CN102399756A - 鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用，其特征在于：以带有β-半乳糖苷酶报告基因并缺失Meq基因的重组MDV流行毒株rMS-LacZΔMeq为亲本毒株，缺失了mdv-miR-M9、-M5和mdv-miR-M12，从而构建成的重组毒株rMSΔmiR9-12株，本发明还公开了该基因缺失疫苗株在防制鸡马立克氏病中的应用及应用效果。本发明基因缺失疫苗株的微生物保藏号是：CGMCC No.4613。本发明miRNA缺失疫苗株遗传性状稳定、安全性好，对于鸡马立克氏病具有良好的免疫保护效力，可应用于制备成防治鸡马立克氏病病毒的单苗或联苗等。

Description

鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及鸡马立克氏病病毒基因缺失疫苗株及其应用，特别涉及一种鸡马立克氏病病毒miRNA缺失疫苗株及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

鸡马立克氏病(MD)是一种严重危害养禽业发展的高度传染性、肿瘤性疾病。该病可引起鸡发生多发性淋巴瘤，导致鸡只衰竭、死亡。同时损伤鸡体的免疫器官，产生严重的免疫抑制，易并发其他疾病。该病病程较长，并且发生该病后常导致整个鸡群的淘汰，一旦发生该病，损失往往特别巨大。疫苗是控制该病的主要手段，在种鸡群、蛋鸡群中MD疫苗是必须使用的疫苗，肉鸡群中使用该疫苗可以较大幅度地提高养殖效率。MD的病原-马立克氏病毒(MDV)毒力呈不断演化的趋势。近些年，随着MDV更强毒力毒株的出现，尤其是特超强毒的出现，现有的疫苗毒株，包括广泛应用的HVT、CVI988疫苗株不能对其进行良好的保护。在我国不同地区的养鸡场中，MD疫苗免疫鸡群常有MD的发生。最近的报道表明，即使应用最新型的MDV疫苗，一些MDV强毒株也能引起免疫鸡群发生接近50％的MD死亡率。

我们研究组最近几年连续从现地MD免疫失败的养鸡场分离到20多株MDV强毒株，对其中部分毒株的免疫攻毒试验表明，有些毒株可以突破HVT疫苗、HVT+SB1双价疫苗以及血清1型的CVI988疫苗的免疫保护，证明我国流行的MDV野毒的毒力在逐步的提高，现有的所有MD疫苗均不能提供有效保护。因此，迫切需要研制新的MD疫苗毒株，以便有效防控MDV。

疱疹病毒可利用其自身编码的miRNA进行基因调控，最近的研究证实由MDV编码的3-6个miRNA在基因表达的调控作用对MDV的致瘤作用起到重要作用，其中一些miRNA所针对的一些重要蛋白或转录因子都是对MDV致瘤起重要作用的。

血清1型MDV编码的14个miRNA基因(分别命名为mdv-miR-M1、mdv-miR-M2......mdv-miR-M14，其中部分miRNA基因的位置如附图10所示。)全部位于病毒基因组的反转重复序列区中，并形成3个明显的miRNA基因簇。第一个基因簇miRNA位于TRL/IRL重复序列区中、紧邻Meq基因上游、与R-LORF 8转录物反向；第2个基因簇miRNA主要位于IRS/TRS重复序列与病毒潜伏感染相关基因转录物(latency-associated transcript，LAT)的内含子中；第3个基因簇位于L1/LORF5a阅读框中。MDV1编码的miRNAs的高水平表达和潜在的致瘤宿主miRNAs的确定了miRNAs在MDV的致病和肿瘤转化过程中起重要的作用。与血清I型miRNA相比，血清II型MDV编码的绝大部分miRNA都位于TRL/IRL重复序列一段长约4.2kb的区域中，聚集形成一个较大的基因簇，而MDV2-miR-17则单独位于IRS/TRS重复序列中ICP4的ORF中，但转录方向正好与之相反。HVT(血清III型MDV)编码的miRNA的基因组织形式与血清II型miRNA非常相似，几乎全部位于TRL/IRL重复序列区中，形成一个明显的miRNA基因簇。一系列研究表明，MDV编码的miRNAs很可能是病毒致肿瘤作用的重要的转录阶段的调控因子，对它的研究可进一步揭示MDV的致肿瘤机制。

本研究为了验证MDV-1编码的miRNA与MDV致瘤性的关系，重组病毒rMSΔmiR9-12的构建成功为研究MDV致瘤机制和基因功能提供一个新的平台。

本研究采用基因工程手段以带有β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因并缺失Meq基因的重组MDV流行毒株rMSΔMeq为亲本病毒，通过反向同源重组方法，对MDV-1的Meq基因上游部分第一簇miRNA进行缺失，构建重组病毒rMSΔmiR9-12。在研究其致病性和免疫原性的基础上，筛选适合的MD疫苗毒株，以期获得对流行的MDV强毒具有更好免疫保护效果的疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有弱毒疫苗的不足，提供一种新的鸡马立克氏病病毒基因缺失疫苗株，该株可以有效预防鸡马立克氏病，并具有分子标记，利于免疫鸡群的野毒感染和免疫监控，用该疫苗株所制备的疫苗对目前我国流行的鸡马立克氏病病毒的攻击可以提供良好的免疫保护效力。

本发明所要解决的技术问题之一是构建了缺失鸡马立克病病毒致肿瘤相关的miRNA重组马立克氏病毒，从而提供一种马立克氏病病毒基因缺失疫苗株；

本发明提供的鸡马立克氏病病毒miRNA基因缺失疫苗株，其特征在于所述的miRNA基因缺失疫苗株为rMSΔmiR9-12株，分类命名为：禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其微生物保藏号是CGMCC No.4613。保藏日期为2011年2月24日。

本发明所要解决的技术问题之二是提供了制备该基因缺失疫苗株的方法：其特征在于缺失MDV-1的Meq基因上游部分第一簇miRNA，尤其是通过同源重组的方法构建了缺失mdv-miR-M9、mdv-miR-M5和mdv-miR-M12的重组马立克病毒株mdv-miR-M9-12，命名为rMSΔmiR9-12。

本发明的基因缺失疫苗株是以带有β-半乳糖苷酶报告基因并缺失meq基因的重组MDV流行毒株rMS-LacZΔMeq为亲本毒株。

所述的miRNA基因缺失疫苗株在可用于制备防治鸡马立克氏病疫苗。

本发明的一种预防鸡马立克氏病的疫苗组合物，其特征在于由有效量的权利要求1所述的miRNA基因缺失疫苗株和药学上接受的载体或佐剂组成。

具体的，本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

制备本发明的缺失鸡马立克病病毒致肿瘤相关的miRNA的重组马立克氏病病毒是通过以下手段得到的：重组病毒转移载体质粒构建、亲本病毒感染CEF总DNA和载体质粒DNA共转染经蚀斑筛选和纯化获得重组病毒-rMSΔmiR9-12并鉴定、重组病毒生物学特性及免疫保护效力分析。

本发明的缺失鸡马立克病病毒致肿瘤相关的miRNA的基因缺失疫苗株的制备，包括以下步骤：

1、重组病毒转移载体质粒构建

设计并体外合成用于扩增同源臂和重组鉴定引物，通过PCR方法获得MS株mdv-miR-M9前面927bp的C片段和mdv-miR-M12后面2735bp的D片段，然后将片段C和pUC19载体用Sac I和Xba I酶切、连接获得质粒PUC19-C，再将D片段和质粒PUC19-C用Xba I和HindIII酶切、连接获得重组病毒的转移载体质粒PUC19-C-D(简写pUCCD)。连接后的质粒pUCCD用酶切和PCR方法进行鉴定，并送测序鉴定。

2、重组病毒-rMSΔmiR9-12的获得及鉴定

提取亲本病毒rMS-LacZΔMeq株的总DNA，用紫外分光光度计进行定量。转移载体质粒pUCCD进行中提质粒及纯化，同时也用紫外分光光度计进行定量。将8～10ug的母本病毒总DNA与1～2ug的重组病毒转移载体质粒共转染CEF。培养4～6d待出现MDV典型蚀斑后，倒掉培养液，加20μL终浓度为0.2mg·mL-1的Bulo-Gal染色，37℃，5％CO₂中培养，显微镜下观察选择白色病毒蚀斑用0.25％的胰酶消化，加入长成单层的CEF中，37℃，5％CO₂继续培养，待长出蚀斑后，再次纯化。直到克隆后所有的蚀斑都为白色。将纯化的重组病毒接种原代CEF上，待蚀斑生长到70％时收获细胞，提取重组病毒的总DNA；以提取的重组病毒的总DNA为模板，进行PCR鉴定。再以NCBI上Md5株基因序列设计引物P4进行PCR扩增，产物连接到pMD-18T载体上，测序鉴定，经测序鉴定纯化的病毒命名为：rMSΔmiR9-12。

3、重组病毒生物学特性

稳定试验是重组病毒在体外连续传10代并检测LacZ表达情况；相同的生长条件下亲本病毒MS株和重组病毒rMSΔmiR9-12株，在显微镜下观察体外生长特性：蚀斑大小、折光性、形状和形态的变化情况；1日龄SPF鸡腹腔接种重组病毒rMSΔmiR9-12每只20000PFU进行致病性试验，每天观察鸡的精神状态和有无马立克临床症状，15周龄后全部剖杀，观察病理组织变化，同时进行病理学检测、AGP检测及提取羽髓DNA，进行实时荧光定量PCR检测羽髓中的病毒含量。

4、重组病毒免疫保护效力分析

将重组病毒免疫1日龄SPF鸡，免疫后7天接种超强毒Md5进行攻毒，同时设置重组病毒免疫不攻毒组、814免疫组、814株免疫攻毒组、不免疫只攻毒组、空白对照组。观察并记录鸡群临床症状、死亡情况，并计算疫苗保护指数。

附图说明

图1为本发明提供的载体质粒pALacZB示意图；

图2为本发明提供的质粒pALacZB酶切鉴定结果；

图3为本发明提供的重组病毒rMS-LacZΔMeq在CEF上的蚀斑染色结果；

图4为本发明提供的重组病毒rMS-LacZΔMeq的Meq基因缺失的PCR鉴定结果；

图5为本发明提供的重组病毒rMS-LacZΔMeq基因组Meq基因拷贝数PCR鉴定结果；

图6本发明提供的病毒基因组总DNA电泳图；

图7本发明提供的同源臂C和片段D的扩增结果；

图8本发明提供的重组病毒转移载体质粒鉴定结果；

图9本发明提供的重组病毒鉴定结果；

图10本发明提供的重组病毒rMSΔmiR9-12测序结果示意图；

图11本发明提供的MS与rMSΔmiR9-12在CEF上生长曲线；

图12本发明提供的MS毒株与rMSΔmiR9-12毒株感染病理学组织变化。

具体实施方式

以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。

实施例1重组病毒rMSΔmiR9-12毒株的构建：

1、试验材料：MDV MS株(参见文献：马立克氏病毒miRNA缺失株的构建及其体外生长规律，杨文闯、刘长军等，中国兽医科学.2011，41(03))、MDVMd5(参见文献：马立克病毒超强毒株(Md5、RB1B)毒力试验，甘军纪刘秀梵吴长新，中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集.2002)、鸡马立克病病毒814株(参见文献：鸡马立克病病毒814株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析.张艳萍，刘长军等.动物科学进展，2007(3))由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存，提供；无特定病原体(SPF)鸡胚、SPF鸡由哈尔滨兽医研究所动物中心提供；大肠杆菌DH5α为哈尔滨兽医研究所实验动物中心保存。pUC19购买自TaKaRa(大连)公司。CVI988疫苗株由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存

2、试验方法

2.1亲本病毒rMS-LacZΔMeq株的构建

1)引物的设计与合成：参照已发表的MDV强毒GA株相关基因序列(No.AF147806)，分别设计了引物对Primer A和Primer B，针对Meq基因两侧的片段A、B作为构建转移载体质粒的同源序列。引物对LacZB的上游在LacZ基因上，下游在重组臂B上，用于鉴定是否重组；引物对ALB的上游在重组臂A上，下游在重组臂B上，用于鉴定缺失位置与个数。若引物ALB扩增大小若为660bp，表明Meq基因没有缺失，若扩增大小为4288bp表明LacZ***预定位置；引物Meq的上游、下游分别位于Meq基因的两侧，用于重组载体rMS-LacZΔMeq的PCR鉴定，对于亲本病毒MS株的检测，由于meq基因完整，因此扩增片段大小约为1.4Kb，对于重组毒株rMSΔMeq其缺失了468bp，扩增结果约为1kb，缺失的鸡马立克氏病毒Meq基因核苷酸序列，具体如下：

5‘CGGTACAGGTGTAAAGAGATGTCTCAGGAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCCGTCCCCCCTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGAGACGGAAAAAAAGGAAAAGTCACGACATCCCCAACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGGAGCAGACGTACTATGTAGACAAACTCCATGAAGCATGTGAAGAGCTGCAGAGGGCCAATGAACACCTACGTAAGGAAATTCGAGATCTAAGGACTGAGTGCACGTCCCTGCGTGCACAGTTGGCTTGTCATGAGCCAGTTTGCCCTATGGCGGTACCCCTAACGGTGACCCTTGGACTGCTTACCGCCCCGCACGATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGC 3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物名称及序列如表1所示：

表1本发明提供的构建重组病毒的引物序列

2)DNA模板的制备：9日龄的SPF鸡胚，按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)。将MDV MS株接种CEF，37℃5mL/L CO₂培养箱内培养，病变率达80％后，将细胞消化收获，按常规方法提取总DNA，用适当体积的TE(pH7.4)溶解。

3)同源片段扩增及回收：以上述提取的病毒基因组总DNA为模板进行扩增。反应体系为25μL：超纯水17.5μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)1μL，上下游引物(10pmol·L-1)各1μL，rTaq酶(5U·μL^-1)1μL，DNA  2μL(0.5μg·μL^-1)。两PCR反应条件为：94℃变性5min，然后94℃变性1min，57℃退火(B片断退火58℃)1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经含有溴化乙啶(EB)的1.0％琼脂糖电泳鉴定。鉴定正确的产物进行片段凝胶回收。

4)转移载体质粒的构建：以MDV MS株基因组DNA为模板，通过PCR方法获得Meq基因上游片段同源臂A，经Sal I和Sph I酶切，与pUC19连接，得到质粒pUCA；PCR扩增得到B片段，经Sal I和Sac I酶切后，连接到pUCA中，得到质粒pUCAB。经Sal I酶切得到的LacZ表达基因盒，连接到pUCAB质粒中，得到质粒pALacZB(如图1所示)，质粒酶切鉴定结果如图2所示。用Qiagen质粒中提试剂盒提取质粒，pH值为7.4的TE溶解，-20℃保存备用。

2.2rMS-LacZΔMeq的获得及鉴定

1)共转染：MDV MS株基因组总DNA与转移载体质粒pALacZB用磷酸钙沉淀法共转染CEF，具体方法如下：制备鸡胚成纤维细胞，24h内长成单层的CEF时，消化后传代到直径60mm的细胞培养皿，CEF接种量为每个皿9×10⁶个。首先将无核酸酶的去离子水388μL加入到洁净无菌的1.5mL离心管中；再依次加入所制备的MS株感染的CEF基因组总DNA(0.8μg·μL^-1)10～18μL和质粒pALacZB(1μg·μL^-1)2μL；加入30～36μL TE(pH 7.4)；缓慢加入62μL 2mol·L-1 CaCl₂，缓慢混匀；用1mL移液器从底部缓缓加入2×HEPES500μL，用200μL量程的微量移液器从底部吹20左右个气泡使其混匀，置于37℃温箱内孵育30min，其间包装成细小沉淀颗粒；将磷酸钙DNA轻轻吹打重悬，均匀加至已经制备好的CEF次代细胞表面，轻轻摇晃细胞培养皿几次，这时培养液呈现黄橙色，置37℃5％CO₂培养箱2～3h；倒掉上层培养液，用无血清的培养液或者用无菌的PBS缓冲液冲洗3次，加入15％甘油休克液2mL使其休克90s，再用无血清的培养液或者用无菌的PBS缓冲液冲洗3次；加入3％胎牛血清培养液促进细胞生长成单层，置37℃5％CO₂培养箱中培养，整个过程都在无菌条件下操作。培养大概4～6d时，待出现马立克典型蚀斑后，进行下一步克隆和纯化，本发明提供的重组病毒rMS-LacZΔMeq在CEF上的蚀斑结果如图3所示。

2)重组病毒的蚀斑克隆与纯化：待蚀斑出现后，放在倒置显微镜下顺次观察，防止漏检。倒掉培养液加入2mL 3％维持液，加入20μL X-Gal(20mg·mL-1)使其总浓度为0.2mg·mL^-1，37℃，5％CO₂中培养2h，选择蓝色蚀斑进行消化克隆纯化。在圈出的蚀斑上滴加0.25％胰酶，消化数分钟，用枪尖划几下，吸起消化液，加入长成单层的鸡胚成纤维细胞中，长有单层细胞的平皿中吸出部分维持液洗一下圈出的并消化的蚀斑，加入长成单层的鸡胚成纤维细胞中，37℃，5％CO₂继续培养，待长出蚀斑后，再次纯化。直到克隆后所有的蚀斑都为蓝色。

3)重组病毒的鉴定：将蚀斑纯化的重组病毒接种原代CEF上，待蚀斑生长70％时收获细胞，按分子克隆上方法提取总DNA。分别用LacZB引物和ALB引物进行扩增，反应体系为25μL：超纯水至17μL，0×PCR反应缓冲液2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)1μL，上下游引物(10pmol)各1μL，rTaq酶(5U·μL^-1)1μL，重组病毒DNA 2μL(0.5μg·μL^-1)。两PCR反应条件均为：94℃变性5min，然后94℃变性1min，57℃退火(引物ALB的退火温度58℃)1min，72℃延伸(引物ALB的延伸时间4min)1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物连接pMD-18T载体，菌液送上海英俊生物技术有限公司测序进一步鉴定，经测序鉴定纯化的病毒命名为：rMS-LacZΔMeq。重组病毒rMS-LacZΔMeq使用引物LacZB进行的PCR检测，鉴定结果如图4所示，得到与预期大小一致的条带(1300bp)。

Meq基因缺失拷贝数鉴定，用引物ALB鉴定，亲本MS株扩增大小为656bp左右，重组rMS-LacZΔMeq约4388bp，结果如图5所示，泳道1：DL2000分子质量标准；泳道2：亲本眉山(MS)株；泳道3：重组株；泳道4：阴性；泳道；5：DL1000分子质量标准，结果：大小与预期相符，说明构建正确，同时也证明重组病毒rMS-LacZΔMeq的两个Meq基因均已缺失。

2.3rMSΔmiR9-12毒株的构建

1)引物的设计与合成：参考GenBank中MDV超强毒Md5株相关基因序列，设计了引物P1扩增mdv1-miR-M9前面927bp的C片段，引物P2扩增mdv1-miR-M12后面2735bp的D片段，其中片段C作为构建转移载体质粒的一个同源臂，片段D包含补齐Meq的目的片段和另一个同源臂，同源臂C和片段D的扩增结果如图7所示。引物P3的上游在片段C上，下游在片段D上，用于鉴定缺失的位置与个数；引物P4上游位于Meq基因前面250bp，下游位于Meq基因后面250bp，用于鉴定Meq基因的大小；用于鉴定LacZ基因是否存在的引物P5都位于LacZ基因上。引物P6的上游位于缺失部位前面的450bp，下游位于Meq基因后面的479bp，其扩增产物与载体相连送测序鉴定Meq基因的变化和缺失情况。针对荧光定量PCR设计的P7和P8的引物及探针参考张颖(张颖等。应用双重实时荧光定量PCR方法检测鸡马立克氏病血清1型病毒。中国预防兽医学报，2007，29(1)：46-51。)。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。引物名称及序列见表2所示。

表2本发明提供的构建重组病毒的引物序列

2)DNA模板的制备：9日龄的SPF鸡胚，按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)。将MDV rMSΔMeq株接种CEF，37℃5mL/L CO₂培养箱内培养，病变率达80％后，将细胞消化收获，按常规方法提取总DNA，用适当体积的TE(pH7.4)溶解。

3)同源片段扩增及回收：以上述提取的病毒基因组总DNA为模板进行扩增。反应体系为25μL：超纯水17.5μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)1μL，上下游引物(10pmol·L^-1)各1μL，rTaq酶(5U·μL^-1)1μL，DNA  2μL(0.5μg·μL^-1)。两PCR反应条件为：94℃变性5min，然后94℃变性1min，57℃退火(B片断退火58℃)1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经含有溴化乙啶(EB)的1.0％琼脂糖电泳鉴定。鉴定正确的产物进行片段凝胶回收。

4)转移载体质粒的构建：提取病毒的总DNA，作为PCR扩增模板，用设计的引物P1和P2扩增MS株mdv-miR-M9前面927bp的C片段和mdv-miR-M12后面2735bp的D片段。然后将片段C和pUC19载体用Sac I和Xba I酶切、连接获得质粒PUC19-C，再将D片段和质粒PUC19-C用Xba I和HindIII酶切、连接获得重组病毒的转移载体质粒PUC19-C-D(简写pUCCD)。连接后的质粒pUCCD用酶切和PCR方法进行鉴定，鉴定结果如图8所示，并送测序鉴定。

2.4重组病毒-rMSΔmiR9-12的获得及鉴定

1)共转染：提取亲本病毒rMSΔMeq株的总DNA，电泳结果如图6所示，用紫外分光光度计进行定量。转移载体质粒pUCCD用QIAGEN公司中提质粒试剂盒进行提取纯化，同时也用紫外分光光度计进行定量。共转染具体方法如下：制备CEF，24h内长成单层的CEF时，消化后传代到直径60mm的细胞培养皿，CEF接种量为每个皿9×10⁶个。首先将无核酸酶的去离子水388μL加入到洁净无菌的1.5mL离心管中；再依次加入所制备的MS株感染的CEF基因组总DNA(0.8μg·μL^-1)10～18μL和质粒pALacZB(1μg·μL^-1)2μL；加入30～36μL TE(pH 7.4)；缓慢加入62μL 2mo1·L^-1 CaCl₂，缓慢混匀；用1mL移液器从底部缓缓加入2×HEPES 500μL，用200μL量程的微量移液器从底部吹20左右个气泡使其混匀，置于37℃温箱内抚育30～45min，其间包装成细小沉淀颗粒；将磷酸钙DNA轻轻吹打重悬，均匀加至已经制备好的CEF次代细胞表面，轻轻摇晃细胞培养皿几次，这时培养液呈现黄橙色，置37℃5％CO₂培养箱2～3h；倒掉上层培养液，用无血清的培养液或者用无菌的PBS缓冲液冲洗3次，加入15％甘油休克液2mL使其休克90s，再用无血清的培养液或者用无菌的PBS缓冲液冲洗3次；加入3％胎牛血清培养液促进细胞生长成单层，置37℃5％CO₂培养箱中培养，整个过程都在无菌条件下操作。培养大概4～6d时，待出现马立克典型蚀斑后，进行下一步克隆和纯化。

2)重组病毒的蚀斑克隆与纯化：培养4～6d待出现MDV典型蚀斑后，倒掉培养液，加20μL终浓度为0.2mg·mL^-1的Bulo-Gal染色，37℃，5％CO₂中培养，显微镜下观察选择白色病毒蚀斑用0.25％的胰酶消化，加入长成单层的CEF中，37℃，5％CO₂继续培养，待长出蚀斑后，再次纯化。直到克隆后所有的蚀斑都为白色。

3)重组病毒的鉴定：将纯化的重组病毒接种原代CEF上，待蚀斑生长到70％时收获细胞，用Tiangen公司的基因组DNA提取试剂盒提取重组病毒的总DNA；以提取的重组病毒的总DNA为模板，用引物P3和P5进行PCR鉴定。再以NCBI上Md5株基因序列设计引物P4进行PCR扩增，产物连接到pMD-18T载体上，菌液送北京六合华大基因科技有限公司测序进一步鉴定，经测序鉴定纯化的病毒命名为：rMSΔmiR9-12，重组病毒-rMSΔmiR9-12的PCR鉴定结果如图9所示，测序结果示意图如图10所示，重组病毒-rMSΔmiR9-12缺失了位于meq基因上游132909位至134089位之间的序列。所述的miRNA基因缺失疫苗株为rMSΔmiR9-12株，其微生物保藏号是CGMCC No.4613。

实施例2重组病毒生物学特性及免疫保护效力分析

1)重组病毒的生长特性检测：绘制纯化后病毒的生长曲线，具体步骤如下：将MS毒株和重组病毒rMSΔmiR9-12以3％的细胞培养液稀释成100PFU/ml，以每孔1ml的剂量接种已铺成单层的CEF原代细胞的6孔板，待病毒生长1、2、3、4、5、6、7d后，用胰酶消化病毒，收集每种病毒每天3个重复孔，用Tiangen公司的基因组DNA提取试剂盒提取重组病毒的总DNA，以双重实时荧光定量PCR的方法测定每百万细胞病毒的拷贝数(Copies/106cells)，如图11所示。

2)重组病毒的遗传稳定性检测：MS毒株和重组病毒rMSΔmiR9-12在相同的生长环境培养，同时观察两种病毒的蚀斑大小、形状和折光性等生长特性差异。将纯化后的重组病毒rMSΔmiR9-12在CEF上连续传20代，将第10和第20代的病毒提取DNA，用引物P3、P4和P5进行PCR检测。

3)致病性试验：60只1日龄的SPF雏鸡随机分成3组，每组20只雏鸡，负压隔离器中饲养饲养2个月。第一组腹腔接种重组病毒rMSΔmiR9-12，接种剂量为30000PFU/只，第二组接种MS毒株，接种剂量为300000PFU/只，第三组每只接种0.2mL病毒稀释液作为空白对照。接种后每天观察鸡的精神状态和身体状况。对死亡或疑似发病的鸡进行剖检，观察坐骨神经、腺胃、肝脏、肾脏、脾、法式囊、胸腺等组织有无病变，并采集这些组织进行病理学检查，结果国如图12所示。2个月后全部剖杀，观查组织病变和进行病理学检查、AGP检测。采集攻毒后1、2、3、4、5、7和9周鸡的羽髓，每周选取3只鸡进行采集，用Tiangen公司的基因组DNA提取试剂盒提取羽髓中重组病毒的总DNA，采用双重实时荧光定量PCR的方法检测病毒含量，得出该重组病毒在不同时期在鸡体内的复制情况，结果如表3所示。通过病毒在体内增值速度和水平的变化，得出病毒在体内的复制动力学规律。

表3本发明提供的双重荧光定量PCR检测样品的结果

实施例3重组病毒免疫保护效力分析

1日龄160只SPF白色来航鸡随机分成6组，其中前5组每组30只，第6组10只，第1组为重组病毒免疫组，第2组为重组免疫超强MDV Md5攻毒组，第3组为814病毒免疫组，第4组为814病毒免疫超强MDV Md5攻毒组，第5组为超强MDV Md5直接攻毒组，第6组为空白对照组。分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。重组病毒rMSΔmiR9-12和814病毒免疫剂量为每只2000PFU。免疫后的第7天接种超强毒Md5的攻毒剂量为每只1000PFU，腹腔注射。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群有无异常症状和死亡情况，攻毒之前和攻毒后的7d内死亡的鸡只不计数。每天观测鸡群的情况，记录鸡群异常情况和临床症状；并对发病鸡进行剖检，记录每只鸡临床症状和内脏病变情况。最后在攻毒15周后全部剖检，记录每只鸡的临床症状和内部脏器病变情况。总结所有临床症状和剖检症状，确定是否是MD，并做生物学统计。统计疫苗免疫保护指数(PI)如表4所示。

表4为本发明提供的重组病毒免疫保护效率试验结果。

Claims (3)

1.鸡马立克氏病病毒miRNA基因缺失疫苗株，其特征在于所述的miRNA基因缺失疫苗株为rMSΔmiR9-12株，其微生物保藏号是CGMCC No.4613。

2.权利要求1所述的miRNA基因缺失疫苗株在制备预防鸡马立克氏病疫苗中的用途。

3.一种预防鸡马立克氏病的疫苗组合物，其特征在于由有效量的权利要求1所述的miRNA基因缺失疫苗株和药学上接受的载体或佐剂组成。

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