CN111187756A - 一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种槟榔黄化病相关病毒，该病毒命名为槟榔黄化病相关病毒Areca palm yellow leaf disease virus AYLDV，保藏编号为CCTCC NO：V201947。本发明还提供了该病毒的检测方法和检测用试剂盒。本发明从槟榔叶片中分离到的病毒，属于长线性病毒，形态为弯曲线性，10‑20nm×2000‑3500nm，为研究槟榔黄化病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。

Description

一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法。

背景技术

槟榔在海南是仅次于橡胶的第二大热带经济作物，被称为“绿金”，种植面积近140万亩，其产量占全国95％的份额，全省近230万农民种植槟榔并以此为生，其病虫害防治一直是政府、农户及科研机构最为关注的问题之一，而植物病毒病是目前病害中危害最大，防治最难的一类病害。槟榔黄化病(yellow leaf disease)是影响槟榔生长和产量的最严重的一种侵染性的病害，引起植株的叶片黄化，甚至出现畸形，最终导致果实和叶片的脱落死亡。目前尚无可快速鉴别诊断槟榔黄化病相关病毒的检测方法。因此建立一种槟榔黄化病相关病毒快速鉴别诊断方法对槟榔栽培种植具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法。一方面该病毒为研究槟榔黄化病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。另一方面本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。

本发明的第一个方面是提供一种槟榔黄化病相关病毒，该病毒命名为槟榔黄化病相关病毒(Areca palm yellow leaf disease virus,AYLDV)，于2019年07月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201947。

由于槟榔黄化病相关病毒是一种单链RNA病毒，基因组RNA的合成直接由其依赖于RNA的RNA聚合酶进行复制，在RNA复制过程中，依赖于RNA的RNA聚合酶缺乏3’-5’的纠错功能，导致基因组在自然复制时容易发生突变，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在≤30％的变异，因此在检测时，还需针对≥70％同源序列具有检测能力。

因此，本发明的第二个方面是提供一种引物对，所述引物对为：

L-F：tgcttccgcaaatctaccaactg，L-R：ttcttccataccttcgcaacacg。

本发明的第三个方面是提供一种试剂盒，其含有本发明第二个方面所述的引物对。

可采用常规PCR检测、SYBR Green I染色的实时荧光定量PCR检测、数字PCR检测或依赖于解旋酶的等温扩增(HDA)检测，本发明对此不进行限定，试剂盒所需其他成分，本领域技术人员可根据所掌握的技术进行合理配置。

所述试剂盒还可包括核酸探针，所述核酸探针的序列为本发明第二个方面所述的引物对，核酸探针可以用地高辛(DIG)、荧光素或者放射性同位素等进行所有核苷酸或特定核苷酸，如DIG-dUTP的掺入法标记；也可以用DIG、荧光素、报告基团、荧光淬灭基团或放射性同位素等进行末端修饰标记，例如探针的5’端标记FAM、HEX、VIC等，3’端标记淬灭基团TAMRA等；进行直接对槟榔黄化病相关病毒(Areca palm yellow leaf disease virus,AYLDV)或其他变异的同源病毒的基因组核酸(同源性≥70％)进行独立的原位杂交或斑点杂交检测，也可与实时定量PCR技术联合，进行Taq Man探针或Beacon探针的荧光定量PCR检测。

本发明的第四个方面是提供如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒在检测如本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒和/或与其同属且同源性≥70％的病毒中的应用。

如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒用于检测下述特异性序列：

(a)本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸的整体或部分特异性RNA序列或该RNA序列转换的DNA序列；和/或

(b)与本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸序列的特异性RNA序列或转换的DNA的同源性≥70％的RNA或DNA序列；和/或

(c)(a)、(b)的简并碱基的RNA或DNA序列；和/或

(d)与(a)、(b)的简并碱基的RNA或DNA序列的同源性≥70％的RNA或DNA序列；和/或

(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的RNA和DNA序列；

其中，本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第五个方面是提供如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒在检测槟榔是否会感染黄化病中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种槟榔黄化病相关病毒的检测方法，其特征在于，采用如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒对如本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒和/或与其同属且同源性≥70％的病毒进行检测。

使用所述试剂盒的检测方法包括但不限于常规聚合酶链式反应(PCR)、恒温对流PCR、套氏PCR、实时荧光PCR、恒温对流实时荧光PCR、数字PCR、斑点杂交、原位杂交、环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增技术(HDA)、交叉引物扩增技术、核酸快速等温检测放大技术；也可包括但不限于同时对1株或1种以上槟榔黄化病相关病毒与其同源种或变异种的基因芯片、芯片检测；还可以包括但不限于同时对包含槟榔黄化病相关病毒及其同源种或变异种的基因芯片、芯片检测。

其中，所述引物对的扩增目的片段为428bp。

本发明从槟榔叶片中分离到的病毒，属于长线性病毒，形态为弯曲线性，10-20nm×2000-3500nm，为研究槟榔黄化病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。

附图说明

图1为槟榔黄化病相关病毒的电镜图片。

图2为槟榔黄化病相关病毒的***发育进化树。

图3为检测槟榔黄化病毒的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNAmarker D2000，1-10：槟榔黄化病叶，CK：槟榔正常叶。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

生物保藏信息

本发明的病毒从槟榔病叶中分离到，该病毒命名为槟榔黄化病相关病毒(Arecapalm yellow leaf disease virus,AYLDV)，于2019年07月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201947。该病毒形态为弯曲线性，10-20nm×2000-3500nm。能够侵染槟榔，主要表现为初期底部或中部树冠的叶尖变黄，后期整株叶片黄化，部分植株出现叶片枯萎甚至死亡。

实施例1槟榔黄化病相关病毒的分离、纯化和鉴定

1.1分离和纯化

(1)取槟榔病叶200g，用5倍体积(1L)的Extraction Buffer(0.2mol/L NaAc缓冲液，Ph5.0，加巯基乙醇至0.2％)于搅拌机中匀浆，四层纱布过滤，冰浴30min；4℃,8000r/min，离心10分钟，取上清；加入PEG6000、NaCl、Triton X-100分别至终浓度8％、0.2mol/L、0.5％，4℃搅拌45min；4℃，8 500r/min，离心15min，弃上清，用滤纸小心吸去残留液体；用0.1倍于Extraction Buffer体积的Tris-Citrate Buffer(0.1mol/L Tris pH6.5，0.032mol/L柠檬酸钠，加入Triton X-100至终浓度0.5％)重悬，4℃搅拌45min；4℃，10000r/min，离心10min，取上清；将上清转移到超速离心瓶中，用配有平针头的注射器伸入液面以下将30％蔗糖垫溶液从离心管底部缓慢注入；4℃，27000r/min(转子型号：HITACHIP50AT2)，离心2h，弃上清，沉淀用300μLTris-citrate buffer重悬，即为病毒粗提液。

(2)电镜观察，将病毒粗提纯液(5μL)置于2％磷钨酸溶液(pH6.8)中负染约3min后，用透射电镜进行观察拍照。

(3)全基因组扩增：在通过高通量测序获得部分槟榔黄化病相关病毒序列的基础上，在此基础上设计引物对全基因组进行长片段的扩增和验证，然后采用SMARTER RACEcDNA Amplification Kit扩增S片段的3’末端和5’末端的以获得全基因组序列。

1.2种属鉴定

槟榔黄化病相关病毒电镜图片如图1所示，该病毒呈弯曲线状，10-20nm×2000-3500nm。全基因组扩增检测该病毒核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，根据槟榔长线性病毒科各个科(属)病毒基因组的氨基酸序列，利用Muscle软件进行比对，利用Mega软件构建长线病毒科病毒开放阅读框ORF1a最大相似度进化树(图2)，***发育进化树显示该病毒与长线性病毒科隐症病毒属的亲缘关系最近。对其进行了保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201947。

实施例2检测槟榔黄化病相关病毒的PCR试剂盒

检测槟榔黄化病相关病毒的PCR试剂盒包括表1所示成分。

表1

由于槟榔黄化病相关病毒是一种单链RNA病毒，基因组RNA的合成直接由其依赖于RNA的RNA聚合酶进行复制，在RNA复制过程中，依赖于RNA的RNA聚合酶缺乏3’-5’的纠错功能，导致基因组在自然复制时容易发生突变，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在变异，因此在检测时，还需针对≥70％同源序列具有检测能力。因此，本实施例针对病毒基因组中保守区域设计了引物L-F和引物L-R来进行对槟榔是否会感染黄化病进行检测。其中，引物L-F和引物L-R的序列见表2。

表2检测槟榔黄化病相关病毒的引物序列及扩增片段

参照以下方法检测：

1、将槟榔黄化的疑似感染组织匀浆提取后，提取RNA，调节RNA浓度至500ng/μL，再反转录为cDNA。为了提高合成效率，先将RNA模板、随机引物(Random Primer)与无RNA酶水(RNase-free Water)加入PCR用八连管中混匀，65℃孵化5分钟后，冰浴2分钟，然后再加入其它组分。

RNA模板 2微升

随机引物(Random Primer) 1微升

无RNA酶水(RNase-free Water) 5微升

其它组分：

2×TS Reaction Mix(R-Mix) 10微升

Enzyme Mix(E-Mix) 10微升

gDNA Remover(Remover) 1微升

2、将各组分轻轻混匀，使用PCR仪进行孵育得到模板cDNA，程序如下：

20微升体系：

(1)25℃ 10分钟

(2)42℃ 30分钟

(3)85℃ 5秒

3、然后利用如表3所示的引物进行PCR扩增。具体的反应体系与条件如下：

加样成分如表2所示，依次加入相关试剂，混匀后分装,加入检测样品cDNA。按以下程序进行PCR检测：

4、将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图3所示。泳道1-10为感染该病毒或其变异体的感病槟榔的扩增条带。

5、实际应用：

对300份感染本发明的槟榔黄化病相关病毒的阳性样品进行检测，以及300份未感染本发明的槟榔黄化病相关病毒的阴性样品，用上述检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tgcttccgca aatctaccaa ctg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

ttcttccata ccttcgcaac acg 23

<210> 3

<211> 17523

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

aagcgatatt aaatactttt caacaatggg tttctccaat ttctctttca ctctctgcag 60

tccacaaacc aaaattaacg aaaatataaa aaataatccc acaaaatcca aagttaccca 120

gctgctagaa tcagggaaac ctgacttacg cagcattccc atcacccccc caaattggct 180

tcgattacca aaagacgtcc agctgaagga cgttgtctgc tggttgcgac ccggctcatc 240

ggaaatatat tatactacga gggttgcacc tgtctaccaa tataatactc aaaaaagatc 300

aatagacaga cgaaaaatcc ggcgaattcg aaagagacgt agaaataaat tattgtctaa 360

gatttcgtca atgtatgacg cacctctcca tgctggcagg cggaggtgta ttaaaaaatt 420

tttacgggag ttattctcta ctccctatgc cacttgcaag tccatcccat atcccttcat 480

caaacagcat aaggggtggg ctgtgcaaga aatactgctc cagttaagaa atactgacat 540

tcaagtggga gcagtagctg tgagcgctga caaagccaac tttggcgtgt catcgtctca 600

tttttactct aatcttactt ctaagattag acttctcatt aaattggacg accaaatgaa 660

aacgttttct ggggtcttcc aatccttttc tgatcaacag tccgttgatc ttttgcgctt 720

cagtggtaag cgtacttact cccgcaatcc taattatgtt aggattgttt tagactgtac 780

catgctatca tggttgggga agcagtctaa catagccttt tcttataatt tctttaaccc 840

cttctccaaa ttaagctggt tgattaccag ttttatttgt aacgttgcta taaaaaataa 900

actgttagca acaatattga actatttccc atccaggcag tttgcattaa ctcaaccaat 960

ggcctgggat ttaaacagaa tcttcttggg tatacctaat cctgtactca aggataattc 1020

tgatcagcaa cagaaaactc aacagtccaa atctgttgag cggatttacg agcgcaaatt 1080

gcgactcggg gaggatagtt acagaattct actaaaagtc gttgcgaata tggtaaaaga 1140

attctgtgtg ttcagaaact ctgaacaagg agtgattgtt aaaaatactc ctgaaactgc 1200

gcgtatattt tttaacaata cgctaaaaaa cggaaaattc tatattccgg acgaggccct 1260

tatgtctaac gggcggagtt atgcgtccgg taagggtggt ctatgctggg ctaatgcttt 1320

tgcattttat aatattaaga tacccaagac attacccttt gtaccaaaac ttttcgcgac 1380

tcagctgatt aaagcagggt tgcctactaa ttttctgaaa cactgtcggg ttgtcggcaa 1440

taatctactt cattttgaca aaaactttct tcaaacaaaa agatttttgt tgcataatgt 1500

tgctgttggt gcagagagaa acagtacata ttgttatacc aacctaacat caaaaatcag 1560

gttgttaatt aaaattaaca ctgttacgaa aaacatctct ggttgtttcc agaaatttac 1620

cgatacacca gcaaaagatc ttctgcactt ttctagcaga cggttatata gtcaaaatcc 1680

caactatgct agaattgctt tggactgcca tatattgcgt tggatggacc aaccgtctaa 1740

tagaaagttc tcttatagtt tttataaccc agattctttg ttgggtgaat tactgactag 1800

cttcatttgt cttgttgcgc tgagaaataa acaattgcgt aacatcttaa actattatcc 1860

ttcgaaaagg ttcggggtta atcaaatgaa ggcttggaat ctaaataaaa tatttttgaa 1920

tattccaatt cctaagcaac aaccaccagt gagggcaaac caacaaccga taaaaccttc 1980

gggagagcaa cagatcaccc agaaacgttt tcaaattggc cctaacaaat atcttttaca 2040

aactaaaatt attggtggtc gggcaatggc atttagagtg ttcaggaact cagaagcacc 2100

agttattgtt ataaatcgtc ccggaactgc tcgaatcttt tttaacaata ctctttttaa 2160

tcgccaatac tatatcccaa gtgaggcttt aatgtgcaac aacaaaactt acgcgtctgg 2220

gaaaggtgga ctctgttggg tagatgcctt tgcattttac aatagaatca taccaaaaag 2280

tttacccttt gttcccaaac tttatgccac acaattgatt gcagcgggtc tacctgctca 2340

gtttttaaaa tcttgtcgaa ttgtggaaag aaaccttctt catttcgacc cgaagatcgt 2400

acacaataaa tggtataatc tacataatgt tgttgtaggt gcttcgtcgt ctgatatcga 2460

tgaagatagc ttacaatgta attatgattt tacaatgcaa gaccttgtcc aaaaactttt 2520

gttaaaaaca caacccaagg ctgacaatct aacgttcaca gccatattaa ataaagctgt 2580

tgagcagttg catgattgga caagacgacg aaccgacgtt acgattagtg tttgtttgtc 2640

tataaatcag aagaaaattg ttgcagaact ttttcctgaa tttaagatca gttattcggg 2700

tatttcctat agttctcacc ctctatttac tgctgtcagg gaattagaga actattgcat 2760

ttttaatcga tttaaaggaa aatcatttat cgattttggc ggtaatgtct taactcatta 2820

tcgcttggga tgtaaagata ctcatatatg ttgtcccatt gttgacataa aagattcagc 2880

acgaacaatt gatagaaccc ttcaattaga ttatacaatt ttacatgatg ttgggattac 2940

tctctgcgat aagttagctc aagaatgcga tgcgccagct gaccgtggtt gcatggttga 3000

ggtatatgac atgtctcttg cagatattgc aaaagctatg attagtcatg gaattaaaca 3060

atttttcttt tacatctgcg cgccaggtga attgttaagt gattttgaca ccattaatct 3120

ttataatgga gcttgcaata ttgtaaagac tggtgatcag gttacttact attatggtgg 3180

ttcagcagaa ggatatactc ataatttaac taagctgaga gaattaatga gtcgtcattt 3240

cattaaagta aatgggcatt gctttcgcaa aactctagaa gtgagtaggg gacctttcca 3300

attattctcg attgtattag ttccctctat tccccctggc acatacgatt tcacaaccag 3360

aattgctaac catcaagttt ctaaaatctt ggtaaaagta ccagttactg acaagtttgg 3420

gaatatcaca cttacagatc ttattgttga taaatctcta gtagtcaatc tcgtcgagta 3480

tactgccaat tgtattgaag gcatcaataa gaaaggcttt gaacatttaa tgagtcaatt 3540

tagaagccgt aaagccttta agatttataa taacaaagtc attaatgagg aagtcgagat 3600

tcctttagaa ctattagaag gattcctcgc caccataatg gccactggca tgcgcatcaa 3660

cgataaaacg tgttatttag cacgctttgt atacaataca tattattgtc caacaataat 3720

taaagtaata ttattcggct taaaatcaat cttctcaaaa ttttcacaag catgctataa 3780

gaaaattatt aacattttga ggtggttact tggtaattgg gttgtcgaat atgcagacat 3840

taatgatggg aaattctttg attttaacag tagttatgta attaaagaac aagttataat 3900

cactagcaaa gatgaagttc aatcatctat tgttcatgca tatgaggagg ctttagaacg 3960

tggtaaggaa tttatcgttc acgccgatat ggaagatctt actggtctaa tgaatgaaac 4020

ctgtgatgtt ggtggtggtg gaatgaagtt ctacaccgac tgggatattc gtatcttagg 4080

agaattattt gaacaccctt tattcccacc agtagctcaa aatctaacta atattattta 4140

taagatattg atggtttcaa gagttttaac tcaaatgttc aaagattcga aaatttcaag 4200

aattttcatg aaatgttgta aggatacttt caatcaaatc tggaggttga cttcgcatat 4260

agatattcta aattggttta aaaatcttta tttaatgtgc aaaaatagtg tcaaaaaatt 4320

ggtttcattt attaaccaat gttataccag tctaaggcaa tatattagaa atctaaaaat 4380

ttctacattt caagctttct tttcggaagt cgaagcccaa atggacgaga tcgacgaaat 4440

ggataatatt gatttggctg aatttggtaa atggttagtt ttgaatcatc atgattttga 4500

tgaatttaaa acattgtcct ttgatgaaca atcaatgcta atatcgacct ttaaacttat 4560

ctctgaagga caagctggtg tgatacgaga tgacgaagac atttttgaag atattccact 4620

tggggatgac agagactctg cgaatgttct ctatattaat cactacactt caatacctat 4680

cagccaagta agtagtcaga cttatggtag gtttaatctc tcagttggag atatggagat 4740

acttaaatcc actgtagagt ctggtggggg ttatagacga tctaatttta gaaaatatat 4800

ccagacaatt cgtgctgata tttatctttt ggcaaattct gtgatagtat attttaataa 4860

taaatttgag attcttacca atttcctccg aggaaaatat ctagtaataa aaagtttttt 4920

ccgaccttca gatgaaaatc ttgttaaaat catgttttat tccttccatg aagtttatat 4980

caatgaccat tcattattta aatggtatag tatacaatat atttataaaa atttaatcaa 5040

tggtggtata acaattttca taaatgtatc taatatattt agaacatatg tgaagtttat 5100

agctgataaa gaagtagttc aaaaaatttt tgatgaagtc acattattga aaacttcatt 5160

ttgtagtacc agtctacaaa tggtcatgac tggcacaatg aatctacgca ccatctgctt 5220

ttttccagta gcatatggta ttgcgcggta tatcgggcat aagtccagtt actcgaagag 5280

ttctccaatt acagatatct taacttctgc aataaccaca ggtagtgctt tatcaccaaa 5340

caatctcatg ttggctagcg ctaactccct gattgtaaaa acgcggtgga tgaaatttgc 5400

tacttcctca gaatggtttg caggattagt gcaagattct cttgcatcat ttatcttgga 5460

gggaccgaca aaaacaatat tagattggtt cctaaccaaa tatggtgtac taatactaat 5520

cacattttta tttgtttgtg gtggaaatgt ggcgtatggt atttacttgt tattagcaat 5580

aaaatatttt acaagctttt ataacaaggt ggtaccttta agcaatattg ctattgccac 5640

tggatgcagt attaaaaacc taacaacttc tagcgcgatc aaggaagctt gtaaagttgt 5700

acaggaaaag aaatttgggc ggagtagtca tccatctaga tcgaagaagc aaaatagagg 5760

taagacaaca attaatgaac aatcagatga tgattgtgat gccgacactc attctaaaca 5820

cagcgatcag tcagtaggcg aacaaaatct tcctagaccc caatttgaat gtggtgaatg 5880

ctcaaaaact ctctcccaaa aaatcgtctc agaacaattt caaccaatgg ctattgcaac 5940

tttaaatgag tcagagattt cagttgactt gaaagatgag aatctgaccc catctgatca 6000

attgattaaa gatcgattta ctcaaaactt tcgagttctt tgcaaaaacc cagatataaa 6060

aagatgtact gtgcttaaaa attacccgaa tactatcacc acagttatgc aaaccagtta 6120

tgaaccactt actcaatgct ttaatgaata tttattcatt gaatcgcaaa caattcttca 6180

gcaccttggc aaagttagta ctttggctaa tgtgataaag caagggtttg ttacaatacc 6240

tgagattaag aagatgctca atgattctag tttatatata aaattacctg gctcttcttg 6300

ggaatcttta ggtaggaaga agatttttct caagaaggac ccaatctttt gcttctcacc 6360

tgatgtaaca aatagtgaaa attatttgga taaaaatagt atcctaatat cgacttctga 6420

atttgaagtt ggtttcgcaa atcagagatt ggtgaagatg gaggcgatgt tagaaactaa 6480

tctaatgtta ccaactgttg ctagtgttgc caatttagtt gcttttaatc aaccaccagg 6540

aagtggtaaa accaccaaca ttgctcagca catggttgag gcaatgagga aaaaccgact 6600

ctgtcttgcg gtaacagcga ctagagtagg ttgtagtgaa cttcaaaata tgttatgtaa 6660

attgttgaaa gtttctagaa ttaacaatgt ccatacaata gattcttttg tattacatgg 6720

acaacgccga actgttgatt tgttattaat cgatgaatgc tatatggcgc atagtgggca 6780

attatgctac ctgttggcga atgtcacggc attgcaaatt gaattttttg gtgataggaa 6840

tcaaatcccg tacacatgcc gtattgacga ttttgtggcc cgttatgcct caagtttatt 6900

taaatatgtg aaaatagtcg aagatgacaa aagctacagg tgtcctgctg acgtctgcta 6960

tttgttgtct caactatgtg atgatcaagg taatcactta tattctaaag gtgtttgtgc 7020

agcgaaaaat ccccgacttc gcactatgtg cgttaaggag ataaacggtg ctgctgatat 7080

cgaatttgat aagaacacaa cttatatcac ttatactcag gccgctaaaa cagaattgaa 7140

taatatgttt aatattgaca ctgttcgtac tattaatgaa attcaaggtg ctacccgacc 7200

acatattacg ttggtgagat tggacaattt tgagaatcct ctatatcgtg atactcacca 7260

atttgtcacc gctatatcca gacataccga aacattcact tacttaacga caccgatgaa 7320

cgttaatgat actgttggtg gcgcaattaa ctccttaact acaatcgcag attgtgttat 7380

agctcaattc ggattcaaac agtgcgtttg acagatttga gttacattta gacattacgc 7440

ctttaagttt cagtaaagct agaccgagtt tatctaacat atatgcggtg cgggatttta 7500

tggaactagt cttcccacaa atgcctgcat ataattttgt atataggaca ctgagcttcg 7560

agtatggtga tttttctatc ccgttttgcg aagatttacg tgttcgtgag tcgaaaagta 7620

aggcatatag acccaacacc tatctacttc ctaatttatt gggtaagggt gagcgcgcca 7680

gaccgaatac ttggcgacaa gtagtgctat ctctttccaa tagaaatttt gctgctcccg 7740

acataaatga aaatctagat gttgagaatg tttcgaactt attatttacc gcctttctta 7800

aatgcctacg taaagatcgc tcgagcgaat atttcgagaa tatcgtacca gatattcata 7860

agatagatga gtggttgaca acgagagata gtagaaaata ttctaatgta cttaaaactt 7920

tagatacaac tccatggccg actctgattc aaaaaatgaa actaatggtt aaaggggata 7980

taaaacctaa attagatgtt ggacatttta gcaagtattc accaactgca aacatcgttt 8040

actttgaaca catgattaat atgtttttta gcccgatttt tcttgagata ttcgggcgaa 8100

ttaaatattg tcttaatgac aatataattc tatattgtgg gttaaatctt accgatttat 8160

ctaaactaat caagagtaag ttaaggcaac ctttagatac ttataacttt tgtgaattag 8220

atttctctaa atttgataag agtcagggac aagttatcaa attctatgag gctcttgtct 8280

ataaattctt taacttttca ggaaatgagt atgacaattt tgcgttgtct gaatttttct 8340

gcaatgcgac agctaattgt ggtgtcaatg ttgatctttt ttgtcaacga cgaacaggct 8400

cgccaaacac ttggttgtct aatactataa caactctagc tatgctggcc agtgtttatg 8460

atttttcaaa cttcgattgc atactggtaa gcggtgatga ttcactttta atcagtaaag 8520

atccaatccc taataagagc ttagatctca atcagatgtt tgggatggaa tgtaaatatc 8580

tacctaaccc aacaccatat ttctgttcta aatttatcat acaggtggat gaagaaatta 8640

ttattgttcc agacttagtg aggttgtatg agaaattaag caatcccatc tctttgtctg 8700

ataaggaaca tccgactctc cttagagaac ggttcacttc ttacagagat ctacttgatg 8760

cttacttcga cgatacaaca tacttgaaaa tggactctta tttggcgaag cggtacaaca 8820

ttcctgaatt ttctgggtac gcagctttct gctttgtcca tgtgctcttt tctagtgtaa 8880

aaaatttttc caagctacta tattctgatc acgaagtgtt aatataagat ggtttttcat 8940

tatatagctg tagtgatctg tctatgttta ttccttcgct tatttctctc tctgatcaca 9000

ccaccaaggg attttctacc atcctttaag cgttattgaa tgtgtgatta attaataata 9060

aatagtattt ttatctatag tatagtaact tataatggtt ttagttggtt tagattttgg 9120

aactacttat agttctatag cttcagtgag tagagaagag tctttagtac tctcgctcaa 9180

tggtactcca tacatcccca ccatattggc aattgttgat aacagcaaaa ttctggtggg 9240

tgagggggca aaaacagtca agaattactc aaataattat tcactctttt atgatttaaa 9300

acgttgggtt ggagtgactg ctttaaattt tgatgtatta aaagctaaac tttctccgaa 9360

gtaccaatgc acatttaaaa atggtgattg ttacatcgtg ggagaaggta acggaaattt 9420

tgaggcaagc gttaaaactt tgatctgtga atatatcaga acattaatct atctcttcca 9480

agaaactttt aatgtcgtaa tcaacgcaat caatgtgtca gtgcctgcgg attatacttc 9540

tttaaaaaga aaatatatga aatcaatact cttgcaatta ggagtgccac tcaacagaat 9600

tatcaatgaa ccttcagccg cggcattata ttcaattttt tccgctccag aggtcggtac 9660

gacaattgtt tatgattttg gtggtggaac atttgatagt tcaatcattc agaagaaagg 9720

gaagatagtt tctattgttg ataccaaggg tgatctattt ttgggaggta gagacatcga 9780

taaaagctta gcaactttaa tacattctaa aactaacact gagtttgatt ttacaatcct 9840

ctctttgata aaagaagaga ttaacaatct taacaaattc agtttcacat ttgtggataa 9900

agatcataaa ccagtatctt tcacgataac tccacaagaa tatcgcgcca ttctacaacc 9960

ttttattgac cgaagtctga aaatattaaa agatctgata gaagtaaaca atctgactac 10020

cttttctatc aatatggtag gtggtagttc tttgttaaat gaaatttata atgctgtaaa 10080

tcgatttggt caatctaaag gagcaaaagt ctatcgggat gacaatctac gtttagcggt 10140

tgccttaggt tgtgcttgct tatttagctt ggaatccgat cctgaattca catatattga 10200

tgtgaatagt caacctttgt atgatatcgg gttatatcac acaccagaaa ttgttgttcg 10260

aaaacctatg ccagttccat atacgcacat cgtgtcacat gataattcat taatttataa 10320

gactggaatt tgcgttttgg agggtgatgc tccatggttt ctagaagcag acccacttgt 10380

caatacatca atatcaacag atattgtttc aaaagcaggt gaaggtttcg aagtccatta 10440

tatttatgca gttgatggta ctatctcaat tgaagtgaaa tcgaaagatc ataaagtcgt 10500

aaaacagcta cagaaccaac tcgaacaaag ctttgagttt aaagaattaa aattggaaag 10560

agttcagtat ggaaatgtta cagaaattgt aaccatgtta gatattataa aacaccatcc 10620

aagtggtcaa gattttgcaa ctattgattt agatttcccg aatttagctt taaaatatgt 10680

taacgaccat ggaggaatta gtagattgga tgaaatcctt cgaaatatct tatgaggttt 10740

tcgacatggg tgagggatca gactttatta ttgtactgtc agcctttgat gatggtcgag 10800

aaaaaatagt ttacatgtcg aataacaaat atttctcctt taagaaaata atatatgtgc 10860

gacttcccta tctttattcg atttttcata ggtatttaca agtagctcct ttttatcatc 10920

gtgagtgggt taataatcca gaatcgatta ctgttcagtg gccagaaaaa caagcagtgt 10980

tagagttctt agatgaattg caaattcact atgaaagatc tggaccgagt aatgggaaaa 11040

atattcttgt attggttcgt agaacagtag atggttttga aacaatcaat tacctgtcaa 11100

ataatagtaa ttttgatttt gatttattta ttagattaga tattagtgaa caacatagtt 11160

taattgatat ttttctaccc agtttaccat ttcataagtg tgaatggctt tgagaaaccc 11220

agattattta aaacttctga ccttctctag tcaatcaaat gtgaaacaga ccattctagc 11280

ttattgcaag gagcgtcaga taaataatct tagacgaaac tatactggta tagcacctgg 11340

taataaaaat aagatctttt cgtgtgattt gcatatatcg aatttacaat cctttgatac 11400

tctctcggaa aattctgcca tcgcagtaat atgtttttat atagccgaag tttgtaaagc 11460

agcatcgtca cttagatctc catatcctcc tgctaacttg tatgtgtatc acaatgatga 11520

cctcgtacga gtcctagctc catttttaga taaacgagtg gaagatatat gcagagaaaa 11580

cccatctctt ggttgtctct actcttatcg gcaaattgac gaaaaataca aagatcattc 11640

aactcttgat aaaaaattac tgtttcaatt gaacaatagt ttaagacaag aagtagattt 11700

acaaaaactc aaaccagctt ccctaaatac ttttaaggtg caattctcac ctaaagtcgc 11760

aacaaccttg atcacatcaa tagacctaat aaacacaacc aaacgtttcg tggagaagta 11820

tttcgaagta cgagacaact tacaactgca agcagttctt aggtccttta aatttttcga 11880

aataagaatg aaacaatcag tggtcaaaga aagtttagat cttttcaaca cttcattgat 11940

agtgcagggt gctgtttatt gcgtcttctt aaactacaaa taccaagatc ctgatctata 12000

tctttttaat gaatgtgtag atcgattcaa cacattatat gctcccattt tgagtaaact 12060

gttcaaaaaa gattttattg tcagaattag taatgtgcgc gatattgcag aattcgacaa 12120

tactaacttc atgttgtctg cagacttact gagccaggtt atcaaggaat taaacttaga 12180

tcctacatcc tttgtcagtg attcgcgatt cctctctcca gatattgacg ccctaattcg 12240

gcatgctatg tatgaatttt tccttacgcg atttgacctt agagatccat ttgaaaattt 12300

gtgtgtaggt ataattactt ttatctattt aacaacatca ccagggatct ttactcataa 12360

cgaacctata gattttaaat ttaccaacaa tgggaaaact tttcatataa aattccagtc 12420

attccagtta ttaaatacct tgagtaatcg tctcacagat ctgaagaatt taaagagagg 12480

gaaaaattat attagactct tttgttcagc aagagcagat ttagcaatga aacttatcca 12540

aatttttaga attgaaccac ccttattcag agaataccca aatattctac catatatgcg 12600

gttcgatttc tggaaaggta taacagtaaa aaatttaaat gaggaggaga tgatctcact 12660

aagtttattg caagaaataa ctgattacca ctcttctggt agtatcaagg caaaagattt 12720

aatttataag aaacttggaa tttaatcgct aaatattatg gatagactta acttacttag 12780

aaacgactta gctgcaattc gcactgctct tgcaaaagct gaaaatgtta ggacaactac 12840

agagcgagtt gctttagaaa cttttcaaga taatcttgat acctatcttg aggctgctgg 12900

aactaacatt gatagatcat ttttagattc aataaaagat ctacgattcc cacgacctgc 12960

tataaacact cggattgctt ccgcaaatct accaactgct gctgatgttg attctcaaaa 13020

tcctgcatta gaagatgaca tcgtcaatct aaatgcgcta tctggaagtg ttgatttcgt 13080

ttgtcaagcg ccggatgaac tatcaccaga acaaaaacaa ttagttacac aacattttaa 13140

gatgtttttt gcaaagaaag tgtttggtct tcaatctgaa aatgaattgt caactaagat 13200

gtgggctaat gcattcgcat cattatgcat ttccatttct gagcaatgga cgtcgaaaac 13260

taacgctagc aaccccgata cacacaacag tttcaaagta gataataggt cttatgattg 13320

gactcaaaaa gctctttggg attatataaa ttcggtcaat gcacttaagg caattcccaa 13380

cgtgttgcga aggtatggaa gaacttgtca tgagactatc aagcgtacat taaatgagat 13440

taattatgta ccatcaggtc gattagctgc aaagaatgga tcggtatcta attatcggaa 13500

aaatatcaca gatttcactc cgtcgtataa agaattctct actgcagaag aacaaagttc 13560

cgcattggcg acaaaggatt atgcgatcac gaaaagtgga atgggtaaaa caattgtgca 13620

tactgcccaa attgttggta atactagacg gtaaaaatgt cacaatctta tgcttctgaa 13680

tacaatttag gtagctatca caacagaact attgagatat ctatccctgc tcttcctaca 13740

cataaatttg tgctatattc aacaatatat ttccaattag gaaacgatca ggcattcatt 13800

cgtttagaac tgcgcgattt tggtactcaa tctgctgtga agctatcaca aagatattat 13860

ggatcgattc attctggaac gcagtcgcaa tttcttcgta agtatcatgt aaaaaatgta 13920

caactaacat acccactgtc aataactgtt acgtatatgt ctaattattc gataaaaata 13980

aacgattttg cagacatagt aactgagaat acatgcggaa attataattg tgtattacgt 14040

attattcatc atctttctga ttatgttatt gaaaacactc aatcagtgca agactctgat 14100

tctataacga tacagaaagt aaaaccaatt gttatgatag atggcaagtc aaatacgata 14160

gttgagagaa cacctggccc accacataaa cctattaata atttaagatt gagagataat 14220

atctcatcga actttgttgc gaatttcaaa tccaagcatc cattgcggag ttacattgaa 14280

caaccgttat cttcaattat tatcgataaa tcacatacat ttagattata ccaaactgtt 14340

caactctttc aaaatttcgg agcaatacta attgacaaga atttcaactt atccaacata 14400

ccttgtgtta tacaattttg gttatcatgt caagatgata aaactcatga atttgtcgtg 14460

cggaattctc aaaataagtt atcattagaa caatgggttc gagatgggtc tgaaatacac 14520

aagtcgactc cagaagtgtt acagattcaa gatgtgaata cgttaatact cccaatcttt 14580

ctgagttatt atacgattga agatgtgata atattttcac tgaatctatg cagggcaagt 14640

gtagtatctg gtacagttaa gaaatattca gcgggggtgg aagtattttt cgataaacaa 14700

tacgttggag gaatatctac agattctctg tattacacac caatagattg gttatattat 14760

tccgaatcag gaaaggactc aataatagac agaaatccac ggcaagatta ttattatcga 14820

attactagga ggaaagatat ggataaacca gcattgccta tgttaattga gaataaacaa 14880

gaagtgacca acctaggaaa acctcagaca aatccaccaa aatcaataaa tataggagct 14940

gatcctggtg ttagtttgat ggatcgtttg tcgccggtta agacaccctc aaatgacact 15000

gacattcaac aaccaatttc aaaaagcagt agcgaaacat cggttgttat gaccatacca 15060

attaaaagtc ataggaatgt tatcaacatc ctaccaccag aatgtgtgag atatttcgcc 15120

aatgctgaag tatgcttgaa gtatcttaaa caattcataa tagatagagg cactccaaga 15180

agtcttctta acgattacag tcatgcacct actctaaaca atattgaatg caattgttca 15240

ataagacaat tggcttatcc attctttgac tcatctaata ggaattatct acggtcgttt 15300

gggcgcgcaa atttttataa tatcgcgcaa gagatccaag caggagaact agaacctaac 15360

ttaaaaaatg tcgcgaaata tcaaataccg ttacaattct cgtacttggc agttgatttt 15420

gtatcaataa cgaaaggtga cgtgtggact gaagaagaat tgattgtttt agggaagatt 15480

ttaatctttg ctaaacaaca agatcattta tcatggaaga tcttgacacg aaagtagaaa 15540

tacaattatt tgttagattg aatgagtatt taaaacctta tattactaaa aataacctac 15600

ttaatttaac gaccgagcaa ttgaaaatat tctctaaaaa attatatgcc atatgtgact 15660

taattagtca attagataga gaagaatttt gctttgagaa tattgctgtt gtggagctga 15720

ttgttaatga tcttaaatac actgaagaag aatttgaaga atgtacggct atcacgaaga 15780

aaaaggttta caaacgagat tttgttcggc gtttggaaag tctccaaaaa ttggtagata 15840

tcttaatatt gtggcgagca aatgaattaa ttgatatgga actcatgacc gatttctgga 15900

acaattctga acatcccatc cgctacgaat tatttaaaat taaatttatt tatagtttat 15960

tagaaaagca ttcaattttg aagaccttag atctaaagat tgaattagat aataaacatt 16020

tcaaaaagtt ttacagagca tgttgtggat acaacttttt agatagaacg acattaaagt 16080

cacattattc taatttaaat ttatcaacaa aactatcggg tattgtcgat ttagatatat 16140

tgggaaaaat aaaattatga gagagttgac atttaaaata attaataata atatctatct 16200

cccaacaaat gttgataatc cgaataaaag tctgtacatt ccaatgaaca atcctcaaga 16260

tcatccactt tggaaatctc taacatctaa tgaattatgg acttatgagg aaagtaagaa 16320

aatatttcaa aatttactcc aaccgcagag tagtgtaagc aaacctgaaa tcgtacgcac 16380

accaactaat gatcaagata agtcactaca tattactaaa aaatgtatct ctcagatatt 16440

ggaagtgtta aatagaatag ctatacgttt aacacgtctg gaggaagcta tatttcatca 16500

tgctgttgaa aatttgcgag ttcccatgac tctaaaatat gcataccatc cagccaagga 16560

aaatgatgga atagataaaa ttgtagattt agaaatcaac tactaagaaa catcaaaggt 16620

taatctaagg gctaaaatat agtgatcgca atggaaaaga tcttgattag catttttgaa 16680

tgcgctttga tgagtgatgc tgtcactata tatcgaacta acagaagttt tttatataat 16740

aattacttac aattgtctcc tgtattatta agtaaagcta acttaataag atatttttat 16800

ggtcaagatg cggtagccgc aatccaagcc ggattattag cagtgagacg acatagtaga 16860

cacctcccat ctgacttgag aatttcatta ttttctataa tattacctga ttttaatcaa 16920

aaaattttag aatttttaaa agttatggat caatttcttg atacatatca taagttaata 16980

ttgatccaac tagagatcgt aattgctgag acaaaagctc aacgtacttg cgatccggcg 17040

aatgacgacg atgttggcaa ttttgccacc gaccttcaat ggaggttaga gacagcttgc 17100

cagaatcgaa aaataaatac tttaaatatc ggtgtaaata aacatgtttt aaggtgttta 17160

atcagtaaca attattcttt gaatgattgt tgcgactatt ttttcaatta taattatcat 17220

gtcggtactc taccatcgac atactatagt cctctaggtg agtggcttaa taatttcgtt 17280

tgcaattata tgcaataaaa tgggcagagt cggtatttta cgtattaatt ttattaccga 17340

ggtcatatag tgtcatagac gagtctatat tataaaatcc taaattaata tatatatatt 17400

tatatgaata gttaaataaa ttgacggact cttaaatttt caatatcaca ttgaacacct 17460

tagagtcctg ttattcttct atatatacat atatatatat atatagaaaa aataaaaggt 17520

gcg 17523

Claims (8)

1.一种槟榔黄化病相关病毒，其特征在于，该病毒命名为槟榔黄化病相关病毒Arecapalm yellow leaf disease virus AYLDV，于2019年07月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201947。

2.一种引物对，其特征在于，所述引物对为：

L-F：tgcttccgcaaatctaccaactg，L-R：ttcttccataccttcgcaacacg。

3.一种试剂盒，其特征在于，其含有权利要求2所述的引物对。

4.如权利要求2所述的引物对、或者权利要求3所述的检测盒在检测如权利要求1所述的槟榔黄化病相关病毒和/或与其同属且同源性≥70％的病毒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，如权利要求2所述的引物对、或者权利要求3所述的检测盒用于检测下述特异性序列：

(a)权利要求1所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸的整体或部分特异性RNA序列或该RNA序列转换的DNA序列；和/或

(b)与权利要求1所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸序列的特异性RNA序列或转换的DNA的同源性≥70％的RNA或DNA序列；和/或

(c)(a)、(b)的简并碱基的RNA或DNA序列；和/或

(d)与(a)、(b)的简并碱基的RNA或DNA序列的同源性≥70％的RNA或DNA序列；和/或

(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的RNA和DNA序列；

其中，全基因组扩增检测权利要求1所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

6.如权利要求2所述的引物对、或者权利要求3所述的检测盒在检测槟榔是否会感染黄化病中的应用。

7.一种槟榔黄化病相关病毒的检测方法，其特征在于，采用如权利要求2的引物对、或者权利要求3所述的检测盒对如权利要求1所述的槟榔黄化病相关病毒和/或与其同属且同源性≥70％的病毒进行检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述引物对的扩增目的片段为428bp。

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