CN114891786B - 犬Rosa26基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及犬Rosa26基因及其在定点***外源基因到犬基因组中的应用，所述犬Rosa26基因全长非编码RNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述犬Rosa26的基因序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了将外源基因定点***犬基因组的方法，经验证，外源基因获得了稳定持续的表达，该方法在基础科学研究和犬类品种品质改良方面具有潜在的应用价值，填补了目前犬基因组中定点***外源基因技术的空白。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及犬Rosa26基因及其在定点***外源基因到犬基因组中的应用，更具体涉及在犬基因组中定点***外源基因或DNA片段并使其稳定表达的方法，及其在基础科学研究和动物品种品质改良方面的应用。
背景技术
犬作为一种常见的家养动物和历史悠久的实验动物，既是人类生产生活过程中不可或缺的伙伴，也在科学研究中发挥过重要的作用。在生产生活实践中，不同品种的犬在不同地域、不同行业、不同人群中都发挥着重要的作用。在科学研究中，犬作为实验动物最为著名的贡献当属在条件反射理论的建立(1904年诺贝尔生理或医学奖)和胰岛素的发现(1923年诺贝尔生理或医学奖)中所起到的作用。近年来，随着科学技术的进步和需求，越来越多的大动物例如犬被应用于很多科学研究，尤其是学习、社交、认知等神经科学的研究之中。然而使用犬作为科学研究模式动物的很多技术方法手段还没有被很好的开发出来，定点***外源基因到犬基因组的方法就是其中之一。
在基因组中***外源基因一般有随机***和定点***两种方法，目前国际上有报道的将外源基因***到犬基因组的案例分别为2009年构建的荧光蛋白基因***犬和2014年构建的阿尔兹海默症基因***犬，所采用的方法均为传统的随机***的方法(Hong,S.G.,Kim,M.K.,Jang,G.,Oh,H.J.,Park,J.E.,Kang,J.T.,Koo,O.J.,Kim,T.,Kwon,M.S.,Koo,B.C.,et al.(2009).Generation of red fluorescent protein transgenicdogs.Genesis 47,314-322；Lee,G.-S.,Jeong,Y.W.,Kim,J.J.,Park,S.W.,Ko,K.H.,Kang,M.,Kim,Y.K.,Jung,E.-M.,Moon,C.,Hyun,S.H.,et al.(2014).A canine model ofAlzheimer's disease generated by overexpressing a mutated human amyloidprecursor protein.International Journal of Molecular Medicine 33,1003-1012)。传统的将外源基因随机***基因组的方法，通常会产生以下问题：第一，由于外源基因***基因组的位置是随机的、不可预知的，因此有潜在的风险，造成动物基因组的***突变以及基因组的不稳定，对动物自身造成一些生理上的危害或导致一些非特异性的表型；第二，***基因的拷贝数不可控；第三，由于***位点的随机性，使得外源基因不能持续稳定表达，并且其遗传稳定性较差。因此，在技术允许的情况下，不管是在基础科学研究领域，还是在经济动物品种品质改良方面，将外源基因定点***基因组特定位点都是一种更为安全、可靠和具有实用价值的技术。
本发明提供了针对犬基因组的特定***位点基因Rosa26及在该位点***外源基因并使其稳定持续表达的方法，阐述了该方法在基础科学研究和犬类品种品质改良方面的潜在应用价值，填补了目前犬基因组中定点***外源基因技术的空白。
发明内容
本发明提供犬Rosa26基因及特异性***位点，以解决外源基因随机***犬基因组导致的表达不稳定、拷贝数多以及遗传稳定性差等问题。
具体来说，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供分离的犬Rosa26基因，其特征在于：所述犬Rosa26基因包含犬Rosa26基因全长非编码RNA对应的cDNA序列，所述Rosa26基因全长非编码RNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述犬Rosa26的基因序列如SEQ ID NO:2所示，或与SEQ IDNO:2所示序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
另一方面，本发明提供犬Rosa26基因全长非编码RNA对应的cDNA序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
另一方面，本发明提供犬Rosa26基因的外源基因***位点，其特征在于，所述***位点如SEQ ID NO:4所示。
另一方面，本发明提供将外源基因定点***犬基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)针对上述的分离的犬Rosa26基因设计sgRNA序列，将sgRNA所对应的DNA序列连入含有sgRNA骨架序列的质粒中；
(b)将PCR扩增获得的外源基因序列、上述的分离的犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列、上述的分离的犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷酸序列与扩增载体连接，获得同源重组的供体载体；
(c)将步骤(a)所得的质粒、步骤(b)所得的供体载体和含有Cas9的质粒共同转染体细胞，所述体细胞选自犬体细胞，例如成纤维细胞、皮肤细胞和肾小球细胞；
(d)采用PCR鉴定5’端同源重组结果和3’端同源重组结果，若PCR产物与预期相符，则表明已将外源基因定点***犬基因组。
在一些实施方案中，所述sgRNA序列的靶向序列如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，含有sgRNA骨架序列的质粒选自：addgene#51133质粒，addgene#42230质粒和addgene#58778质粒。
在一些实施方案中，所述犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一些实施方案中，所述犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中，所述扩增载体选自：addgene#61408质粒，addgene#22677质粒和addgene#51132质粒。
在一些实施方案中，含有Cas9的质粒选自：addgene#44758质粒，addgene#42230质粒和addgene#97307质粒。
另一方面，本发明提供上述分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点***犬基因组中的应用。
另一方面，本发明提供上述分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点***犬基因组的转基因细胞模型的构建中的应用。
另一方面，本发明提供上述分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点***犬基因组转基因犬动物模型的构建中的应用。
另一方面，本发明提供上述分离的犬Rosa26基因在外源基因在犬中过表达或功能研究中的应用。
另一方面，本发明提供犬Rosa26基因的外源基因***位点在将外源基因定点***犬基因组中的应用。
另一方面，本发明提供上述分离的犬Rosa26基因在犬育种中的应用。
另一方面，本发明提供供体载体，所述供体载体包含上述的分离的犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列、上述的分离的犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷酸序列。
另一方面，本发明提供菌株，所述菌株包含含有上述的分离的犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列、上述的分离的犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷酸序列的供体载体。
定义
非编码RNA：即不编码蛋白质的RNA，它的特点是能从基因组上转录下来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能。
供体载体：供体载体在基因组同源重组过程中提供模板核苷酸序列，主要包含同源重组的左臂核苷酸序列，需要***的外源基因，以及同源重组的左臂核苷酸序列。
sgRNA：sgRNA(single guide RNA)也被称为向导RNA(guide RNA，gRNA)，它是人工改造而成的可以在CRISPR基因编辑中引导Cas9蛋白在特定位点进行切割的一段RNA序列。它由骨架序列和一段与靶位点相配对的约20个碱基的特异序列组成。
3'RACE实验：RACE即cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends)，是一种基于逆转录PCR从样本中快速扩增cDNA的5'端及3'端的技术，利用RACE可以通过已知的部分cDNA序列来得到完整的cDNA的5'和3'端。其中通过已知cDNA序列来获得3'端完整cDNA的方法称为3'RACE。
巢式PCR：常规PCR在对模板进行扩增的过程中，引物与模板之间会出现非特异性配对，导致产生非特异性产物。为了提高PCR扩增的特异性，人们对常规PCR进行技术改良，发明了巢式PCR(nested PCR)。巢式PCR是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，第二轮的扩增产物才是目的基因片段。与常规PCR技术相比，两套引物的使用提高了扩增的特异性，因为和两套引物都互补的靶序列很少。如果第一次扩增产生了错误片段，内引物与错误片段配对扩增的概率极低，因此提高了PCR扩增反应的特异性与灵敏度。
同源重组：同源重组(Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体(non-sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。人们利用这一原理，可以实现外源基因在目的基因组内的定点整合或者定点敲除。
有益效果
本发明首次克隆并鉴定了犬中“安全位点”Rosa26基因的全长非编码RNA序列，并对其在基因组中进行了定位。本发明还提供了在Rosa26基因位点***外源基因并使其稳定持续表达的方法，阐述了该方法在基础科学研究和犬类品种品质改良方面的潜在应用价值，填补了目前犬基因组中定点***外源基因技术的空白。
附图说明
图1示出犬Rosa26位点位于犬基因组第20条染色体。
图2示出3’RACE鉴定犬ROSA非编码RNA对应的cDNA片段的电泳图。其中M为DNAmarkerIII，1为使用GSP9和巢式GSP1进行3’RACE所获得的产物，2为使用GSP9和巢式GSP2进行3’RACE所获得的产物，3为1的阴性对照，4为2的阴性对照。
图3示出DOG-GFP-Rosa26质粒图谱。包含左臂、启动子、GFP、右臂和DTA等关键元件。
图4示出GFP基因定点***犬基因组Rosa26位点的示意图。图4A示出GFP基因定点***犬基因组Rosa26位点示意图，含有左臂、启动子pCMV、GFP和右臂的DNA序列与犬基因组发生同源重组，使得pCMV-GFP序列***到犬基因组Rosa26特定位点；图4B示出PCR鉴定5’端同源重组结果，图4C示出PCR鉴定3’端同源重组结果，其中左侧泳道为DNA分子量标准，中间泳道为PCR鉴定5’或3’端同源重组结果，右侧泳道为同源重组的阴性对照；图4D示出表达GFP的犬成纤维细胞，左侧图片为***pCMV-GFP序列的犬成纤维细胞，右侧为阴性对照。
图5示出pCMV-GFP序列同源重组到犬基因组后，5’同源重组PCR产物和3’同源重组PCR产物的Sanger测序鉴定结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1定位和鉴定犬Rosa26基因非编码RNA序列
定位和鉴定犬Rosa26基因非编码RNA序列具体方法如下：
(1)由于不同物种Rosa26基因启动子区和外显子1区域具有一定的相似性，因此推测Rosa26基因该区域部分在进化上具有保守性。将人Rosa26位点启动子区和外显子1区域共计1036bp的DNA序列(如SEQ ID NO:3所示)作为模板在犬基因组中进行搜索比对(NCBI/BLAST)，在犬基因组第20条染色体上比对到一个相似度为89％的序列(如图1所示)，该区域附近基因如THUMPD3等与其他物种Rosa26位点附近基因一致，因此推测该序列位置可能为犬Rosa26位点。随后我们将鉴定该区域是否有RNA表达，以确定该位点是否为犬Rosa26位点。
(2)鉴定犬Rosa26非编码RNA序列。根据上一步预测得到的Rosa26第一外显子序列，设计引物进行3’RACE实验(3’RACE试剂盒购自Vazyme，货号为RA101)，所设计的GSP(gene specific primer)引物包括：
TAGAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGGC(GSP1，SEQ ID NO:22)，
AGAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGGCT(GSP2，SEQ ID NO:23)，
GAGAAGAGGCTGTGCTCTGGGGCTC(GSP3，SEQ ID NO:24)，
GAAGAGGCTGTGCTCTGGGGCTCCG(GSP4，SEQ ID NO:25)，
GAGGCTGTGCTCTGGGGCTCCGGCT(GSP5，SEQ ID NO:26)，
AGGCTGTGCTCTGGGGCTCCGGCTC(GSP6，SEQ ID NO:27)，
GGCTGTGCTCTGGGGCTCCGGCTCC(GSP7，SEQ ID NO:28)，
GCTGTGCTCTGGGGCTCCGGCTCCT(GSP8，SEQ ID NO:29)，
CTGTGCTCTGGGGCTCCGGCTCCTC(GSP9，SEQ ID NO:30)，
TGTGCTCTGGGGCTCCGGCTCCTCA(GSP10，SEQ ID NO:31)；
所设计的巢式PCR引物包括：
GGCTCCTCAGAGAGCCTCGGCTA(巢式GSP1，SEQ ID NO:32)，
CGGCTCCTCAGAGAGCCTCGGCT(巢式GSP2，SEQ ID NO:33)，
CCGGCTCCTCAGAGAGCCTCGGC(巢式GSP3，SEQ ID NO:34)，
TCCGGCTCCTCAGAGAGCCTCGG(巢式GSP4，SEQ ID NO:35)，
CTCCGGCTCCTCAGAGAGCCTCG(巢式GSP5，SEQ ID NO:36)。
3’RACE实验具体操作步骤如下：
1)使用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific公司，货号15596026)按照操作流程提取比格犬(购自北京玛斯生物技术有限公司)肌肉组织总RNA，并确保总RNA样品无明显降解；
2)将1ug总RNA，2ul 3’CDS引物，2ul dNTP和无Rnase水混合至14ul后，72℃孵育3min后置于冰上2min；
3)将4ul 5×FS缓冲液和2ul 10×Enzyme Mix加入到步骤2)所得溶液中，42℃孵育90min，70℃孵育15min，获得总RNA的逆转录产物；
4)取10ul逆转录产物，加入10ul稀释缓冲液，即获得3’RACE-Ready cDNA；
5)按如下体积配制3’RACE扩增体系
表1 3’RACE扩增体系
| 3'RACE-Ready cDNA | 2.5ul |
| GSP(10uM) | 1ul |
| 10×Universal Primer Mix(UPM) | 5ul |
| 2×PCR Mix | 25ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 16.5ul |
在PCR仪中运行以下程序：
表2 3’RACE扩增反应程序
6)取5ul上一轮PCR扩增产物，用ddH2O稀释至250ul，按照下列体积配制巢式PCR扩增反应体系：
表3巢式PCR扩增反应体系
| 组分 | 巢式PCR | 阴性对照 |
| 稀释后的PCR产物 | 5ul | 5ul |
| 巢式GSP(10μM) | 1ul | 0ul |
| 巢式引物 | 1ul | 1ul |
| 2×PCR Mix | 25ul | 25ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 18ul | 19ul |
在PCR仪中运行以下程序：
表4巢式PCR扩增反应程序
7)将巢式PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中GSP9/巢式GSP1和GSP9/巢式GSP2两组引物能够获得特异性条带，电泳结果如图2所示：
8)将图2中特异性条带进行胶回收(ZYMO Research#D4007)，洗脱后的DNA连接到pEASY-Blunt Simple Cloning vector(Transgen Biotech#CB111)上，转化到感受态细胞后第二天挑取单克隆细菌进行测序，获得犬Rosa26基因的RNA对应的cDNA序列如SEQ IDNO:1所示，该序列长613bp。将该序列比对到犬基因组，获得犬Rosa26基因的DNA序列如SEQID NO:2所示，其中第101-171、16267-16384、20841-20925、20930-21269位置为Rosa26基因非编码RNA序列的外显子区域。
实施例2在犬Rosa26基因位点定点***外源基因
本发明以在犬基因组Rosa26位点定点***GFP报告基因为例，阐述本发明在犬Rosa26基因位点定点***外源基因的具体实施方案，主要包括以下步骤：
(1)在犬基因组Rosa26位点选择合适的基因***位点。利用CRISPOR工具寻找Rosa26位点第一个内含子区可以用来进行基因编辑的位点，所选sgRNA靶向的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。将sgRNA靶向的DNA序列(引物1：ACCGTGTCACAGCAACACGTTAGA，SEQ IDNO:5，引物2：AAACTCTAACGTGTTGCTGTGACA，SEQ ID NO:6)连入含有sgRNA骨架序列的质粒(购自addgene，编号为51133的质粒)，具体步骤如下：
1)限制性内切酶BsaI(购自NEB公司，货号R0535)酶切51133质粒后，用DNA纯化试剂盒(购自天漠生物，货号TD433)回收线性化的51133质粒DNA。
2)将100uM的引物1和引物2各5ul混合后按下列程序在PCR仪中进行退火配对：95℃，5分钟，85℃(60个循环，每个循环降1℃，15秒/循环)，25℃(10个循环，每个循环降2℃，10秒/循环)，4℃。
3)将退火配对后的引物与线性化的51133质粒DNA用T4 DNA连接酶(购自NEB公司，货号为M0202)进行连接。
4)将上述连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞(购自全式金公司，货号CB111)，第二天挑取单克隆菌落进行测序验证，选择正确连入51133质粒的单克隆菌株进行扩大培养，提取质粒DNA，得到可转录sgRNA的质粒51133-sgRNA。
使用Amaxa Nucleo-fector II核转染仪和转染试剂(购自Lonza公司，货号VPI-1002)，将4ug含有Cas9的质粒(购自addgene，编号48137)和2ug 51133-sgRNA按照程序T-016转染到犬成纤维细胞(赠自北京希诺谷生物公司)，转染完成后用DMEM培养基(含20％血清，购自Invitrogen公司，货号C11995500BT)，在5％CO2培养箱中培养48小时，换含有2ug/ml的嘌呤霉素的DMEM培养基继续培养，48h后收细胞进行PCR鉴定(PCR引物分别为P1F：GTCCGGTTGACCTTGACTGT，SEQ ID NO:10，P1R：TGCCATTCCAGAAGGAACCA，SEQ ID NO:11)。PCR反应体系和反应程序如表5和表6所示。
将4ul PCR产物和1ul pEASY-Blunt Cloning Vector(购自全式金公司，货号CB111)25℃孵育5分钟，然后将该连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞(购自全式金公司，货号CB111)，第二天挑取约40个单克隆菌落进行测序，计算sgRNA所介导的DNA编辑效率为92.9％(39/42，42个克隆中有39个克隆是被编辑的DNA序列)。
(2)构建包含有犬Rosa26基因同源臂、启动子、GFP报告基因的质粒。以addgene#61408质粒(购自addgene，编号为61408质粒)为模板，PacI和AscI双酶切(购自NEB公司，货号为R0547和R0558)获得质粒骨架序列；以TCTGCCTCTGGAATCCTCTTCTGAGCCATCTTTAATTAACCGTTTACCGCCATGTTGGC(SEQ ID NO:12)和TGTTAGGACAGTTGTCACAGCAACACGTTggcgcgccATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA(SEQ ID NO:13)为引物扩增pmaxGFP质粒(Lonza)获得GFP序列；以比格犬肌肉组织基因组DNA为模板，ACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCCCTTAATGCCTGAAGGACGAGACGAGCTG(SEQ ID NO:14)和GCCAACATGGCGGTAAACGGTTAATTAAAGATGGCTCAGAAGAGGATTCCAGAGGCAGA(SEQ ID NO:15)为引物，进行PCR反应获得犬Rosa26基因同源重组的左臂DNA序列(DNA聚合酶购自Vazyme公司，货号P525)，如SEQ ID NO:7所示；以TGGCGAAACCCGACAGGACTATggcgcgccAACGTGTTGCTGTGACAACTGTCCTAACA(SEQ ID NO:16)和GATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACGccaaggaagagctccacagtggacaaatgca(SEQ ID NO:17)为引物，PCR获得犬Rosa26基因同源重组的右臂DNA序列，如SEQ ID NO:8所示；PCR反应体系和反应程序如下所示：
表5 PCR反应体系
| 无核酸酶水 | 补足至50ul |
| DNA聚合酶混合物 | 25ul |
| 上游引物(10uM) | 2ul |
| 下游引物(10uM) | 2ul |
| 基因组DNA | 1ul |
表6 PCR反应程序
将以上所得质粒骨架序列、GFP序列、左臂序列、右臂序列，采用无缝连接的方式(购自Clone Smarter公司，货号C5891)获得同源重组的供体质粒DOG-GFP-Rosa26，具体操作如下：
表7无缝连接体系
| 质粒-骨架 | 60ng |
| 左臂(1kb) | 12ng |
| GFP(2kb) | 24ng |
| 右臂(2kb) | 24ng |
| 2ⅹ Seamless Master Mix | 5ul |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足至10ul |
50℃孵育15min，将产物转化到Trans1-T1感受态细胞(购自全式金公司，货号CB111)，第二天挑取单克隆菌落进行测序验证，选择阳性的单克隆菌株进行扩大培养，提取质粒DNA。所获得DOG-GFP-Rosa26质粒序列如SEQ ID NO:9所示，质粒图谱如图3所示。
(3)将GFP序列定点***到犬基因组Rosa26位点。
将6ug线性化的DOG-GFP-Rosa26质粒(SalI酶切DOG-GFP-Rosa26质粒后获得，SalI酶购自NEB公司，货号为R0138)、4ug Cas9质粒(购自addgene，编号48137)和2ug 51133-sgRNA如上述转染方法共同转染犬成纤维细胞。转染完成后用DMEM培养基(含20％血清，购自Invitrogen公司，货号C11995500BT)，在5％CO2培养箱中培养48小时，换含有2ug/ml嘌呤霉素的DMEM培养基继续培养，48h后收细胞进行PCR鉴定。PCR反应体系和反应程序如表5和表6所示。
用引物F1(TTCCCACCCCTGTTTTAAGTGAA，SEQ ID NO:18)和R1(CCCGTGAGTCAAACCGCTAT，SEQ ID NO:19)鉴定5’端同源重组结果，引物F2(GGCTACTACAGCTTCGTGGT，SEQ ID NO:20)和R2(ATCAATCCTCATGCTGGGCTC，SEQ ID NO:21)鉴定3’端同源重组结果(图4A)。F1/R1预期PCR产物大小为1800bp，F2/R2预期PCR产物大小为3211bp，如图4B-4C所示，F1/R1和F2/R2 PCR产物琼脂糖凝胶条带大小均符合预期。对F1/R1和F2/R2 PCR产物进行测序鉴定，测序结果如图5所示，表明GFP报告基因已按照预期目标准确***Rosa26位点。
为了进一步检测GFP报告基因在***位点的表达情况，将上述加入2ug/ml嘌呤霉素的细胞培养48小时后，每20-50个细胞接种至10cm培养皿中，隔天换新鲜培养基；待单克隆形成后，用克隆环将细胞克隆点挑选出来，接种至48孔细胞培养板中进行扩繁；待细胞生长至80％汇合后，用胰酶消化收集细胞。每孔细胞分为两部分，一部分进行PCR实验，鉴定GFP基因***情况；PCR鉴定阳性的单克隆细胞，用共聚焦显微镜采集图片，鉴定GFP基因表达情况，如图4D所示细胞表达GFP荧光，表明***到犬基因组的GFP基因已稳定表达。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.分离的犬Rosa26基因，其特征在于：所述犬Rosa26基因全长非编码RNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的分离的犬Rosa26基因，其特征在于：所述犬Rosa26的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
3.将外源基因定点***犬基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：
（a）针对根据权利要求1或2所述的分离的犬Rosa26的基因序列设计sgRNA序列，将sgRNA所对应的DNA序列连入含有sgRNA骨架序列的质粒中；
（b）将PCR扩增获得的外源基因序列、根据权利要求1所述的分离的犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列、根据权利要求1所述的分离的犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷酸序列与扩增载体连接，获得同源重组的供体载体；
（c）将步骤（a）所得的质粒、步骤（b）所得的供体载体和含有Cas9的质粒共同转染犬体细胞；
（d）采用PCR鉴定5’端同源重组结果和3’端同源重组结果，若PCR产物与预期相符，则表明已将外源基因定点***犬基因组。
4.根据权利要求3所述的将外源基因定点***犬基因组的方法，其中所述sgRNA序列的靶向序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求3所述的将外源基因定点***犬基因组的方法，其中含有sgRNA骨架序列的质粒选自：addgene #51133质粒，addgene #42230质粒和addgene #58778质粒。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的将外源基因定点***犬基因组的方法，其中所述犬Rosa26基因同源重组的左臂核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述犬Rosa26基因同源重组的右臂核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的将外源基因定点***犬基因组的方法，其中所述扩增载体选自：addgene #61408质粒，addgene #22677质粒和addgene #51132质粒。
8.根据权利要求3-5中任一项所述的将外源基因定点***犬基因组的方法，其中含有Cas9的质粒选自：addgene #44758质粒，addgene #42230质粒和addgene #97307质粒。
9.根据权利要求1或2所述的分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点***犬基因组中的应用。
10.根据权利要求1或2所述的分离的犬Rosa26基因在将外源基因定点***犬基因组的转基因细胞模型和动物模型的构建或在犬中过表达或功能研究中或在犬育种中的应用。
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