CN112553202A

CN112553202A - 三对特异性识别猪GDF11基因的sgRNA及应用

Info

Publication number: CN112553202A
Application number: CN202011460628.1A
Authority: CN
Inventors: 王恒; 彭哲伦; 刘瑞歌; 马彤彤; 王昇; 付珊珊; 朱桂玉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-12-12
Filing date: 2020-12-12
Publication date: 2021-03-26

Abstract

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及三对特异性识别猪GDF11基因的sgRNA及应用。本发明利用CRISPR/Cas9***敲除猪GDF11基因的sgRNA导向序列，该特异性sgRNA导向序列靶向猪GDF11基因TGFB区域的起始密码子ATG。通过将本发明提供的sgRNA导向序列以及CRISPR/Cas9***的结合使用，可以实现猪中GDF11基因TGFB区域的编辑或敲除，进而实现GDF1基因的标记或低表达，为制备GDF11转基因猪奠定了基础。

Description

三对特异性识别猪GDF11基因的sgRNA及应用

技术领域

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9***敲除猪GDF11基因的sgRNA序列及其应用。本发明具体涉及特异性靶向猪GDF11基因TGFB区域的起始密码子 ATG附近的sgRNA导向序列及其应用。

背景技术

来自微生物的适应性免疫***多聚规律性间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)通过一个短片段单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)来靶向所选择的基因组位点。这种编辑工具以它方便、廉价、精准的优势迅速成为了生物科学界最热门的技术。通过CRISPR/Cas9***切割基因组后，不仅能够通过非同源末端修复(nonhomologous end joining,NHEJ)的方式进行修复，获得在切割位点附近的碱基缺失或***，还可以通过同源重组修复(homology-directedrepair,HDR)的方式，实现位点的突变和目的片段的***与敲除。与ZFN和TALEN相比，CRISPR-Cas9发生NHEJ的概率低、定点突变效率高、诱发双等位基因的效率高，既能提高HDR效率，又能避免脱靶效应潜在的危险。到目前为止，CRISPR技术应用于各个领域，我们可以通过这种基因编辑方法来进行基因功能的研究、构建动物疾病模型。

生长分化因子11(Growth differentiation factor11,GDF11,BMP11)属于TGF-β超家族，myostatin/GDF11亚家族和BMP亚家族一员，是一种在早期胚胎发育过程中起重要作用的骨形态发生蛋白，对早期胚胎发育和许多组织器官的发生起重要调控作用。它在脊椎动物中轴骨骼形成和附肢骨骼形成发育过程中都起着关键作用。GDF11基因缺失的纯合小鼠表现出中轴骨骼图式缺陷，并伴有肾脏和嗅觉异常；GDF11基因敲除小鼠表现出躯干加长而尾部变短或缺失。鉴于GDF11在中轴骨发育中的调控作用、GDF11基因敲除小鼠胸腰椎数增加和基因组进化上的保守性，推测GDF11基因在猪中极有可能具有相同的调控作用。猪的胸腰椎数存在变异，而猪的腰椎数与胴体长度具有高度遗传相关性(相关系数为0.75)，多胸腰椎数性状的选择对改善商品猪的品质具有重要经济意义和应用价值。通过利用CRISPR/Ca9*** 对猪GDF11基因进行修饰，在体内和体外研究GDF11基因的功能，对于研究GDF11基因在猪发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。而获得GDF11转基因动物的首要步骤就是找到能够特异性靶向GDF11的sgRNA，即该sgRNA与CRISPR/Cas9结合使用，能够对靶点处进行编辑。本发明则提供了特异性靶向猪GDF11基因的sgRNA序列，为研究猪GDF11功能机制以及制备GDF11转基因猪奠定基础。

目前，有关猪等哺乳动物GDF11的研究还比较少。通过利用CRISPR/Cas9***^[1],最终获得GDF11基因敲除的猪或是追踪的转基因猪，而首要步骤都是找到能够特异性靶向GDF11的 sgRNA，通过sgRNA与CRISPR/Cas9***结合使用，从而实现靶向编辑。

本发明提供了三对特异性靶向猪GDF11基因的sgRNA导向序列，通过这三种导向序列与 CRISPR/Cas9***结合，不仅能够通过非同源末端修复机制造成猪GDF11基因外显子3起始密码子ATG附近的碱基随机缺失或***，进而导致GDF11基因的转录翻译紊乱，接着研究GDF11 基因缺失对猪肌肉发育的影响。或者通过同源重组的方式，利用外源导入的模板将基因组进行重组，便可以在GDF11基因ATG上下游***或敲除目的片段，进而实现GDF11基因的追踪，从而进一步研究猪中GDF11标记细胞的去向。特异性靶向猪GDF11基因外显子3起始密码子 ATG附近位置sgRNA导向序列的确定为研究猪GDF11基因的功能机制以及制备GDF11转基因猪奠定了基础，对于研究该基因在猪发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，为了更方便的产生并研究GDF11转基因猪，本发明的主要目的是提供能够一种特异性靶向猪GDF11基因TGFB区域的起始密码子ATG附近的 sgRNA导向序列及其应用，所述向导序列可用于靶向修饰猪GDF11基因TGFB区域的，为制备转基因猪奠定基础。

本发明的技术方案如下所述：

(1)本发明设计了一种特异性靶向猪GDF11基因TGFB区域的sgRNA导向序列，它们位于GDF11 基因外显子3起始密码子ATG附近位置，sgRNA导向序列的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示 (见《具体实施方式》中序列SEQ ID NO：1，起始的粗体字为起始密码子“ATG”)。

(2)针对上述猪GDF11基因上的靶标序列，本发明设计了四条sgRNA，并通过筛选，发现其中有三条序列能够特异性靶向猪GDF11基因外显子3起始密码子ATG附近的sgRNA，申请人将这三个序列分别命名为GDF11-sgRNA1(SEQ ID NO：2)、GDF11-sgRNA2(SEQ IDNO：3)、 GDF11-sgRNA3(SEQ ID NO：4)和GDF11-sgRNA4(SEQ ID NO：5)。

(3)在进行特异性靶向验证时，本发明设计了一对鉴定引物，通过该引物特异性扩增得到 DNA片段，将该片段命名为GDF11-ATG(即SEQ ID NO：6所示序列)。

本发明的优势在于靶向序列选在GDF11基因外显子3起始密码子ATG附近，只要sgRNA 打靶成功，GDF11基因的转录与翻译就会受到影响，从而实现对GDF11基因的有效修饰与突变。

本发明的试验证明，本发明提供了三条特异性打靶猪GDF11基因外显子3起始密码子ATG 附近的sgRNA，其特异性强。在进行基因修饰时，能够有效减少CRISPR/Cas9(CRISPR/Cas9 ***请参考文献)^[2]***引起的脱靶现象。

附图说明

图1:四条含有sgRNA的pX330测序结果。附图标记说明：sgRNA1为含有GDF11-sgRNA1 的Px330载体；sgRNA2为含有GDF11-sgRNA2的Px330载体；sgRNA3为含有GDF11-sgRNA3的 Px330载体；sgRNA4是含有GDF11-sgRNA4的Px330载体。

图2:质粒转染细胞后测序结果。附图标记说明：sgRNA1为含有GDF11-sgRNA1的Px330 载体转染细胞后得到的DNA片段GDF11-ATG；sgRNA2为含有GDF11-sgRNA2的Px330载体转染细胞后得到的DNA片段GDF11-ATG；sgRNA3为含有GDF11-sgRNA3的Px330载体转染细胞后得到的DNA片段GDF11-ATG；sgRNA4是含有GDF11-sgRNA4的Px330载体转染细胞后得到的DNA 片段GDF11-ATG和NC质粒(空质粒)转染细胞后得到的阴性对照control。

图3:质粒载体图谱。附图标记说明：图3A为Px330载体；图3B为含有GDF11-sgRNA1的Px330-GDF11-sgRNA1载体；图3C为含有GDF11-sgRNA2的Px330-GDF11-sgRNA2载体；图 3D为含有GDF11-sgRNA3的Px330-GDF11-sgRNA1载体；图3E为含有GDF11-sgRNA4的 Px330-GDF11-sgRNA4载体。

具体实施方式

对序列表的说明：

碱基序列方向全部为5’至3’

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的第一个DNA片段:

ATGGAGCTTCGAGTCCTAGAGAACACAAAACGGTCTCGGCGGAACCTG，序列中粗体字显示的是起始密码子。

序列表SEQ ID NO:2是sgRNA1，序列如下:

GTCTCGGCGGAACCTGGGTC

序列表SEQ ID NO:3是sgRNA2，序列如下:

GGGTCTGGACTGCGATGAGC

序列表SEQ ID NO:4是sgRNA3，序列如下:

CTGCCGATATCCCCTCACAG

序列表SEQ ID NO:5是sgRNA4，序列如下:

ACAGTGGACTTTGAGGCATT

序列表SEQ ID NO:6是本发明克隆的一个DNA片段，序列如下:

TTGAGGGGCAGGTGACAAAAGAGCAGGGAGTGGGAGCTCTTCAGGGCTCTCTCACATGTCTTTCTTCTCTCCCTCACCCC AGCATCCTTTCATGGAGCTTCGAGTCCTAGAGAACACAAAACGGTCTCGGCGGAACCTGGGTCTGGACTGCGATGAGCAC TCAAGTGAGTCCCGCTGCTGCCGATATCCCCTCACAGTGGACTTTGAGGCATTTGGCTGGGACTGGATCATCGCACCTAA ACGCTACAAGGCCAACTACTGCTCTGGCCAGTGCGAGTACATGTTCATGCAAAAGTACCCGCACACCCACTTGGTGCAAC AGGCTAATCCAAGAGGCTCTGCTGGGCCCTGCTGTACCCCCACCAAGATGTCCCCAATCAACATGCTCTACTTCAATGAC AAGCAGCAAATTATCTACGGCAAGATCCCTGG

四条sgRNA对应的寡核苷酸序列(形成sgRNA序列的两条引物)；

序列表SEQ ID NO:7是sgRNA1序列的两条引物中的左引物，序列如下:

GDF11-sgRNA1-F:CACCGTCTCGGCGGAACCTGGGTC

序列表SEQ ID NO:8是sgRNA1序列的两条引物中的右引物，序列如下:

GDF11-sgRNA1-R:AAACGACCCAGGTTCCGCCGAGAC

序列表SEQ ID NO:9是sgRNA2序列的两条引物中的左引物，序列如下:

GDF11-sgRNA2-F:CACCGCTCATCGCAGTCCAGACCC

序列表SEQ ID NO:10是sgRNA2序列的两条引物中的右引物，序列如下:

GDF11-sgRNA2-R:AAACGGGTCTGGACTGCGATGAGC

序列表SEQ ID NO:11是sgRNA3序列的两条引物中的左引物，序列如下:

GDF11-sgRNA3-F:CACCGCTGCCGATATCCCCTCACAG

序列表SEQ ID NO:12是sgRNA3序列的两条引物中的右引物，序列如下:

GDF11-sgRNA3-R:AAACCTGTGAGGGGATATCGGCAGC

序列表SEQ ID NO:13是sgRNA4序列的两条引物中的左引物，序列如下:

GDF11-sgRNA4-F:CACCGACAGTGGACTTTGAGGCATT

序列表SEQ ID NO:14是sgRNA4序列的两条引物中的右引物，序列如下:

GDF11-sgRNA4-R:AAACAATGCCTCAAAGTCCACTGTC

sgRNA靶向鉴定的引物序列：

序列表SEQ ID NO:15是sgRNA靶向鉴定的引物中的左引物，序列如下：

GDF11-ATG-F：AGGAAAGAAAGAGATCGCAGCA

序列表SEQ ID NO:16是sgRNA靶向鉴定的引物中的右引物，序列如下：

GDF11-ATG-R：ACAGCCGAGAAAGTAGCAGA

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。下列实例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明通过从NCBI数据库中下载猪GDF11基因的核苷酸序列，基于对该序列的分析，并且依据CRISPR/Ca9中sgRNA的设计原理，在猪GDF11基因外显子3起始密码子ATG附近设计和筛选sgRNA，最终筛选获得特异性靶向的三条sgRNA。以下以本发明设计的4条sgRNA为例对本发明进行说明。

实施例1 sgRNA的获得

根据猪GDF11基因的基因组序列(登陆号AEMK02000033.1)，在其外显子3起始密码子 ATG附近设计4个GDF11-sgRNA，在其5，端加上CACC碱基得到GDF11-sgRNA-F引物序列；同时根据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在5，端加上AAAC碱基得到GDF11-sgRNA-R引物序列；分别合成上述GDF11-sgRNA-F和GDF11-sgRNA-R，将合成的这两段寡核苷酸置于：95℃变性10min，65℃退火50min，形成带有粘性末端的双链DNA，具体寡核苷酸序列见表1。

表1四条sgRNA对应的寡核苷酸序列

实施例2构建表达sgRNA的载体

1.线性化载体的构建：质粒载体pX330(Addgene，如图3A)用BpiⅠ酶切，酶切体系为40uL：FastDigest enzyme BpiⅠ2uL，10X FastDigest Buffer 4uL，质粒2ug，用双蒸水补至40uL。酶切条件：37℃酶切30min；将酶切产物琼脂糖凝胶电泳后，利用胶回收试剂盒(Omega Bio-tek) 进行胶回收，回收方法见前述试剂盒的说明书。

2.连接：将回收的酶切后的pX330与实施例1制得的双链DNA进行连接，10uL连接体系为体系为：质粒pX330 50ng，退火后的双链sgRNA 1uL，SolutionⅠ：2.5uL，用双蒸水补至10uL；连接条件为16℃连接60min。

3.转化：将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，具体转化方法为：-80℃取出大肠杆菌感受态DH5α，置于冰上溶解；然后用电动移液枪上下吹匀，取出50uL大肠杆菌感受态于新的 1.5mL离心管中，再加入5uL上述的连接产物，混匀后冰浴5min；42℃水浴热激45s，立刻冰浴2min；然后将其全部均匀涂在含有氨苄抗生素(100mg/mL,1000X)的平板中，倒置放于 37℃恒温培养箱中，过夜培养。

4.筛选阳性菌落并进行测序鉴定：挑取步骤3中培养得到的单个菌落，进行菌液PCR(95℃ 5min；95℃ 15s；60℃ 30s；72℃15s；72℃ 5min；15℃ 2min，35个循环)，用琼脂糖凝胶电泳检测。合格的菌落进行摇菌，将1mL菌液送相关商业测序公司进行测序，测序引物如下： 5’-GCATATACGATACAAGGCTG-3’。对测序正确的菌液样品进行保菌和质粒提取。将测序正确的含有4个sgRNA的载体分别命名为：sgRNA1(含有GDF11-sgRNA1的Px330载体)；sgRNA2(含有GDF11-sgRNA2的Px330载体)；sgRNA3(含有GDF11-sgRNA3的Px330载体)；sgRNA4(含有 GDF11-sgRNA4的Px330载体)，测序结果见图1所示。

实施例3四条sgRNA的特异性靶向验证

(1)细胞培养与收集：使用完全培养基复苏3D4-Cas9细胞(购自ATCC)，传代2-3次后进行转染，转染前一天，将5×10⁵～8×10⁵个细胞接种至6孔板，当密度达到70％时进行转染。

(2)转染：转染的具体步骤参照Lipo2000操作说明进行。将实施例2中构建的4个载体用 lipo2000(Invitrogen)进行转染，48h后收集细胞，以NC质粒(空质粒)作为对照。

(3)特异性靶向sgRNA的筛选:根据所设计的sgRNA序列位置，设计鉴定引物，所述引物序列如表2所示，48h后抽提细胞DNA，并用鉴定引物进行PCR扩增，反应体系为30uL：ExTaq： 15uL，PF：0.6uL，PR：0.6uL，DNA：60-150ng，H2O补至30uL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环，之后72℃延伸5min。将所获得DNA片段命名为GDF11-ATG。PCR产物经产物回收试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)进行回收，然后对该产物进行测序分析。

(4)测序分析

将PCR回收产物进行测序分析，测序结果见如图2，结果表明pX330-GDF11-sgRNA1、pX330- GDF11- sgRNA2和pX330-GDF11-sgRNA3转染的细胞基因组在DNA片段GDF11-ATG中发生了突变(图2 中sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3的测序结果显示:在PAM位点附近，有双峰出现)，而 pX330-Pax7-sgRNA4和对照组则没有变化(图2中sgRNA4和control的测序结果显示:在PAM 位点附近，全部为单峰)。

表2 sgRNA特异性靶向鉴定引物

	核苷酸序列(5’至3’)
		GDF11-ATG-F	AGGAAAGAAAGAGATCGCAGCA
GDF11-ATG-R	ACAGCCGAGAAAGTAGCAGA

综上所述，本发明成功获得了三条特异性靶向猪GDF11基因外显子3起始密码子ATG附近位置的sgRNA，通过靶向验证结果可以看出，三条sgRNA均有高效的编辑GDF11基因的功能，为猪GDF11基因的功能研究及其进一步应用提供了一种基因编辑方法。

主要参考文献

1.Doudna JA,Charpentier E：The new frontier of genome engineering withCRISPR-Cas9. Science.2014,346:1077-1088

2.Hsu PD,Lander ES,Zhang F.Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.Cell,2014,157:1262-127。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 三对特异性识别猪GDF11基因的sgRNA及应用

<141> 2020-12-12

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(48)

<400> 1

atggagcttc gagtcctaga gaacacaaaa cggtctcggc ggaacctg 48

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 2

gtctcggcgg aacctgggtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 3

gggtctggac tgcgatgagc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 4

ctgccgatat cccctcacag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 5

acagtggact ttgaggcatt 20

<210> 6

<211> 432

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(432)

<400> 6

ttgaggggca ggtgacaaaa gagcagggag tgggagctct tcagggctct ctcacatgtc 60

tttcttctct ccctcacccc agcatccttt catggagctt cgagtcctag agaacacaaa 120

acggtctcgg cggaacctgg gtctggactg cgatgagcac tcaagtgagt cccgctgctg 180

ccgatatccc ctcacagtgg actttgaggc atttggctgg gactggatca tcgcacctaa 240

acgctacaag gccaactact gctctggcca gtgcgagtac atgttcatgc aaaagtaccc 300

gcacacccac ttggtgcaac aggctaatcc aagaggctct gctgggccct gctgtacccc 360

caccaagatg tccccaatca acatgctcta cttcaatgac aagcagcaaa ttatctacgg 420

caagatccct gg 432

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 7

caccgtctcg gcggaacctg ggtc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 8

aaacgaccca ggttccgccg agac 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 9

caccgctcat cgcagtccag accc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 10

aaacgggtct ggactgcgat gagc 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 11

caccgctgcc gatatcccct cacag 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 12

aaacctgtga ggggatatcg gcagc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 13

caccgacagt ggactttgag gcatt 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 14

aaacaatgcc tcaaagtcca ctgtc 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<400> 15

aggaaagaaa gagatcgcag ca 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 16

acagccgaga aagtagcaga 20

Claims

1.一种特异性靶向猪GDF11基因TGFB区域的sgRNA导向序列，所述sgRNA导向序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于特异性靶向基因组中需要编辑的区域的如权利要求1所述的sgRNA导向序列，所述sgRNA导向序列分为3组，其中：GDF11-sgRNA1的序列如SEQ ID NO：2所述，GDF11-sgRNA2的序列如SEQ ID NO：3所示，GDF11-sgRNA3的序列如SEQ ID NO：4所示，GDF11-sgRNA4的序列如SEQ ID NO：5所示。

3.权利要求1或2所述的sgRNA导向序列在猪基因编辑中的应用，所述的应用包括如下步骤：

(1)根据猪GDF11基因的基因组序列，在其TGFB区域的起始密码子ATG附近设计4个GDF11-sgRNA，在sgRNA导向序列的5，端加上CACC得到GDF11-sgRNA-F；同时根据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在5，端加上AAAC得到GDF11-sgRNA-R；分别合成上述GDF11-sgRNA-F和GDF11-sgRNA-R，将合成的这两段单链核苷酸经变性退火后形成双链DNA；

(2)将步骤(1)中得到的双链DNA与CRISPR/Cas9载体pX330连接，得到重组表达载体，这些载体为：含有GDF11-sgRNA1的pX330-GDF11-sgRNA1的重组载体；含有GDF11-sgRNA2的pX330-GDF11-sgRNA2的重组载体；含有GDF11-sgRNA3的pX330-GDF11-sgRNA3重组载体；含有GDF11-sgRNA4的pX330-GDF11-sgRNA4重组载体；

(3)将步骤(2)制得的重组表达载体pX330-GDF11-sgRNA1、pX330-GDF11-sgRNA2、pX330-GDF11-sgRNA3和pX330-GDF11-sgRNA4采用脂质体转染的方法分别转染猪的细胞系，48h后收集细胞进行特异性靶向验证，验证方法包括将所得产物测序，最终获得具有特异性靶向的sgRNA导向序列，上述sgRNA导向序列核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

4.包含权利要求2所述的sgRNA重组表达载体pX330-GDF11-sgRNA1，pX330-GDF11-sgRNA2和pX330-GDF11-sgRNA3在构建猪GDF11基因突变库中的应用。