丝***效应，最大促有丝***剂量为0.3125μg/ml，另外，还具有与野生型LZ-8一致的抗肿瘤活性，对体外培养的Hela细胞具有生长抑制效应，其IC50剂量为2.292μg/ml；即本发明所提供的免疫调节蛋白突变体在保证免疫调节活性和抗肿瘤活性基本不变的基础上，实现进一步提高了重组LZ-8的热稳定性以及提高重组LZ-8成药的稳定性，相对现有技术更具有应用和开发价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的野生型灵芝免疫调节蛋白LZ-8在不同温度下的模拟稳态构象图；
图2是本发明实施例提供的B-factor预测灵芝免疫调节蛋白LZ-8的温度敏感区域图；
图3是本发明实施例提供的灵芝免疫调节蛋白突变体精纯蛋白的SDA-PAGE凝胶电泳图；
图4是本发明实施例提供的灵芝免疫调节蛋白LZ-8及其各突变体免疫调节活性测定曲线图；
图5是本发明实施例提供的灵芝免疫调节蛋白LZ-8及其各突变体抗肿瘤活性测定曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例为了解决现有技术在保证重组LZ-8生物学活性不变或提高的基础上，无法进一步提高重组LZ-8的热稳定性，导致重组LZ-8成药的稳定性差的问题，提供了一种免疫调节蛋白突变体，其氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；一方面，该免疫调节蛋白突变体的热稳定性提升幅度大，与野生型LZ-8相比，F8W相变温度Tm上升1.86℃，相转变焓值ΔH提高39.19kJ/mol；另一方面，该免疫调节蛋白突变体具有与野生型LZ-8一致的免疫调节活性，对Balb/c小鼠脾细胞具有促有丝***效应，最大促有丝***剂量为0.3125μg/ml，另外，还具有与野生型LZ-8一致的抗肿瘤活性，对体外培养的Hela细胞具有生长抑制效应，其IC50剂量为2.292μg/ml。
值得注意的是，当前现有技术仅能做到将相变温度Tm上升0.9℃，相转变焓值ΔH提高23.14kJ/mol，存在无法再进一步提高重组LZ-8的热稳定性，导致重组LZ-8成药的稳定性差的问题，而本发明所提供的免疫调节蛋白突变体在保证免疫调节活性和抗肿瘤活性基本不变的基础上，实现了进一步提高重组LZ-8的热稳定性以及提高重组LZ-8成药的稳定性，相对现有技术更具有应用和开发价值。
本发明实施例提供一种免疫调节蛋白突变体，所述免疫调节蛋白突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
SEQ ID NO.1：
MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN
SEQ ID NO.2：
MSDTALIWRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN
在本发明实施例中，以NCBI网站公布的野生型灵芝免疫调节蛋白LZ-8氨基酸序列(P14945)为基础，构建定点突变体。
具体地，以灵芝免疫调节蛋白LZ-8的晶体结构(PDB ID:3F3H)为0K时初始结构，采用NAMD软件计算***温度从0K升高至303K(30℃)、313K(40℃)和323K(50℃)时LZ-8单体全原子运动轨迹，再应用VMD软件模拟出LZ-8单体在30℃、40℃和50℃三个温度下的稳态构象(图1)。具体分子动力学计算条件如下：(1)模拟体系构建：采用CHARMM力场，选用TIP3P八面体水分子盒模型，将蛋白质分子置于
Figure BDA0002565199610000061
的水溶剂箱內，加入Na+平衡电荷；(2)能量最小化：用sander模块进行3000步能量最小化，执行最陡下降法500步后转位共轭梯度法，以消除不合理的能量势垒；(3)加热：对***加热使其从0K升温至303K、313K和323K，并在保持体积不变的状态下运行50ps带有位置限制的动力学，将非键相互作用阈值设为
Figure BDA0002565199610000062
使用弱耦合的算法来控制温度；(4)平衡：在常压条件下***分别处在303K、313K和323K条件下，进行500ps的分子动力学模拟，以平衡***；(5)动力学模拟：恒温恒压***下进行分子动力学模拟，所用步长为2fs，以每1000步采集一次能量与坐标信息。分析动力学模拟过程中结构的均方根偏差值(Root Mean Square Deviation，RMSD)，再选择RMSD值平衡阶段的数据，计算每个氨基酸的均方根涨落值(Root Mean Square Fluctuation，RMSF)，形成轨迹文件，最后通过VMD软件分析该模拟轨迹，计算不同环境温度下LZ-8分子的稳态构象。如图1所示，随着环境温度由0K逐渐上升至303K、313K和323K，LZ-8分子的N端α螺旋逐渐解构，表明LZ-8分子N端α螺旋对温度敏感。
其中，温度因子B-factor常被用于反映蛋白质分子在晶体中的构象状态，B-factor数值越高，模糊度越大，相应部位的构象就越不稳定或柔性越强。根据温度因子B-factor的预测，LZ-8存在3组温度敏感位点(图2)，它们分别是：(1)N-端α螺旋上第8和第9位氨基酸；(2)β4片层和β5片层之间LOOP环上第63-71位氨基酸；(3)β7片层上的第103和104位氨基酸。其中，N-端α螺旋是B-factor和NAMD分子模拟预测的共同温度敏感区域，于是我们将待突变氨基酸位点定位到这一区域。如图2所示，在LZ-8分子N-端α螺旋上，第8位和第9位氨基酸残基B-factor因子数值高于其它位置氨基酸残基，推测它们比其它氨基酸残基对温度更为敏感，现有技术中，研究人员在此基础上往往会同时选择第8位和第9位氨基酸残基进行双位点突变，本发明考虑到点突变氨基酸结构的相似性及疏水性强弱，创新性地选择第8位氨基酸残基进行单位点突变。
在本发明实施例中，编码所述免疫调节蛋白LZ-8的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：
ATGTCTGATACCGCTTTAATCTTTAGATTGGCCTGGGATGTTAAAAAATTATCTTTTGATTACACACCTAATTGGGGTCGTGGTAACCCTAACAATTTCATTGACACTGTTACTTTTCCAAAAGTGTTGACTGATAAGGCCTATACCTATCGAGTTGCAGTTTCTGGCCGTAACCTTGGCGTGAAACCCTCATATGCCGTTGAATCTGATGGTTCTCAGAAAGTGAACTTCTTGGAGTACAACAGTGGCTACGGTATTGCAGACACCAATACCATCCAAGTCTTTGTCGTCGACCCAGATACGAACAATGATTTTATTATCGCCCAGTGGAAC
本发明实施例还提供一种免疫调节蛋白突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4：
ATGTCTGATACCGCTTTAATCTGGAGATTGGCCTGGGATGTTAAAAAATTATCTTTTGATTACACACCTAATTGGGGTCGTGGTAACCCTAACAATTTCATTGACACTGTTACTTTTCCAAAAGTGTTGACTGATAAGGCCTATACCTATCGAGTTGCAGTTTCTGGCCGTAACCTTGGCGTGAAACCCTCATATGCCGTTGAATCTGATGGTTCTCAGAAAGTGAACTTCTTGGAGTACAACAGTGGCTACGGTATTGCAGACACCAATACCATCCAAGTCTTTGTCGTCGACCCAGATACGAACAATGATTTTATTATCGCCCAGTGGAAC
本发明实施例还提供一种含有所述的核苷酸序列的重组质粒载体。
在本发明实施例中，所述重组质粒载体是在pPICZα系列、pPICZ系列、pGAPZα系列或pPIC3.5K中的任意一种质粒的基础上构建得到的。
本发明实施例还提供一种表达所述的免疫调节蛋白突变体的基因工程菌。
在本发明实施例中，所述基因工程菌是酵母菌或者其他真菌。
本发明实施例还提供一种所述的免疫调节蛋白突变体的构建方法，所述构建方法包括：
根据免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列以及核苷酸序列，设计定点突变的引物F8W-F/R；所述引物F8W-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物F8W-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.5：ACCGCTTTAATCTGGAGATTGGCCTGGGAT
SEQ ID NO.6：ATCCCAGGCCAATCTCCAGATTAAAGCGGT
根据所述定点突变的引物，对携带角蛋白酶LZ-8基因的质粒进行定点突变PCR获得目的突变体质粒；
将所述目的突变体质粒进行PCR扩增，得重组质粒；
将所述重组质粒转入真菌中，进行突变体蛋白的表达，即得。
本发明实施例还提供一种所述的免疫调节蛋白突变体在免疫调节剂制备、免疫佐剂制备、肿瘤治疗或者自身免疫性疾病治疗领域的应用。
下面结合具体实施例对本发明免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程菌、构建方法与应用做进一步的说明，但这些实施例所提及的具体实施方法只是对本发明的技术方案进行的列举解释，并非限制本发明的实施范围，凡是依据上述原理，在本发明基础上的改进、替代，都应在本发明的保护范围之内。
实施例1：灵芝免疫调节蛋白定点突变体的构建
如图2所示，其中，字母表示热敏感区域的氨基酸残基名称，数字表示该氨基酸残基在氨基酸序列上的排序，在LZ-8分子N-端α螺旋上，第8位和第9位氨基酸残基B-factor因子数值高于其它位置氨基酸残基，本发明选择第8位氨基酸残基进行单位点突变，并将其与选择第9位氨基酸残基单位点突变以及同时选择第8位和第9位氨基酸残基双位点突变进行比较，该三种突变体的构建依次命名为：F8W、R9K和DM。
根据LZ-8的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，分别设计定点突变的引物(表1)，对携带角蛋白酶LZ-8基因的质粒LZ-8/pGAPZα进行定点突变PCR获得目的突变体质粒，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，待测序正确后，扩增目的质粒，线性化质粒电转入酵母X-33菌株，进行三种突变体蛋白的表达。具体如下：
表1不同灵芝免疫调节蛋白定点突变体的引物序列
Figure BDA0002565199610000091
按照Muta-directTM定点突变试剂盒的操作说明，使用表1的定点突变引物和Muta-directTM酶对模板质粒进行全长PCR，MutazymeTM酶再消化未突变的模板质粒，剩余PCR扩增的全长突变质粒转化DH5α感受态细胞，挑取若干克隆，小量提取质粒测序，将测序正确的突变质粒扩增后，按照pGAPZα质粒说明书，线性化质粒，电转化酵母X33菌株，获得能够表达突变体F8W、R9K和DM的三种重组酵母菌株。
实施例2：灵芝免疫调节蛋白突变体的表达和纯化
挑取表达突变体蛋白的酵母X-33菌株于YPD液体培养基(含100μg/ml ZeocinTM)28-30℃过夜震荡培养(250-300rpm)；次日，按照5％接种量将种子发酵液接到含YPD液体培养基的发酵罐中，28-30℃连续培养发酵72h后，4℃离心收集发酵液上清。
采用AKTA蛋白质纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程温度控制为4℃。具体步骤如下：(1)SP Sapharose XL阳离子交换色谱去除大部分杂的蛋白和小分子核酸片段、色素等，A相pH3.5 50Mm NaAc-HAc，B相pH3.5 50Mm NaAc-HAc/1M NaCl线性洗脱；(2)Q-Sapharose Fast Flow阴离子交换色谱中级纯化突变体蛋白质，pH7.2 25mM Tris-HCL A相平衡色谱柱，pH7.2 25mM Tris-HCL/0.5M NaCl B相洗脱；(3)SuperdexTM75分子筛精细纯化突变体蛋白，上样后，pH7.2 50Mm Tris-HCl/0.15M NaCl洗脱。收集洗脱峰，进行精纯蛋白的SDS-PAGE电泳，如图3所示，其中，M代表蛋白分子量标准，不同泳道名称代表不同蛋白质，箭头指示目的蛋白条带位置。
实施例3：免疫调节活性测定
采用小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测突变体免疫调节活性，具体操作方法如下:无菌手术法分离小鼠脾脏，眼科剪剪切法分离单个脾细胞，200目滤网过滤单个脾细胞，红细胞裂解液作用后，收集剩余细胞，计数细胞密度，用含2％胎牛血清的1640培养液将细胞稀释至适宜密度，于96孔培养板，每孔加入1×105个细胞，再加入既定终浓度的待检测蛋白，置37℃5％CO2培养箱培养24h，CCK-8法检测细胞增殖情况(图4)。结果显示，LZ-8及其突变体蛋白具有一致的促脾细胞增殖效应曲线，它们的最大促脾细胞增殖剂量均为0.3125μg/ml。
实施例4：抗肿瘤活性检测
采用Hela细胞生长抑制实验检测突变体的抗肿瘤活性，具体操作方法如下：用0.25％的胰酶将贴壁Hela细胞消化成单细胞悬液，胎牛血清终止胰酶消化，计数细胞密度，于96孔培养板，每孔加入5×104个细胞，再加入既定终浓度的待测蛋白，反应体系为含2％胎牛血清的IMDM培养基，置37℃5％CO2培养箱培养48h，CCK-8法检测细胞增殖情况(图5)。结果显示，三种突变体F8W、R9K和DM对体外培养的Hela细胞具有与野生型LZ-8一致的生长抑制效应，它们的IC50剂量依次为：2.292μg/ml、2.363μg/ml、2.407μg/ml和2.238μg/ml。
实施例5：待测蛋白热力学参数测定
差示量热扫描分析仪MicroCal VP-DSC(通用电气医疗，美国)测定LZ-8和各突变体相变温度Tm和相转变焓值ΔH，实验参数：LZ-8或LZ-8突变体样品溶于0.01M PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，终浓度1mg/mL，进样体积500μL，加热范围25-55℃，加热速度1℃/min。采集原始数据，应用Origin软件分析样品各热力学参数(表2)。
表2LZ-8及其突变体的热力学参数(n＝3,mean±SD)
Figure BDA0002565199610000111
*表示与LZ-8组相比，t-检验p<0.05
综上，本发明实施例提供的免疫调节蛋白突变体，其氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；一方面，该免疫调节蛋白突变体的热稳定性提升幅度大，与野生型LZ-8相比，F8W相变温度Tm上升1.86℃，相转变焓值ΔH提高39.19kJ/mol；另一方面，该免疫调节蛋白突变体具有与野生型LZ-8一致的免疫调节活性，对Balb/c小鼠脾细胞具有促有丝***效应，最大促有丝***剂量为0.3125μg/ml，另外，还具有与野生型LZ-8一致的抗肿瘤活性，对体外培养的Hela细胞具有生长抑制效应，其IC50剂量为2.292μg/ml；值得注意的是，本发明所提供的免疫调节蛋白突变体在保证免疫调节活性和抗肿瘤活性基本不变的基础上，实现进一步提高了重组LZ-8的热稳定性以及提高重组LZ-8成药的稳定性，相对现有技术更具有应用和开发价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002565199610000131
Figure BDA0002565199610000141
Figure BDA0002565199610000151
Figure BDA0002565199610000161
序列表
<110> 吉林大学
<120> 免疫调节蛋白突变体及其核苷酸序列、重组质粒载体、工程菌、构建方法与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val
85 90 95
Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn
100 105 110
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Trp Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn
20 25 30
Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val
85 90 95
Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn
100 105 110
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctgata ccgctttaat ctttagattg gcctgggatg ttaaaaaatt atcttttgat 60
tacacaccta attggggtcg tggtaaccct aacaatttca ttgacactgt tacttttcca 120
aaagtgttga ctgataaggc ctatacctat cgagttgcag tttctggccg taaccttggc 180
gtgaaaccct catatgccgt tgaatctgat ggttctcaga aagtgaactt cttggagtac 240
aacagtggct acggtattgc agacaccaat accatccaag tctttgtcgt cgacccagat 300
acgaacaatg attttattat cgcccagtgg aac 333
<210> 4
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtctgata ccgctttaat ctggagattg gcctgggatg ttaaaaaatt atcttttgat 60
tacacaccta attggggtcg tggtaaccct aacaatttca ttgacactgt tacttttcca 120
aaagtgttga ctgataaggc ctatacctat cgagttgcag tttctggccg taaccttggc 180
gtgaaaccct catatgccgt tgaatctgat ggttctcaga aagtgaactt cttggagtac 240
aacagtggct acggtattgc agacaccaat accatccaag tctttgtcgt cgacccagat 300
acgaacaatg attttattat cgcccagtgg aac 333
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accgctttaa tctggagatt ggcctgggat 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcccaggcc aatctccaga ttaaagcggt 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgctttaa tctttaagtt ggcctgggat 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcccaggcc aacttaaaga ttaaagcggt 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accgctttaa tctggaagtt ggcctgggat 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcccaggcc aacttccaga ttaaagcggt 30

Claims (9)

1.一种免疫调节蛋白突变体，其特征在于，所述免疫调节蛋白突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1的免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列的基础上，将第8位的苯丙氨酸突变成色氨酸，突变后的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述免疫调节蛋白突变体，其特征在于，编码所述免疫调节蛋白LZ-8的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种根据权利要求1或2所述免疫调节蛋白突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述免疫调节蛋白突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种包含有权利要求3所述核苷酸序列的重组质粒载体。
5.根据权利要求4所述核苷酸序列的重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体是在pPICZα系列、pPICZ系列、pGAPZα系列或pPIC3.5K中的任意一种质粒的基础上构建得到的。
6.一种表达权利要求1或2所述免疫调节蛋白突变体的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述免疫调节蛋白突变体的基因工程菌，其特征在于，所述免疫调节蛋白突变体的基因工程菌是酵母菌。
8.一种根据权利要求1或2所述免疫调节蛋白突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
根据免疫调节蛋白LZ-8的氨基酸序列以及核苷酸序列，设计定点突变的引物F8W-F/R；所述引物F8W-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物F8W-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
根据所述定点突变的引物，对携带角蛋白酶LZ-8基因的质粒进行定点突变PCR获得目的突变体质粒；
将所述目的突变体质粒进行PCR扩增，得重组质粒；
将所述重组质粒转入真菌中，进行突变体蛋白的表达，即得。
9.一种根据权利要求1或2所述免疫调节蛋白突变体在免疫调节剂制备、免疫佐剂制备、肿瘤治疗或者自身免疫性疾病治疗领域的应用。
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