CN104975043A - 构建重组mva病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体。该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能***外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动***的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，其还携带有两端带有同源序列的自删除标记基因***。其序列为SEQ ID No.1。利用本发明中的穿梭质粒，可以方便快捷的构建出表达外源目的基因但不带有筛选标记基因的重组MVA病毒。利用本发明中的质粒载体构建的重组MVA病毒，能够满足未来临床试验的需求。为以MVA为基础的活病毒载体疫苗的研发奠定了前期基础。

Description

构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及在基于痘苗病毒高度减毒毒株MVA的活载体疫苗的构建中，一种穿梭质粒的设计与应用，特别涉及一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体。

背景技术

MVA(modified vaccinia virus Ankara改良型痘苗病毒安卡拉株)是高度减毒的痘苗病毒毒株，是在人类寻求高度减毒的痘苗病毒作为天花疫苗的过程中获得的。来源于一个土耳其的痘苗病毒毒株CVA(chorioallantois vaccinia virus Ankara)。CVA在鸡成纤维细胞中传代371代后，发现其生长特性已经发生了改变，在传代516代后改名为MVA。与CVA相比，在鸡成纤维细胞中传代570代以后，MVA失去了在绝大部分哺乳动物细胞中感染和复制的能力。分析基因图谱发现，在传代的过程中MVA丢失了大约30KB的病毒基因，这些基因大多与病毒的毒力和宿主选择范围密切相关。在体外研究中发现，当痘苗病毒感染细胞后，早期基因转录导致病毒DNA复制，之后调节基因和晚期基因表达。继而，病毒DNA被包装到不成熟的蛋白粒子中成为有感染性的细胞内成熟的粒子。MVA在允许细胞(BHK-21，CEF等)内可以完成完整的生活周期，而在非允许细胞中，停止在了这个过程的某个步骤之中。在人细胞内，MVA起始了复制，但是不能 繁殖生长而产生有感染性的成熟颗粒，从而使之具有了良好的安全性。

MVA作为活载体疫苗的载体具有以下几点优势：(1)MVA在传代过程中丢失了六个主要的基因，在这六个删除基因的部位可以用来***外源基因，并且在外源基因***后并不影响病毒本身的感染能力和表达能力。(2)免疫原性高。外源蛋白基因在被病毒载体递送到体内后，基因被忠实表达，并且能够进行正确的转录、翻译和翻译后的加工与修饰。表达的蛋白具有天然的构象与生物活性。较蛋白疫苗相比，能够诱导机体产生强而持久的体液免疫和细胞免疫应答。(3)MVA作为天花疫苗，在上个世纪七十年代，在消灭天花的战役中，成功的用于预防天花。并且已经对超过120000人进行了免疫，这些接受MVA接种的人群只有小部分人有轻度的与之相关的副反应发生(如：红肿、发热和流感样症状)。MVA已经在动物模型和人体试验中得到了很好的安全性评价，没有引发任何的由于接种引起的严重临床疾病。总的来说，MVA稳定性好，安全性高，并且能表达大的外源蛋白。MVA可以模仿病毒感染，产生适当的危险信号，并且诱导强而持久的细胞免疫应答。这种复制缺陷的病毒提供了灭活疫苗的特性但是却有活疫苗的免疫原性，使之成为活载体疫苗的重要候选病毒。

目前以MVA为活病毒载体正在进行临床研究的主要是由四种病原物质引起的感染性疾病和肿瘤，分别是：HIV，HCV，HPV和结核分枝杆菌。到2012年底，以针对HIV感染的MVA为活载体的疫苗大约有10个分别进入I期或II期临床研究。针对HPV引起的子*** 的治疗的MVA活载体疫苗有2个进入了II期临床研究。针对HCV感染的MVA活载体疫苗有两个已经进行到II期临床研究，此外还有一个针对HBV感染的MVA疫苗进入了IIa期临床研究，一个结核杆菌的MVA疫苗进入了I期临床。

鉴于此，快速准确的构建携带有外源目标基因的MVA病毒成为病毒载体疫苗的各项工作的首要任务。MVA基因组庞大，外援基因的引入主要依靠病毒基因组与携带有外源目标基因的穿梭载体之间的随机同源重组来完成。穿梭载体在与MVA基因组发生同源重组获得重组MVA病毒后，随同目的基因转入载体的还有标记基因。利用标记基因可以从大量非转化细胞中将阳性重组克隆筛选出来。但随着重组病毒的传代，标记基因变得不再用，却仍在细胞内表达。这些基因一旦进入机体，对机体的影响很难确定，产生安全性隐患。同时也是在今后药品报批等过程中所不允许的。因此，构建带有标记基因自删除***的穿梭质粒，在痘苗病毒MVA的应用中的基础与关键。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体，该穿梭质粒载体，带有标记基因自删除***的同时又能转染和表达外源基因。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体，该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能***外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动***的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，还携带有两端带有同源序列的自删除标 记基因***。

进一步的，所述自删除标记基因***包括标记基因启动子：痘苗病毒启动子p11，标记基因EGFP，以及两者外侧的同源序列。

进一步的，该穿梭载体还携带有抗性筛选标记基因。

进一步的，该抗性筛选标记基因为用于穿梭质粒载体在大肠杆菌中的氨苄抗性筛选。

进一步的，其序列为SEQ ID No.1。该重组载体以EGFP基因为起始，1-721位为EGFP基因序列，722-850为EGFP基因的启动子P11，第850-1267位为TKL’序列，1267-1529为启动多克隆位点中***的外源序列的启动子P7.5。1530-1595为具有BamHI、SalI、BglI、ApnI、KpnI、NotI、EcoRI七个限制性内切酶酶切位点的多克隆位点(MCS)。第1596-2532位为TKR序列，第2533-5161位为与质粒复制与抗性(氨苄抗性)相关的基因序列。第5162-5897位为TKL序列。

一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体的方法，包括如下步骤：

步骤一：设计引物P-EGFP-1：5’-CCGCTCGAGGATGGTGAGCA AGGGCGAGG-3’和P-EGFP-2：5’-CCCATCGAT TTATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’，并以pEGFP-C3质粒上的EGFP基因为模板进行PCR，通过PCR反应获得两端携带有XhoI和ClaI两个限制性内切酶的酶切位点的EGFP基因，片段为745bp；

步骤二：以pSC11质粒为出发质粒。分析pSC11质粒后发现在不影响其他原件的功能的情况下，有两个酶切位点XhoI和ClaI正好处于LacZ基因的两侧。将pSC11质粒与PCR产物同时进行XhoI和ClaI 双酶切；酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化到感受态细胞DH5α；并进行PCR鉴定、酶切鉴定与基因序列的测定；

步骤三：在P11与P7.5两个启动子之间***限制性内切酶位点。

P11与P7.5是痘苗病毒的两个高效启动子，在pSC11质粒中这两个启动子位置相邻方向相反，分别启动标记基因LacZ和MCS中连接的外源基因的表达。在两个启动子之间***限制性内切酶的酶切位点，用于***TKL的同源序列以进行分子内同源重组而删除标记基因。本研究中***的DNA序列为：CTTAAGTGTACAACTAGTGCTAGC下划线为：AflII与NheI两个酶切位点。

步骤四：在P11与P7.5两个启动子之间***TKL的同源序列TKL’。设计引物P-homo-1和P-homo-2，引物两端分别携带有AflII与NheI酶切位点(见引物表)。以p SC11质粒上的TKL序列为模板进行PCR，获得序列为418bp。再利用AflII与NheI两种酶同时酶切上一步获得的质粒与PCR产物并回收。再将回收产物利用T4DNA连接酶连接，即得到穿梭质粒载体。将质粒转染感受态细胞DH5α后进行相关鉴定。

本发明所述穿梭载体在构建痘苗病毒活载体疫苗的过程中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明中的Marker基因使用的为EGFP基因。表达产物为绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下发光明显易于发现。

(2)用于筛选阳性病毒克隆的标记基因EGFP，在完成筛选过程后，在病毒的传代培养的过程中可以在随机的分子内同源重组作用下，自动被删除。从而获得没有标记基因，但是扔携带有外源目标基 因的重组MVA活病毒。此病毒含有外源基因及其启动子外，与原MVA病毒相同。达到未来的临床试验的基本要求。

(3)Marker两侧的发生同源重组的基因序列，左侧使用的仍为TKL，而右侧使用序列小于TKL但完全同源的TKL’，利用TKL’的大小控制同源重组发生的几率，使Marker基因重组删除发生，但删除的时间要晚于穿梭质粒与MVA病毒之间的同源重组。同时，为满足未来临床生产等需要，不在***中***任何的MVA来源以外的基因。

(4)在痘苗病毒高效启动子p7.5下游含有多个供外源目标基因***的酶切位点。外源基因连接到穿梭载体并转染到允许细胞后可以高效表达。

附图说明

图1为本发明中的穿梭载体p ZL-EGFP-1的质粒示意图。

图2为病毒传代后感染BHK-21细胞效果图。

图3为PCR法鉴定结果图，其中，图3A为以病毒DNA为模板，利用3三对引物分别进行PCR反应，的记录结果，图3B为利用购买于德国AVISO公司的全自动细胞分离筛选***，随机挑选10个白色噬斑细胞，将细胞破碎后回收的病毒扩增培养后，进行PCR鉴定的结果，图3C为随机挑选10个筛选后的病毒噬斑，利用1.2.8中的引物进行PCR鉴定结果。

图4为western bolt法鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

试验例：

1：其中的大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取以及限制性内切酶消化、DNA片段回收、DNA片段连接、重组质粒的筛选与鉴定等都参照《分子克隆实验指南》相关章节进行。

2：试剂盒试剂等相关材料均为市售商品。

3：构建重组痘苗病毒MVA的穿梭质粒载体pZL-EGFP的构建：

如图1所示，该载体以pSC11质粒为出发质粒。

分析pSC11质粒后发现在不影响其他原件的功能的情况下，有两个酶切位点XhoI和ClaI正好处于LacZ基因的两侧。设计引物P-EGFP-1和P-EGFP-2(见表1引物表)并以pEGFP-C3质粒上的EGFP基因为模板进行PCR。通过PCR反应获得两端携带有XhoI和ClaI两个限制性内切酶的酶切位点的EGFP基因，片段为745bp。将PCR产物利用PCR产物回收试剂盒回收。将pSC11质粒与PCR产物同时进行XhoI和ClaI两酶的双酶切。酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接。将连接后的产物转化到感受态细胞DH5α。并进行PCR鉴定、酶切鉴定与基因序列的测定。

表1为本发明PCR反应所用引物的引物表：

在P11与P7.5两个启动子之间***限制性内切酶位点。

P11与P7.5是痘苗病毒的两个高效启动子，在pSC11质粒中这两个启动子位置相邻方向相反，分别启动标记基因LacZ和MCS中连接的外源基因的表达。在两个启动子之间***限制性内切酶的酶切位点，用于***TKL的同源序列以进行分子内同源重组而删除标记基因。本研究中***的DNA序列为：CTTAAGTGTACAACTAGTGCTAGC下划线为：AflII与NheI两个酶切位点。本步骤由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

在P11与P7.5两个启动子之间***TKL(序列SEQ ID No.2)的同源序列TKL’(序列SEQ ID No.4)。

设计引物P-homo-1和P-homo-2，引物两端分别携带有AflII与NheI酶切位点(见引物表)。以p SC11质粒上的TKL序列为模板进行PCR，获得序列为418bp。再利用AflII与NheI两种酶同时酶切上一步获得的质粒与PCR产物并回收。再将回收产物利用T4DNA连接酶连接，即为本研究中的穿梭质粒载体。将质粒转染感受态细胞DH5α后进行相关鉴定。

3：合成HPV16L1基因，利用酶切与连接的方法将其连接到pZL-EGFP的MC中，得到质粒pZL-EGFP-HPV16L1。外源蛋白的***用于检测穿梭质粒载体与病毒MVA同源重组后外源基因的表达效果。

4：重组痘苗病毒MVA的筛选与鉴定 

(1)穿梭质粒的制备：将构建好的质粒pZL-EGFP转染到感受态细胞DH5α并进行相关鉴定后，将冻存的菌液在冰上化冻，在含有Amp的固体培养基平皿中四线划板接种，37℃过夜培养获得单个菌落。挑单个菌落到3ml的LB液体培养基中37℃，200rpm培养8小时后，接种到含有Amp的100ml的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。利用无内毒素质粒大量提取试剂盒(离心柱型)(购于北京天根生化科技有限公司)制备质粒pZL-EGFP，并利用分光光度法测定OD260/280为1.92。核酸浓度为602μg/ml。

-20℃保存备用。 

(2)细胞培养与传代

本研究中使用的细胞为BHK-21(幼仓鼠肾细胞)。BHK-21是典型的贴壁型成纤维细胞。培养条件为含10％的FBS的DMEM培养基37℃、5％CO2的培养箱中培养。在细胞成长成为单层细胞后，以PBS洗涤细胞两次，再以0.25％的胰酶消化3分钟。再以10％的FBS的DMEM培养基将细胞吹散成单个细胞，分装到合适的培养板或培养瓶中继续培养。

(3)痘苗病毒MVA滴度测定与培养

按3×105个/孔接种BHK21细胞到6孔板中并过夜培养，MVA病毒1μl，10倍倍比稀释到10-8。六孔板中的1个孔作为细胞对照，其余5孔分别接种1μl的10-4、10-5、10-6、10-7、10-8μl的病毒。37℃5％CO2条件下培养2h。将DMEM与低熔点琼脂混合液铺在六 孔板的细胞上，每孔使用1ml。37℃5％CO2条件下培养72h。光镜下计数噬斑总数计算获得病毒滴度。以一定浓度BHK21细胞到培养板或培养瓶中，以一定比例接种MVA病毒，37℃5％CO2条件下培养48h。弃掉培养基，将细胞以细胞刮刀刮下，在液氮与37℃中反复冻融3次后，冻存于-80℃中备用。

痘苗病毒MVA的培养

(4)穿梭质粒pZL-EGFP-HPV16L1与痘苗病毒MVA共转染BHK21细胞

按2×105个/孔接种BHK21细胞到6孔板中并过夜培养。以0.01MOI感染MVA野毒，培养2h后弃去培养液，换入新鲜的维持液。培养的同时将质粒pZL-EGFP-HPV16L1与转染试剂按3:1(μl：μg)混匀。培养2h后，将混合液加入到细胞中，并继续培养48h。在这个过程中，穿梭质粒pZL-EGFP-1-HPV16L1上的TKR、TKL序列与痘苗病毒MVA上的TKR、TKL序列之间发生同源重组，产生携带有标记基因EGFP和外源蛋白HPV16L1的基因的重组MVA病毒。48h后，在荧光显微镜下观察会发现有带有绿色荧光的细胞出现。回收细胞并在37℃和液氮间反复冻融3次，离心后保留上清并于-80保存。

(5)重组病毒的培养与传代

培养BHK-21细胞到单层细胞布满90％的培养孔底部。向孔中加入1/10μl冻融过的重组病毒，培养48h。在荧光显微镜下观察，发现部分细胞是携带有绿色荧光的病变细胞。利用购买于德国AVISO公 司的全自动细胞分离筛选***，将携带有绿色荧光的病变细胞分选并富集，转移到铺有单层BHK21细胞的96孔板的孔中继续培养24h。培养后荧光显微镜下观察会发现，基本所有的细胞都携带有绿色荧光。回收病变细胞，在37℃和液氮间反复冻融3次，离心后保留上清并于-80保存。此病毒设定为第1代病毒。将3×106个BHK-21细胞接种于T25培养瓶中培养24h。取冻存的富集后的重组病毒10μl接种到细胞中，轻摇混匀。37℃5％CO2条件下培养48h后在荧光显微镜下观察并拍照。回收病变细胞，在37℃和液氮间反复冻融3次，2000rpm离心5min后，保留上清并于-80保存。如此往复，传代9次，共获得10代病毒。将2-10代病毒感染BHK-21细胞，在荧光显微镜下观察带有绿色荧光的细胞的变化情况(如图2所示)。

(6)PCR法鉴定标记基因EGFP的删除与外源基因HPV16L1的状态

根据EGFP的两侧基因序列、HPV16L1两侧序列设计引物：Fluore-1、Fluore-2、zkHPV16-1、zkHPV16-2。将MVA病毒保守蛋白D4R基因作为病毒基因总量的参考设计引物InternalD4R-1、InternalD4R-2(见引物表)。将1-10代病毒各取200μl，利用病毒DNA/RNA提取试剂盒(购于TAKARA公司)提取病毒DNA。以病毒DNA为模板，利用3三对引物分别进行PCR反应，并记录结果(如图3A)。按3×105个/孔接种BHK21细胞到6孔板中并过夜培养，按传代第10代病毒1/10μl每孔接种。37℃5％CO2条件下培养48h。利用购买于德国AVISO公司的全自动细胞分离筛选***，随机挑选10个白色 噬斑细胞，将细胞破碎后回收的病毒扩增培养后，进行PCR鉴定(如图3B)。按3×105个/孔接种BHK21细胞到6孔板中并过夜培养，取PCR鉴定为EGPF-/HPV16L1+的重组MVA病毒1μl，10倍倍比稀释到10-8。六孔板中的1个孔作为细胞对照，其余5孔分别接种1μl的10-4、10-5、10-6、10-7、10-8μl的病毒。37℃5％CO2条件下培养2h。将DMEM与低熔点琼脂混合液铺在六孔板的细胞上，每孔使用1ml。37℃5％CO2条件下培养48h，荧光显微镜下观察结果，找到病变斑彼此分离的合适稀释度的孔并做好标记。利用细头吸管将标记处的琼脂与细胞一同吸出，接种到铺有单层BHK21细胞的96孔板中，继续培养。随机挑选10个筛选后的病毒噬斑，利用1.2.8中的引物进行PCR鉴定(如图3C)。

PCR结果图说明：图3A说明在病毒传代的过程中，标记基因表达逐渐减少，而多克隆位点***的外源目标基因表达稳定。图3B说明在第10代病毒中大约一半的MVA病毒已经携带有外面源目标基因同时标记基因已经被删除，但存在部分空载MVA病毒。图3C说明，将携带有外面源目标基因同时标记基因已经被删除的病毒MVA单个噬斑筛选出来后，再培养并挑选噬斑，获得了比较纯的已经删除了标记基因的重组MVA病毒。

(7)Western Blot法鉴定目标蛋白的表达

按3×106个/孔接种BHK21细胞到T25培养瓶中并过夜培养，共3瓶。分别接种第1代病毒、经过噬斑筛选的rMVA-EGPF-/HPV16L1+病毒以及PBS作为阴性对照。37℃5％CO2条件下培养48h。弃掉上面 的培养基，以细胞裂解液裂解细胞后，将产物回收并进行Western Blot试验，以对目标蛋白HPV16L1的表达进行鉴定，结果如图4所示。Western Blot结果说明：***到本质粒的多克隆位点的外源基因HPVL1蛋白的基因表达良好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (7)

1.构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体，该穿梭载体携带有痘苗病毒胸腺激酶的侧翼序列TKR与TKL，能***外源目标病毒基因的多克隆位点MCS，以及启动***的外源基因高效表达痘苗病毒早晚启动子P7.5，其特征在于，其还携带有两端带有同源序列的自删除标记基因***。

2.根据权利要求1所述的穿梭载体，其特征在于，所述自删除标记基因***包括标记基因启动子：痘苗病毒启动子p11，标记基因EGFP，以及两者外侧的同源序列。

3.根据权利要求2所述的穿梭载体，其特征在于，该穿梭载体还携带有抗性筛选标记基因。

4.根据权利要求3所述的穿梭载体，其特征在于，该抗性筛选标记基因为用于穿梭质粒载体在大肠杆菌中的氨苄抗性筛选。

5.根据权利要求4所述的穿梭载体，其特征在于，其序列为SEQID No.1。

6.一种构建重组MVA病毒的带有标记基因自删除***的穿梭载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：设计引物P-EGFP-1：5’-CCGCTCGAGGATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’和P-EGFP-2：5’-CCCATCGATTTATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’，并以pEGFP-C3质粒上的EGFP基因为模板进行PCR，得到两端携带有XhoI和ClaI两个限制性内切酶的酶切位点的EGFP基因；

步骤二：将pSC11质粒与步骤一PCR产物同时进行XhoI和ClaI双酶切；酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接；将连接后的产物转化到感受态细胞DH5α；并进行PCR鉴定、酶切鉴定与基因序列的测定；

步骤三：在步骤二所得重组后的pSC11质粒P11与P7.5两个启动子之间***限制性内切酶位点；

步骤四：在P11与P7.5两个启动子之间***TKL的同源序列TKL’；设计引物P-homo-1和P-homo-2，引物两端分别携带有AflII与NheI酶切位点，以p SC11质粒上的TKL序列为模板进行PCR，再利用AflII与NheI两种酶同时酶切步骤三获得的质粒与PCR产物并回收，之后将回收产物利用T4DNA连接酶连接，即得到穿梭质粒载体。

7.权利要求1所述穿梭载体在构建痘苗病毒活载体疫苗的过程中的应用。