CN110577972B - CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因编辑技术领域,具体为一种CRISPR/Sa‑ShaCas9基因编辑***以及其应用。本发明基因编辑***为Sa‑ShaCas9蛋白与sgRNA形成的复合体,能精确靶向DNA序列,并产生切割,使DNA发生双链断裂损伤;所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑;Sa‑ShaCas9为融合蛋白,把SaCas9的PAM识别结构域(PAM interacting,PI)替换为ShaCas9的PAM识别结构域(ShaCas9‑PI),Sa‑ShaCas9蛋白小,为1055个氨基酸,识别的PAM序列简单,所述Sa‑ShaCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域,具体涉及一种能在细胞中进行基因编辑的CRISPR/Sa-ShaCas9***以及其相关应用。
背景技术
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫***。在CRISPR/Cas9***中,crRNA(CRISPR-derived RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA) 以及Cas9蛋白形成复合体后,识别靶位点的PAM(Protospacer AdjacentMotif)序列,crRNA 会与靶DNA序列形成互补结构,Cas9蛋白行使切割DNA的功能,使DNA发生断裂损伤。其中,tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链指导RNA(singleguide RNA, sgRNA)。当DNA发生断裂损伤后,细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复:非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologousrecombination,HR)。 NHEJ修复的结果会引起碱基的缺失或***,可以进行基因敲除;在提供同源模板的情况下,利用HR修复可以进行基因的定点***和碱基的精确替换。
除了基础科研外,CRISPR/Cas9还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas9***做基因治疗时,需要把Cas9和sgRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV 病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。SpCas9因为PAM序列简单(识别NGG)和活性高而得到广泛应用。但是SpCas9蛋白有1367个氨基酸,加上sgRNA和启动子,无法有效的包装到AAV病毒中,限制了其在临床中的应用。为了克服这个问题,几个小的Cas9 被发明出来了,包括SaCas9(PAM序列为NNGRRT);St1Cas9(PAM序列为NNAGAW); NmCas9(PAM序列为NNNNGATT);Nme2Cas9(PAM序列为NNNNCC);CjCas9(PAM序列为NNNNRYAC),但是这些Cas9或者PAM序列复杂(在基因组中可靶向的DNA序列少),或者编辑效率低,难以广泛应用。寻找Cas9蛋白小,PAM序列简单CRISPR/Cas9***是解决上述问题的希望所在。
发明内容
针对上述问题,本发明目的在于提供一种编辑活性高、Cas9蛋白小、PAM序列简单的 CRISPR/Cas9新的基因编辑***及其应用。
本发明提供的CRISPR/Cas9基因编辑***,为Sa-ShaCas9蛋白与sgRNA形成的复合体,记为CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***(即Sa-ShaCas9蛋白,它和single guide RNA(sgRNA) 共同作用实现基因编辑);能精确靶向DNA序列,并产生切割,使DNA发生双链断裂损伤;所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑;Sa-ShaCas9蛋白小,为1053个氨基酸,识别的PAM序列简单(NNGRM),所述Sa-ShaCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列;所述sgRNA具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列,或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。
本发明中,所述细胞包括真核细胞和原核细胞;所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞。
本发明中,所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人***细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人 MCF-7细胞或TRI细胞。
本发明中,所述CRISPR/Cas9***中Sa-ShaCas9是融合蛋白,是将SaCas9的PI结构域替换为ShaCas9的PI结构域,ShaCas9为Staphylococcus haemolyticusCas9。Sa-ShaCas9融合蛋白和single guide RNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑。
本发明中,所述ShaCas9蛋白属于溶血葡萄球菌属(Staphylococcushaemolyticus),所述ShaCas9蛋白的UniProt的检索号为A0A2T4SLN6。
本发明中,所述Sa-ShaCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的Sa-ShaCas9蛋白。
本发明中,所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。
本发明中,所述精确定位靶向DNA序列包括Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向 DNA序列上的PAM序列。
本发明中,所述PAM序列为NNGRM,所述靶向DNA序列为:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRM(SEQ ID NO:3)。
本发明中,所述Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列,或指将与Sa-ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。
本发明中,所述Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体或与Sa-ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控,所述修饰和调控包括但不限定于基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。
本发明中,所述单碱基转换器包括但不限定于碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、或胞嘧啶到胸腺嘧啶、或胞嘧啶到尿嘧啶、或其它碱基之间的转换。
本发明提供的基因编辑***编辑活性高,与之前的Cas9相比具有明显的优势。
本发明通过基因合成、分子克隆、细胞转染、PCR产物深度测序、生物信息学分析等技术检测CRISPR/Sa-ShaCas9***的编辑效率。
本发明提供的CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***能够在细胞中进行基因编辑,包括通过 Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA,对DNA进行编辑;最后检测编辑效率。具体步骤为:
(1)合成人源化的Sa-ShaCas9基因序列;并克隆到表达载体上,得到pAAV2_ Sa-ShaCas9_ITR;
(2)合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA,即Oligo-F和Oligo-R序列,退火后连接至质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点,得到pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA;
(3)将表达Sa-ShaCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中;
(4)将编辑后的靶位点进行PCR扩增,T7EI酶切或者二代测序检测编辑效率。
本发明中,可以根据具体需要,针对待编辑的DNA序列设计任意靶向的sgRNA,并一定程度上对sgRNA进行本领域所熟知的修饰,所述修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化、甲基化、羟基化。
本发明中,可以根据具体需要,递送至细胞的CRISPR/Sa-ShaCas9***包括但不限定于表达Sa-ShaCas9蛋白或sgRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或Sa-ShaCas9蛋白。
本领域技术人员可以理解的是,碱基N表示A、T、C或G四种碱基中的任何一种。
进一步地,步骤(3)中,所述递送的手段包括但不限定于脂质体、阳离子多聚物、纳米颗粒、多功能信封式纳米以及病毒载体。
进一步地,步骤(3)中,所述细胞包括但不限定于人细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。
进一步地,步骤(2)中,所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,或与SEQID NO:2所示的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列,或基于核苷酸序列进行的修饰,修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化或甲基化。
更具体地,在一个具体实施例中,合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列,即Oligo-F 和Oligo-R,该寡核苷酸单链DNA序列如下:
Oligo-F CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG,(SEQ ID NO:4)
Oligo-R AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC。(SEQ ID NO:5)
更具体地,在一个具体实施例中,本领域技术人员可以理解的是,Oligo-F和Oligo-R需要进行退火变为双链DNA,退火反应体系为1μL 100μM oligo-F,1μL 100μMoligo-R,28μL 水,震荡混匀后,放置于PCR仪中运行退火程序;退火程序如下:95℃_5min,85℃_1min, 75℃_1min,65℃_1min,55℃_1min,45℃_1min,35℃_1min,25℃_1min,4℃保存,降温速率0.3℃/s。
更具体地,在一个具体实施例中,所述质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR需要经过BsaI限制性内切酶(NEB)进行线性化处理。
更具体地,在一个具体实施例中,所述Oligo-F和Oligo-R退火后的产物与线性化处理后的pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR骨架载体通过DNA连接酶进行连接反应。
更具体地,在一个具体实施例中,将连接产物转化至感受态细胞后,经Sanger测序验证正确的克隆,然后提取质粒备用。
更具体地,在一个具体实施例中,步骤(3)中的细胞为HEK293T,其包含的靶位点具有 SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
更具体地,在本发明第一方面的一个具体实施例中,所述实验步骤(4)中PCR的模板为编辑后的HEK293T基因组DNA。
更具体地,在一个具体实施例中,步骤(4)中PCR扩增的引物序列为:
F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGCGAGAAAAGCCTTGTTT; (SEQ IDNO:7)
R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAACTTGTGGCCGTTTAC; (SEQ ID NO:8)
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC;(SEQ ID NO:9)
R2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG; (SEQ ID NO:10)
本发明还提供一种用于基因编辑的CRISPR/Sa-ShaCas9***试剂盒,该试剂盒包括 Sa-ShaCas9蛋白或靶向DNA序列的sgRNA或靶向的DNA。
本发明还提供CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***的应用,包括基因敲除、定点碱基的改变、定点***、基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。
附图说明
图1为CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***切割靶向DNA示意图。其中,灰色椭圆形表示Sa-ShaCas9蛋白,黑色弯曲状表示sgRNA序列,基因组上链中加深区域表示PAM序列NNGG。
图2为质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_U6_BsaI图谱示意图。其中,包括AAV2 ITR、CMV增强子、CMV启动子、SV40 NLS、Sa-ShaCas9、nucleoplasmin NLS、3x HA、bGH poly(A)、人 U6启动子(hU6)、BsaI内切酶位点、sgRNA scaffold序列等元件。
图3为靶位点DNA序列被编辑后的部分二代测序结果。其中编辑结果有缺失、***或错配,最后5bp表示PAM序列NNGRM。
图4为内源位点的T7 Endonuclease I酶切结果。其中,箭头表示切开的片段大小。
具体实施方式
以下将通过实施例进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或制造厂商所建议条件实施。
在一具体实施方式中,本发明提供的CRISPR/Sa-ShaCas9***为一种新的基因编辑***、方法、试剂盒及其应用。
在本发明一具体实施例中,CRISPR/Sa-ShaCas9***能够在细胞中进行基因编辑,所述方法包括如下步骤:
1、构建质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR
步骤(1),根据Sa-ShaCas9基因在UniProt上的检索号A0A2T4SLN6下载的ShaCas9蛋白序列加以改进,得到Sa-ShaCas9基因,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
步骤(2),将Sa-ShaCas9的氨基酸序列进行密码子优化,获得了Sa-ShaCas9在人细胞中高表达的编码序列,如SEQ ID NO:11所示。
步骤(3),将获得基因Sa-ShaCas9的编码序列在公司进行基因合成,并构建至pAAV2_ITR 骨架质粒上,得到质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR,如图2所示。
2、制备线性化质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR
步骤(1),用BasI限制性内切酶将质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR进行酶切线性化,酶切体系:1μg质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR,5μL 10xCutSmart缓冲液,1μLBasI内切酶,水补足至50μl,37℃反应1小时。
步骤(2),将酶切后的产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,120V电泳30分钟。
步骤(3),切除7430bp大小的DNA片段,用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤进行回收,最终用超纯水进行洗脱。
步骤(4),将回收的线性化质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR用NanoDrop测定DNA浓度,备用或置于-20℃进行长期保存。
3、构建质粒pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA
步骤(1),设计sgRNA序列。
步骤(2),在设计的sgRNA序列对用的正义链和反义链上分别加上线性化质粒pAAV2_ Sa-ShaCas9_ITR两侧对应的粘性末端序列,并在公司合成两条寡核苷酸单链DNA,具体序列为:
Oligo-F CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG,(SEQ ID NO:4)
Oligo-R AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC。(SEQ ID NO:5)
步骤(3),寡核苷酸单链DNA进行退火变为双链DNA,退火反应体系:1μL 100μMoligo-F, 1μL 100μMoligo-R,28μL水,震荡混匀后,放置于PCR仪中运行退火程序:95℃_5min, 85℃_1min,75℃_1min,65℃_1min,55℃_1min,45℃_1min,35℃_1min,25℃_1min,4℃保存,降温速率0.3℃/s。
步骤(4),将退火后的产物与线性化质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR在DNA连接酶的作用下依据产品提供的步骤进行连接。
步骤(5),取1μL连接产物进行化学感受态转化,将生长的细菌克隆进行Sanger测序验证。
步骤(6),将测序验证连接正确的克隆摇菌,提取质粒pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA 备用。
4、转染表达Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA的质粒pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA
步骤(1),第0天,根据转染所需,将含有sgRNA靶向位点的HEK293T细胞系在6孔板进行铺板,细胞密度约30%左右,靶位点序列如SEQ ID NO:6所示。
步骤(2),第1天,进行转染,转染体系如下,
i.取2μg待转染质粒pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA加入至100μlOpti-MEM培养基中,轻轻吹打混匀;
步骤(3),将细胞置于37℃,5%的CO2培养箱中继续培养。
5、制备二代测序文库
步骤(1),收集编辑3天后的HEK293T细胞,用DNA试剂盒依据产品提供的步骤提取基因组DNA。
步骤(2),进行PCR建库第一轮PCR,用2xQ5 Mastermix进行PCR反应,PCR引物如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示,反应体系如下:
PCR运行程序如下:
步骤(3),进行PCR建库第二轮PCR,用2xQ5 Mastermix进行PCR反应,PCR引物如SEQID NO:9--SEQ ID NO:10所示,反应体系如下:
PCR运行程序如下:
步骤(4),将第二轮的PCR产物用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤,纯化366bp大小的DNA片段,二代测序文库制备完毕。
6、二代测序结果分析
步骤(1),将制备好的二代测序文库交由公司在HiseqXTen上进行双端测序。
步骤(2)生物信息学分析二代测序结果,部分编辑结果如图2和图3所示。
7、内源位点验证
sgRNA序列为:AGTGAGGGGAACAAAGTGGAC,(SEQ ID NO:12)
靶位点的具体序列为:AGTGAGGGGAACAAAGTGGACATGGC;(SEQ ID NO:13)
步骤(2),提取编辑5天后的细胞基因组DNA,通过2x Q5 Master mix,用引物Test-F 和Test-R将靶向DNA序列进行扩增;其中:
Test-F的具体序列为:GCTGCTTTCCTGCTGTCTTC,(SEQ ID NO:14)
Test-R的具体序列为:AAGGAGGTCTCTGTCTGTGC;(SEQ ID NO:15)
步骤(3),将PCR产物通过琼脂糖凝胶回收,纯化284bp大小的DNA片段;
步骤(4),依照T7 Endonuclease I的说明书对纯化的DNA片段进行酶切,然后跑胶检测,结果如图4 所示,左侧为阴性对照组,转染时无sgRNA,T7 Endonuclease I切靶向序列后无切开的片段,说明未发生编辑;右侧为实验组,转染时有sgRNA,T7 Endonuclease I切靶向序列后出现切开的片段,说明发生了编辑。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***及其应用
<130> 1115
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1055
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile
50 55 60
Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His
65 70 75 80
Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu
85 90 95
Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu
100 105 110
Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr
115 120 125
Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala
130 135 140
Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr
165 170 175
Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln
180 185 190
Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg
195 200 205
Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn
260 265 270
Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe
275 280 285
Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu
290 295 300
Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys
305 310 315 320
Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr
325 330 335
Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala
340 345 350
Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu
355 360 365
Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser
370 375 380
Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala
405 410 415
Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln
420 425 430
Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro
435 440 445
Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile
450 455 460
Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg
465 470 475 480
Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys
485 490 495
Arg Asn Ala Ala Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr
500 505 510
Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp
515 520 525
Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu
530 535 540
Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro
545 550 555 560
Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys
565 570 575
Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu
580 585 590
Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile
595 600 605
Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu
610 615 620
Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp
625 630 635 640
Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Ala Ala Leu
645 650 655
Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys
660 665 670
Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp
675 680 685
Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp
690 695 700
Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys
705 710 715 720
Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys
725 730 735
Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp
755 760 765
Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile
770 775 780
Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu
785 790 795 800
Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu
805 810 815
Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His
820 825 830
Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly
835 840 845
Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr
850 855 860
Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile
865 870 875 880
Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp
885 890 895
Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Ser Tyr
900 905 910
Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Val Ser Ile
915 920 925
Thr Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Tyr Ile Ser Glu
930 935 940
Ala Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Asn Lys Gly Ile Asp Asp Lys Ala
945 950 955 960
Lys Phe Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Asn Asp Leu Ile Glu Leu Asp Gly
965 970 975
Glu Val Tyr Thr Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Lys Asn Asn Val Ile
980 985 990
Glu Leu Asn Leu Pro Glu Ile Arg Tyr Lys Glu Tyr Cys Glu Ile Asn
995 1000 1005
Asn Ile Lys Gly Ser Gly Arg Leu Arg Ile Thr Ile Gly Lys Lys
1010 1015 1020
Val Asn Ser Ile Arg Lys Leu Ser Thr Asp Val Leu Gly Asn Arg
1025 1030 1035
Tyr Tyr Gln Ser Phe Ala Lys Lys Pro Gln Leu Val Phe Lys Lys
1040 1045 1050
Gly Ile
1055
<210> 2
<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 2
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu u 101
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngrm 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccgctcgg agatcatcat tgcg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaccgcaat gatgatctcc gagc 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
gctcggagat catcattgcg nnnnn 25
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngcg agaaaagcct tgttt 55
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc tctgaacttg tggccgttta c 51
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatcactgt gtgactggag ttcagacgtg tg 52
<210> 11
<211> 3165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaagcgga actacatcct gggcctggac atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc 60
atcgactacg agacacggga cgtgatcgat gccggcgtgc ggctgttcaa agaggccaac 120
gtggaaaaca acgagggcag gcggagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gcggcggagg 180
cggcatagaa tccagagagt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac 240
agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gccagagtga agggcctgag ccagaagctg 300
agcgaggaag agttctctgc cgccctgctg cacctggcca agagaagagg cgtgcacaac 360
gtgaacgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcca ccaaagagca gatcagccgg 420
aacagcaagg ccctggaaga gaaatacgtg gccgaactgc agctggaacg gctgaagaaa 480
gacggcgaag tgcggggcag catcaacaga ttcaagacca gcgactacgt gaaagaagcc 540
aaacagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc 600
tacatcgacc tgctggaaac ccggcggacc tactatgagg gacctggcga gggcagcccc 660
ttcggctgga aggacatcaa agaatggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc 720
cccgaggaac tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac 780
gacctgaaca atctcgtgat caccagggac gagaacgaga agctggaata ttacgagaag 840
ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc 900
aaagaaatcc tcgtgaacga agaggatatt aagggctaca gagtgaccag caccggcaag 960
cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acattaccgc ccggaaagag 1020
attattgaga acgccgagct gctggatcag attgccaaga tcctgaccat ctaccagagc 1080
agcgaggaca tccaggaaga actgaccaat ctgaactccg agctgaccca ggaagagatc 1140
gagcagatct ctaatctgaa gggctatacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc 1200
aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgctat cttcaaccgg 1260
ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg tcccagcaga aagagatccc caccaccctg 1320
gtggacgact tcatcctgag ccccgtcgtg aagagaagct tcatccagag catcaaagtg 1380
atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcattatcga gctggcccgc 1440
gagaagaact ccaaggacgc ccagaaaatg atcaacgaga tgcagaagcg gaacgccgcc 1500
accaacgagc ggatcgagga aatcatccgg accaccggca aagagaacgc caagtacctg 1560
atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gaaggcaagt gcctgtacag cctggaagcc 1620
atccctctgg aagatctgct gaacaacccc ttcaactatg aggtggacca catcatcccc 1680
agaagcgtgt ccttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tcgtgaagca ggaagaaaac 1740
agcaagaagg gcaaccggac cccattccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc 1800
tacgaaacct tcaagaagca catcctgaat ctggccaagg gcaagggcag aatcagcaag 1860
accaagaaag agtatctgct ggaagaacgg gacatcaaca ggttctccgt gcagaaagac 1920
ttcatcaacc ggaacctggt ggataccaga tacgccaccg ccgccctgat gaacctgctg 1980
cggagctact tcagagtgaa caacctggac gtgaaagtga agtccatcaa tggcggcttc 2040
accagctttc tgcggcggaa gtggaagttt aagaaagagc ggaacaaggg gtacaagcac 2100
cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgatttca tcttcaaaga gtggaagaaa 2160
ctggacaagg ccaaaaaagt gatggaaaac cagatgttcg aggaaaagca ggccgagagc 2220
atgcccgaga tcgaaaccga gcaggagtac aaagagatct tcatcacccc ccaccagatc 2280
aagcacatta aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcctaat 2340
agagagctga ttaacgacac cctgtactcc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg 2400
atcgtgaaca atctgaacgg cctgtacgac aaggacaatg acaagctgaa aaagctgatc 2460
aacaagagcc ccgaaaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaaactg 2520
aagctgatta tggaacagta cggcgacgag aagaatcccc tgtacaagta ctacgaggaa 2580
accgggaact acctgaccaa gtactccaaa aaggacaacg gccccgtgat caagaagatt 2640
aagtattacg gcaacaaact gaacgcccat ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc 2700
agaaacaagg tcgtgaagct gtccctgaag agctaccgct tcgacgtgta cctgaccgac 2760
aagggctaca agttcgtgag catcacctac ctggacgtgc tgaagaagga gaactactac 2820
tacatcagcg aggccaagta cgacaagctg aagctgaaca agggcatcga cgacaaggcc 2880
aagttcatcg gcagcttcta ctacaacgac ctgatagagc tggacggcga ggtgtacacc 2940
gtgataggcg tgaacaacga caagaacaac gtgatagagc tgaacctgcc cgagatacgc 3000
tacaaggagt actgcgagat aaacaacatc aagggcagcg gcaggctgcg catcaccatc 3060
ggcaagaagg tgaacagcat ccgcaagctg agcaccgacg tgctgggcaa ccgctactac 3120
cagagcttcg ccaagaagcc ccagctggtg ttcaagaagg gcatc 3165
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtgagggga acaaagtgga c 21
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtgagggga acaaagtgga catggc 26
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctgctttcc tgctgtcttc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaggaggtct ctgtctgtgc 20
Claims (16)
1.一种CRISPR/Cas9基因编辑***,基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑,其特征在于,所述CRISPR/Cas9***为Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体,能精确定位靶向DNA序列,并产生切割,使DNA发生双链断裂损伤;所述Sa-ShaCas9蛋白为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;所述sgRNA为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述细胞包括真核细胞和原核细胞;所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞;所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人***细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人MCF-7细胞或TRI细胞。
3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述Sa-ShaCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的Sa-ShaCas9蛋白。
4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。
5.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述精确定位靶向DNA序列包括Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA序列上的PAM序列。
6.根据权利要求5所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述PAM序列为NNGRM,所述靶向DNA序列为SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述sgRNA可以进行磷酸化、硫化、甲基化或羟基化修饰。
8.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列,或指将与Sa-ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。
9.根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA复合体或与Sa-ShaCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控,所述修饰和调控包括基因转录水平的调控、单碱基转换器或染色质成像追踪。
10.根据权利要求9所述的CRISPR/Cas9基因编辑***,其特征在于,所述单碱基转换器包括碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、胞嘧啶到胸腺嘧啶、胞嘧啶到尿嘧啶或其它碱基之间的转换。
11.如权利要求1-10之一所述的CRISPR/Cas9基因编辑***在细胞中进行非治疗目的的基因编辑的方法,包括通过Sa-ShaCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA,对DNA进行编辑;最后检测编辑效率;具体步骤为:
(1)合成人源化的ShaCas9-PI基因序列;并克隆到表达载体上,得到pAAV2_Sa-ShaCas9_ITR;
(2)合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA,即Oligo-F和Oligo-R序列,退火后连接至质粒pAAV2_Sa-ShaCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点,得到pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA;
(3)将表达Sa-ShaCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中;
(4)将编辑后的靶位点进行PCR扩增,T7EI酶切或者二代测序检测编辑效率。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述pAAV2_Sa-ShaCas9-hU6-sgRNA为腺相关病毒骨架质粒,其包括AAV2 ITR、CMV增强子、CMV启动子、SV40 NLS、Sa-ShaCas9、nucleoplasmin NLS、3x HA、bGH poly(A)、人U6启动子、BsaI内切酶位点、sgRNA scaffold序列。
13.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,递送至细胞的CRISPR/Sa-ShaCas9***包括表达Sa-ShaCas9蛋白或sgRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或Sa-ShaCas9蛋白。
14.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列,即Oligo-F和Oligo-R序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示;
步骤(3)中的细胞的靶位点具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列;
步骤(4)中PCR的模板为编辑后的DNA;PCR扩增的引物序列为:SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。
15.如权利要求1-10之一所述CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***的试剂盒,该试剂盒包括Sa-ShaCas9蛋白或靶向DNA序列的sgRNA或靶向DNA。
16.如权利要求1-10之一所述CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑***的应用,包括基因敲除、定点碱基的改变、定点***、基因转录水平的调控、单碱基转换器或染色质成像追踪。
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GR01 | Patent grant | ||
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