CN112574995B - 用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA(LAT‑miRNA)基因编辑的gRNA引物及其应用，通过对比分析不同毒力MDV‑1编码的LAT‑miRNA及其邻近基因组序列，选取该基因簇5’端和3’端两侧高度保守的区域作为gRNA靶点区，设计合成了互补配对的一系列gRNA，并构建pX459‑gRNA表达质粒，将其两两组合后均能引导CRISPR/Cas9***精准有效地实现MDV‑1超强毒株GX0101整个LAT‑miRNA的精准编辑和敲除。由于LAT‑miRNA在不同毒力MDV‑1毒株之间具有高度的基因座位保守性和序列保守性，因此利用本发明设计的gRNA，可以精准有效地编辑不同MDV‑1毒株的LAT‑miRNA。该实验方法设计简单、gRNA靶向性好，基因编辑及敲除时效高，为研究其致病、致瘤调控机制及新型疫苗研发提供了新的思路和技术支撑。

Description

用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其 应用
技术领域
本发明涉及一种用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA(以下简称LAT-miRNA)基因编辑的gRNA引物设计及其应用，属于基因工程技术研究领域。
背景技术
成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)是最初在一些细菌和古生菌中发现的一种重要的外援基因，与CRISPR相关蛋白家族(Cas)共同构成自身适应免疫***的重要组成部分，用以抵御外来质粒和噬菌体的核酸入侵。CRISPR/Cas9***属于II型CRISPR/Cas***，该***只需要一个向导RNA(guide RNA，gRNA)介导即可特异性识别并结合位于靶基因下游的5’-NGG-3’(Protospacer adjacent motif，PAM)序列，从而激发Cas9的双链DNA切割功能，产生一个双链的切口(Double strandbreak，DSB)，而细胞基因组DNA利用其自我修复功能，由易出错的非同源末端连接(Nonhomologous end-joining，NHEJ)和同源定向修复(Homology-directed repair，DHR)的方式修复DSB切口，最终实现靶点DNA的***和/或缺失(Insertion-deletion，InDel)。由于Cas9这种核酸酶的可控性和通过修改gRNA靶点就能轻易改变Cas9切割位点的便捷性，基于CRISPR/Cas9***的基因编辑技术在短短数年时间得到了迅速开发和利用。目前，科学家们已将这一技术广泛应用于许多物种活细胞基因组DNA及核苷酸序列编辑，如人类细胞、细菌、斑马鱼、酵母、小鼠、果蝇和蛔虫等。随后，CRISPR/Cas9基因编辑技术对病毒基因组尤其是大基因组DNA病毒的编辑也相继报道，且主要集中在一些致瘤性疱疹病毒。
马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)属于甲亚科疱疹病毒，是少数几种在其自然宿主中可诱导产生肿瘤的一种致瘤性疱疹病毒。根据致病性不同可以将其分为3种血清型：MDV-1、MDV-2和MDV-3，其中只有MDV-1具有致病性和致瘤性。MDV病毒基因组为线性双股DNA，全长约180kb，编码100多个病毒基因。近年来，随着高通量测序技术的发展及应用，科学家们研究发现在MDV基因组中还存在着大量病毒微小RNA(microRNA，miRNA)基因的表达，并且这些病毒编码的miRNA与MDV的致病性及致瘤性密切相关。MDV-1共编码14个miRNA前体(Precursor miRNA，pre-miRNA)，可剪切加工产生26个成熟体miRNA分子，他们全部位于病毒基因组的反转重复序列区中，形成3个明显的miRNA基因簇，分别被命名为Meq、Mid和LAT基因簇。其中LAT基因簇由miR-M6、miR-M7、miR-M8、miR-M10和miR-M13组成，这些miRNA主要位于IRS/TRS重复序列与病毒潜伏感染相关基因转录物(Latency-associatedtranscript，LAT)的第一个内含子中，与病毒潜伏感染密切相关。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于马立克病病毒LAT-miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用，所述CRISPR/Cas9***表达的gRNA可特异性靶向编辑并敲除血清I型马立克病病毒(MDV-1)基因组编码的LAT-miRNA。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物，所述gRNA引物位于马立克病病毒LAT基因簇miRNA即LAT-miRNA的5’端和3’端两侧的保守区域，分别为：LAT-gRF1、LAT-gRF2、LAT-gRF3、LAT-gRF4以及LAT-gRR1、LAT-gRR2、LAT-gRR3、LAT-gRR4，其序列分别为序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
用于马立克病病毒LAT-miRNA基因编辑的方法，包括以下步骤：
(1)gRNA引物的设计：
选取LAT-miRNA 5’端和3’端两侧的保守区域作为靶点区，进行靶点选择及gRNA设计，得到权利要求1所述的gRNA引物；
(2)pX459-gRNA质粒的构建及鉴定：
人工合成gRNA的上下游单链oligo序列，复性为互补双链后，用T4连接酶连接到Bbs I-HF酶切后的pX459v2.0质粒载体上，构建pX459-gRNA质粒；利用引物对Step2-F和Step2-R，对pX459-gRNA质粒进行鉴定；引物对Step2-F和Step2-R的序列分别为序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
(3)LAT-miRNA的基因编辑及鉴定：
将上述pX459-gRNA质粒两两组合，分别共转染鸡胚成纤维细胞CEF，接种马立克病病毒超强毒株GX0101后，进行PCR鉴定；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析基因编辑效果；筛选鉴定可获得LAT-miRNA完全缺失的MDV-1编辑毒株。
所述步骤(2)中gRNA的上下游单链oligo分别为：LAT-gRF1-5p、LAT-gRF1-3p、LAT-gRF2-5p、LAT-gRF2-3p、LAT-gRF3-5p、LAT-gRF3-3p、LAT-gRF4-5p、LAT-gRF4-3p以及LAT-gRR1-5p、LAT-gRR1-3p、LAT-gRR2-5p、LAT-gRR2-3p、LAT-gRR3-5p、LAT-gRR3-3p、LAT-gRR4-5p、LAT-gRR4-3p，其序列分别为序列表中SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列。
所述步骤(3)中质粒转染和病毒感染的具体方法为：制备鸡胚成纤维细胞CEF，将CEF以1.5×105个/孔的数量铺入24孔细胞培养板，在38.5℃、5％CO2培养箱中培养过夜，将pX459-gRNA质粒两两组合，分别共转染CEF，在38.5℃、5％CO2培养箱中培养24h后，以5000PFU/孔的接毒量接种GX0101病毒，继续培养48h后，取样进行PCR分析鉴定。
所述PCR分析的具体方法为：用0.25％胰蛋白酶消化上述病毒感染48h后的CEF，取一半细胞悬液以1000r/min离心10min，弃掉上清后，用1×DNA提取缓冲液吹悬，金属浴65℃保温30min、95℃变性5min提取细胞和病毒总DNA，用LAT-F和LAT-R引物对进行PCR鉴定；引物对LAT-F和LAT-R的序列分别为序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
所述PCR鉴定时的反应程序为：95℃5min预变性；95℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。
所述1×DNA提取缓冲液包括10mmol/LTris HCl，1mmol/L EDTA，25mmol/LNaCl和10μg/mL的蛋白酶K。
所述的gRNA引物在与GX0101毒株具有高度保守LAT-miRNA基因序列的血清1型马立克病病毒MDV-1毒株的编辑及基因组改造中的应用。
所述的gRNA引物在LAT-miRNA基因位点的基因编辑敲除、外援基因编辑***或重组疫苗研发中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明首先比对分析不同毒力MDV-1毒株编码的LAT-miRNA及其邻近基因组序列，选取该基因簇5’端和3’端两侧高度保守的区域作为gRNA靶点区，设计合成了互补配对的一系列gRNA(5’端LAT-gRF1～LAT-gRF4和3’端LAT-gRR1～LAT-gRR4)，并构建pX459-gRNA质粒，将其两两组合后均能引导CRISPR/Cas9***精准有效地实现MDV-1超强毒株GX0101整个LAT-miRNA的精准编辑和敲除。由于LAT-miRNA在不同毒力MDV-1毒株之间具有高度的基因座位保守性和基因序列保守性，因此利用本发明设计的gRNA，可以精准有效地编辑不同MDV-1毒株的LAT-miRNA。该方法设计简单、gRNA靶向性好，基因编辑及敲除时效性高。
(2)本发明设计的这组gRNA具有高效性，Cas9核酸酶的剪切位点精确的发生在gRNA的PAM序列内侧2-4个碱基处，后续仅需进行简单的病毒噬斑纯化、PCR扩增及核酸凝胶电泳分析即可筛选鉴定获得整个LAT-miRNA完全缺失的MDV-1编辑毒株，与传统的病毒基因组改造操作技术(如细菌人工染色体(BAC)技术和Rec E/T同源重组技术)相比，具有操作简单、成本低廉、编辑效率高和节约时间等优点。
(3)本发明利用设计的这组gRNA介导的CRISPR/Cas9***构建的LAT-miRNA缺失毒株基因组中编码的LAT-miRNA被完全编辑缺失，该基因簇的缺失不影响Meq和Mid基因簇中miRNA的正常表达，不影响病毒噬斑的形成，不影响病毒蛋白编码基因gB和pp38的正常表达，也不影响病毒的体外复制和生长；且连续传代15代后基因缺失毒株均保持LAT-miRNA基因缺失的稳定性，未发生回复突变。该缺失毒株的构建，为后续揭示LAT-miRNA的调控功能提供了重要研究材料，为MDV-1的miRNA基因编辑提供了一种新的技术手段，为研究其致病/致瘤机制及新型疫苗研发提供了新的思路和技术支撑。
附图说明
图1.本发明实施例一中LAT基因簇miRNA的gRNA靶点示意图；
其中：UL，长独特序列区；US，短独特区；TRL，长末端重复序列；IRL，长内部重复序列；TRS，短末端重复序列；IRS，短内部重复序列；
图2.本发明实施例二中不同gRNA组合对LAT基因簇miRNA基因编辑的PCR鉴定；
其中：M，DNAMarker；CEF，鸡胚成纤维细胞；箭头，指示基因编辑条带；
图3.本发明实施例二中gRF1/gRR2组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析；
其中：上，野生型和突变型序列对比；下，突变型基因测序峰图；
图4.本发明实施例二中gRF1/gRR3组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析；
其中：上，野生型和突变型序列对比；下，突变型基因测序峰图；
图5.本发明实施例二中gRF1/gRR4组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析；
其中：上，野生型和突变型序列对比；下，突变型基因测序峰图；
图6.本发明实施例二中gRF3/gRR3组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析；
其中：上，野生型和突变型序列对比；下，突变型基因测序峰图；
图7.本发明实施例二中gRF3/gRR4组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析；
其中：上，野生型和突变型序列对比；下，突变型基因测序峰图；
图8.本发明实施例二中GXΔLAT-miRs-C21-15传代稳定性的PCR分析；
图9.本发明实施例三中病毒miRNA的相对表达分析；
图10.本发明实施例三中病毒感染CEF中gB和pp38蛋白的IFA分析；
其中，比例尺＝50μm；
图11.本发明实施例三中GX0101和GXΔLAT-miRs-C21-15毒株的体外增殖曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例一、gRNA和PCR引物设计及pX459-gRNA质粒构建
1、gRNA和PCR引物的设计
由于MDV-1编码的26个miRNA的基因座位和序列比较保守，所以本发明首先在NCBI数据库中查询MDV-1代表性强毒株Md5、GX0101、GA和疫苗株CVI988的LAT-miRNA及邻近基因组序列，经过序列比对后选取LAT-miRNA5’和3’端高度保守的区域作为靶点区，使用GenScript’s gRNA在线软件(https://www.genscript.com)进行靶点选择及gRNA设计。
如表1和图1所示，以MDV毒株GX0101(GenBank登陆号：JX844666.1)的LAT-miRNA5’端与3’端两侧及其邻近序列为例，使用GenScript’s gRNA在线软件设计选择8个gRNA编辑靶点(5’端和3’端各4个)，分别命名为：LAT-gRF1、LAT-gRF2、LAT-gRF3、LAT-gRF4以及LAT-gRR1、LAT-gRR2、LAT-gRR3、LAT-gRR4(表1，序号1～8)。他们在GX0101病毒基因组中对应的基因座位依次为：140837-140856、140879-140898、140902-140921、141099-141118以及141851-141870、141826-141845、141765-141784、141731-141750。GenScript’s gRNA在线软件分析显示，上述gRNA的靶向评分(on-target score)和脱靶评分分别为：97.7*/92.5、65.7*/93、67.5*/89.5、65.0*/97.6以及67.5*/76.5、63.5*/74.5、64.7*/81.5、71.5*/71.4。
人工合成互补配对的靶向LAT-miRNA上下游5’端和3’端两侧各4个靶点的gRNA单链oligo，在gRNA上游序列的5’端和下游序列的3’端分别添加BbsI的酶切位点，并且在上游序列中非“G”开头的oligo在5’端加“G”处理(表2)。将这些oligo依次按序命名为LAT-gRF1-5p、LAT-gRF2-5p、LAT-gRF3-5p、LAT-gRF4-5p和LAT-gRR1-5p、LAT-gRR2-5p、LAT-gRR3-5p、LAT-gRR4-5p以及LAT-gRF1-3p、LAT-gRF2-3p、LAT-gRF3-3p、LAT-gRF4-3p和LAT-gRR1-3p、LAT-gRR2-3p、LAT-gRR3-3p、LAT-gRR4-3p(表2)。
同时，利用Premier Primer 5.0设计用于扩增LAT-miRNA的特异性PCR引物对LAT-F和LAT-R；用于pX459-gRNA表达质粒鉴定引物对Step2-F和Step2-R；用于病毒拷贝数测定的qRT-PCR引物对yg-gB-F和yg-gB-R以及yg-OVO-F和yg-OVO-R(表1，序号9～12)。上述gRNAoligo和PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
2、pX459-gRNA质粒的构建及鉴定
用Bbs I-HF将pX459 v2.0质粒载体酶切后割胶回收纯化，将表2中合成的gRNA 5’和3’单链oligo复性为双链DNA。然后用T4连接酶将复性后的gRNA双链与pX459 v2.0酶切载体连接，转化E.coli感受态细胞，次日挑取单菌落。利用表1中的Step2-F和Step2-R引物对进行菌液PCR鉴定后，选择阳性菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定。确证后的阳性菌液提取pX459-gRNA质粒，利用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定质粒浓度，-20℃保存备用。
表1靶向LAT-miRNA的gRNA靶点和用于MDV突变体鉴定的PCR引物
Figure BDA0002853469030000061
注：括号内粗体碱基为PAM序列
表2靶向LAT-miRNA的gRNA上下游单链oligo序列
Figure BDA0002853469030000071
注：下划线为BbsI酶切位点
实施例二、LAT-miRNA的基因编辑及鉴定
1、pX459-gRNA质粒组合基因编辑的PCR分析
常规方法制备鸡胚成纤维细胞CEF，细胞计数后将CEF以1.5×105个/孔的数量铺入24孔细胞培养板，置38.5℃、5％CO2培养箱中培养过夜，按照转染试剂Trans-X2TMDynamic Delivery System说明书，将靶向LAT-miRNA 5’端和3’端两侧的各4个pX459-gRNA质粒两两组合(共计16对，gRF1/gRR1、gRF1/gRR2、gRF1/gRR3、gRF1/gRR4、gRF2/gRR1、gRF2/gRR2、gRF2/gRR3、gRF2/gRR4、gRF3/gRR1、gRF3/gRR2、gRF3/gRR3、gRF3/gRR4、gRF4/gRR1、gRF4/gRR2、gRF4/gRR3和gRF4/gRR4)，分别共转染CEF，置38.5℃、5％CO2培养箱中培养24h后，以5000PFU/孔的接毒量接种GX0101病毒，继续培养48h后，取样进行PCR鉴定。
用0.25％胰蛋白酶消化上述病毒感染后的CEF，充分吹悬后取一半细胞悬液以1000r/min离心10min，弃掉上清后，用1×DNA提取缓冲液(10mmol/L Tris HCl，1mmol/LEDTA，25mmol/L NaCl和10μg/mL的蛋白酶K)吹悬，金属浴65℃保温30min、95℃变性5min提取细胞/病毒总DNA。用表1中LAT-F和LAT-R引物对进行PCR鉴定，反应程序为：95℃5min预变性；95℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果显示(图2)，未转染pX459-gRNA质粒的病毒感染细胞样品中仅扩增出约1835bp的特异性野生型目的条带；16个pX459-gRNA组合质粒转染并感染病毒的细胞样品中，除扩增出1835bp的野生型条带外，在约800bp左右均出现大小不等的突变型基因编辑条带；CEF阴性对照组则未扩增出任何条带。
2、LAT-miRNA基因编辑的测序鉴定
将上述16个大小不一的突变型基因编辑小条带随机选取5个gRNA组合(gRF1/gRR2、gRF1/gRR3、gRF1/gRR4、gRF3/gRR3和gRF3/gRR4)，分别割胶回收纯化后连接pMD19-T转化DH5α感受态细胞，次日挑取单菌落，用LAT-F和LAT-R引物对进行PCR鉴定。阳性菌送样进行测序。
测序分析结果显示：上述pX459-gRNA质粒组合对LAT-miRNA均进行了有效的基因编辑，双链剪切位点发生在设计的gRNAPAM序列内侧2～4个碱基处(图3～图7)，与预期一致。其中，pX459-gRNA质粒组合gRF1/gRR2、gRF1/gRR3、gRF1/gRR4、gRF3/gRR3和gRF3/gRR4在GX0101基因组中对LAT-miRNA编辑缺失的核苷酸片段大小分别为989bp、942bp、894bp、864bp和816bp。
3、LAT-miRNA编辑缺失毒株的纯化鉴定及稳定性分析
选取编辑效率较高的1对gRNA组合gRF1/gRR2编辑的病毒感染细胞，采用有限稀释法接种新的6孔板单层CEF培养3～5d进行病毒单克隆纯化。随机挑选72个病毒单噬斑至24孔板单层CEF中，48h后取样同上进行PCR鉴定并进行电泳分析，选择PCR仅扩增出845bp编辑小条带的第21号克隆孔，命名为GXΔLAT-miRs-C21。将其进行第二次克隆纯化，最终筛选到1株LAT-miRNA完全缺失的毒株，命名为GXΔLAT-miRs-C21-15。
将该基因缺失毒株的编辑条带再次进行测序分析，结果与之前结果完全相同(图3)，证实GXΔLAT-miRs-C21-15为LAT-miRNA完全缺失的编辑毒株。将该毒株连续传代15次，PCR分析结果显示，p1～p15不同代次病毒样品中均只能扩增出845bp的基因编辑小条带(图8)，而阳性对照组中，野生型毒株GX0101中仅能扩增出1835bp大小的未编辑野生型大条带，gRF1/gRR2编辑的未纯化混合毒中可同时扩增出1835bp的野生型大条带和845bp的基因编辑小条带。上述结果表明GXΔLAT-miRs-C21-15基因缺失毒株传代稳定性良好，未发生回复突变。
实施例三、LAT-miRNA编辑缺失毒株的鉴定
1、基因编辑缺失毒株相关miRNA的表达分析
为分析LAT-miRNA的编辑缺失对GX0101编码miRNA表达的影响，选择LAT基因簇中miR-M7-5p、miR-M8-3p和miR-M10-3p，Meq基因簇中miR-M9-5p和miR-M12-3p以及Mid基因簇中miR-M11-3p进行了表达分析。用GX0101和LAT-miRNA基因缺失毒株GXΔLAT-miRs-C21-15毒株分别感染6孔板单层CEF，置38.5℃、5％CO2培养箱中培养48h后，用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，离心收集病毒感染细胞沉淀。提取上述细胞总RNA，测定浓度后利用TaqmanTMMicroRNAReverse Transcription Kit试剂盒进行反转录制备cDNA。以上述cDNA为模板，利用ThermoFisher公司提供的miRNATaqman探针，通过qRT-PCR法测定上述miRNA的相对表达量。
以miR-M11-3p为内参分析的结果显示，亲本毒株GX0101中上述miRNA均正常表达；GXΔLAT-miRs-C21-15毒株中miR-M9-5p、miR-M12-3p和miR-M11-3p均正常表达，而miR-M7-5p、miR-M8-3p和miR-M10-3p均未检测到表达(图9)。上述结果进一步证实LAT-miRNA被完全编辑并缺失，且未影响Meq和Mid基因簇中miRNA的表达。
2、基因编辑缺失株相关蛋白的表达分析
为了分析LAT-miRNA的编辑缺失是否影响MDV编码蛋白的表达，以pp38和gB蛋白为对象进行了检测。取GX0101亲本毒株和LAT-miRNA基因缺失毒株GXΔLAT-miRs-C21-15，分别接种至48孔板单层CEF，置38.5℃、5％CO2培养箱中培养3d，待显微观察出现明显病毒噬斑后，弃去细胞培养基，每孔加入200μL冰浴的甲醇/丙酮(1:1)细胞固定液，室温静置10min；弃去细胞固定液后用PBST洗三遍，充分甩干后加入含5％脱脂奶的PBST封闭液，500μL/孔，置37℃温箱封闭30min；弃去封闭液，PBST洗三遍，甩干；加入MDV-gB单抗稀释液(1：2000)，100μL/孔，37℃孵育30min；弃去MDV-gB单抗稀释液，加入PBST洗三遍，甩干；加入Dylight 594GoatAnti-Mouse IgG二抗稀释液(1:1000)，100μL/孔，37℃孵育30min；弃去二抗稀释液，加入PBST洗三遍，甩干；同上操作孵育MDV-pp38多抗(1:5000)和Dylight488GoatAnti-Mouse IgG(1:1000)二抗；最后加入PBST洗三遍后甩干，每孔加入200μLPBST溶液后置倒置荧光显微镜下观察结果。
结果显示(图10)，GX0101和GXΔLAT-miRs-C21-15感染CEF细胞后，均能形成典型且形态相似的MDV病毒噬斑，说明LAT-miRNA的缺失不影响病毒粒子的形成，并且在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光标记的gB蛋白和红色荧光标记的pp38蛋白的表达，表明LAT-miRNA的缺失并未影响gB与pp38蛋白编码基因的表达。
3、基因编辑缺失毒株体外复制能力的分析
取GX0101亲本毒株和LAT-miRNA基因缺失毒株GXΔLAT-miRs-C21-15，分别接种至6孔板单层CEF(100PFU/孔)，置38.5℃、5％CO2培养箱中培养。分别于接种后24h、48h、72h、96h和120h，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，离心收集病毒感染细胞。用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取病毒感染细胞沉淀的总DNA，测定浓度后保存于-20℃。将pMD18T-gB和pMD18T-OVO质粒进行10倍比稀释后建立qPCR标准曲线，以提取的DNA为模板，用表1中列示的荧光定量引物对yg-gB-F和yg-gB-R以及yg-OVO-F和yg-OVO-R，通过SYBR GreenⅠqPCR分别测定两个毒株感染细胞后不同时间点gB和OVO的基因拷贝数。计算gB基因拷贝数/OVO基因拷贝数比值，绘制病毒的体外增殖曲线。
结果显示(图11)，病毒感染后24h～120h，两个毒株的病毒量均呈现持续上升趋势，并且在病毒复制过程中呈现出相似的体外增殖曲线，同一时间点两毒株的gB基因拷贝数无显著差异，说明LAT-miRNA的编辑缺失不影响病毒的体外复制能力。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用
<130> 基因工程
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aggctatcat ctattcaacg agg 23
<210> 2
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<212> DNA
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<400> 2
ttgcggagtt atatgttacg cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttcccagcct ataagaatcg tgg 23
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gatatgtgga tcgggaatcg agg 23
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
atcaacatgg caaaacgatg tgg 23
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccaattaaag tattaaggag ggg 23
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<400> 7
gattgtgcct tggtgcgggg cgg 23
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<212> DNA
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tgactagcag tgtgtaaggg cgg 23
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gttcctgatt tccttccgct acc 23
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ggccgttaat gacacttacg ttgac 25
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gccttttgct ggccttttgc tc 22
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cgggccattt accgtaagtt atgtaacg 28
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tctagggcat ggcacacgac 20
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gaatacggaa acacagagcg g 21
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aagcaagaga aatgggctga t 21
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aggaggggaa gacatccagt a 21
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caccgaggct atcatctatt caacg 25
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caccgttgcg gagttatatg ttacg 25
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caccgttccc agcctataag aatcg 25
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aaaccgattc ttataggctg ggaac 25
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caccgatatg tggatcggga atcg 24
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caccgatcaa catggcaaaa cgatg 25
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aaaccatcgt tttgccatgt tgatc 25
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caccgccaat taaagtatta aggag 25
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aaacctcctt aatactttaa ttggc 25
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aaacccccgc accaaggcac aatc 24
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caccgtgact agcagtgtgt aaggg 25
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aaacccctta cacactgcta gtcac 25

Claims (4)

1.用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物，其特征在于，所述gRNA引物位于马立克病病毒LAT基因簇miRNA即LAT-miRNA的5’ 端和3’端两侧的保守区域，分别为：LAT-gRF1、LAT-gRF2、LAT-gRF3、LAT-gRF4以及LAT-gRR1、LAT-gRR2、LAT-gRR3、LAT-gRR4，其序列分别为序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的gRNA引物用于马立克病病毒LAT-miRNA基因编辑的方法，其特征在于，所述方法中合成gRNA引物的上下游单链oligo分别为：LAT-gRF1-5p、LAT-gRF1-3p、LAT-gRF2-5p、LAT-gRF2-3p、LAT-gRF3-5p、LAT-gRF3-3p、LAT-gRF4-5p、LAT-gRF4-3p以及LAT-gRR1-5p、LAT-gRR1-3p、LAT-gRR2-5p、LAT-gRR2-3p、LAT-gRR3-5p、LAT-gRR3-3p、LAT-gRR4-5p、LAT-gRR4-3p，其序列分别为序列表中SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的gRNA引物在与GX0101毒株具有高度保守LAT-miRNA基因序列的血清1型马立克病病毒MDV-1毒株的编辑及基因组改造中的应用。
4.一种如权利要求1所述的gRNA引物在LAT-miRNA基因位点的基因编辑敲除、外援基因编辑***或重组疫苗研发中的应用。
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Marek’s disease virus encodes MicroRNAs that map to meq and the latency-associated transcript;Burnside J等;《J Virol》;20060930(第80期);图2，表2 *
Marek’s disease virus-encoded microRNAs: genomics, expression and function;LUO J等;《Sci China Life Sci》;20101031;1174-1180 *

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