CN110468133B - 利用CRISPR/Cas9***敲除猪GOT1基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9***敲除猪GOT1基因的方法。本发明提供特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA、包含该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体、利用该载体进行猪GOT1基因敲除的方法以及猪GOT1基因的检测方法。本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够实现较高的猪GOT1基因敲除效率，显著提高了GOT1基因敲除细胞和GOT1基因敲除猪的构建效率，为猪GOT1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体，以及利用该载体进行猪GOT1基因敲除的方法和猪GOT1基因敲除的检测方法。
背景技术
GOT1是一种磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)依赖的转氨酶，在细胞质基质中参与天冬氨酸(Aspartate,Asp)和α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG)生成谷氨酸(Glutamate,Glu)与草酰乙酸(Oxaloacetate,OAA)的可逆反应，在维持细胞氧化还原平衡、促进肿瘤细胞增殖、调节氨基酸代谢方面具有重要作用。
目前，GOT1基因的研究主要集中在小鼠中，在猪等哺乳动物的研究比较少。通过利用CRISPR/Cas9***敲除猪GOT1基因，在体外和体内研究猪GOT1基因的功能，对于研究GOT1基因在猪发育过程中的功能及其发挥作用的机制具有重要意义。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑的比较前沿的方法。以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列疾病(例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病)的基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景。开发高效的猪GOT1基因的CRISPR/Cas9***敲除方法对于提高猪GOT1基因敲除效率和GOT1基因敲除细胞或动物的构建效率具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供利用CRISPR/Cas9***高效敲除猪GOT1基因的方法以及猪GOT1基因敲除的高效检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA，其靶向猪GOT1基因的第517位至第536位的序列。
本发明通过大量筛选发现采用猪GOT1基因上的第517位至第536位的序列作为靶标序列，具有较高的敲除效率。
针对上述猪GOT1基因上的靶标序列，本发明设计了特异的sgRNA，并进一步发现采用如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列对应的sgRNA能够实现较高的打靶效率和GOT1基因敲除效率。
作为优选，所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：sgRNA-3：5’-ACATTCGGTCCTATCGCTAT-3’。
第二方面，本发明提供含有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
作为本发明的优选实施方式，所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的pHS-CR054载体。
第三方面，本发明还提供所述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA与pHS-CR054载体连接，得到所述CRISPR/Cas9基因敲除载体。
作为优选，所述构建方法包括以下步骤：
(1)用BsmBI酶切载体pHS-CR054，得到线性化载体；
(2)带BsmBI酶切位点的sgRNA序列的片段退火，形成含有BsmBI酶切位点粘性末端的片段；
(3)将步骤(2)得到的退火产物与步骤(1)得到的线性化载体连接，构建连接有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的pHS-CR054载体。
进一步优选地，上述步骤(1)中，酶切的反应体系如下：载体pHS-CR054 500ng，限制性内切酶BsmBI 1μL，NEB 3.1Buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。酶切的反应程序如下：55℃，60min；80℃，20min。
进一步优选地，上述步骤(2)中，退火的反应体系如下：PNK buffer 2μL，上游序列100μM，下游序列100μM，ddH2O补齐至20μL。退火的反应程序如下：95℃，5min；95℃到25℃缓慢冷却，每分钟降2℃。
进一步优选地，上述步骤(3)中，连接的反应体系如下：退火产物1μL，酶切产物1μL，T4DNA Ligase 1μL，10×buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。连接的反应程序如下：16℃过夜。
第四方面，本发明还提供所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA或包含所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体在猪GOT1基因敲除中的应用。
第五方面，本发明提供一种制备GOT1基因敲除细胞的方法，其包括：将含有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞，敲除GOT1基因。
上述将所述CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞可通过转染等常规生物学方法实现。
上述制备GOT1基因敲除细胞的方法，将含有所述特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞后，可采用PCR等常规方法筛选阳性细胞。
本发明利用上述制备GOT1基因敲除细胞的方法获得了GOT1基因敲除的猪细胞。
第六方面，本发明提供一种制备GOT1基因敲除猪的方法，其为利用所述CRISPR/Cas9基因敲除载体实现猪GOT1基因的敲除。
第六方面，本发明提供检测猪GOT1基因表达水平的特异性引物对，其序列如SEQID NO.4-5所示。
第七方面，本发明提供一种检测猪GOT1基因表达水平的方法，其包括如下步骤：
(1)提取待测细胞总RNA，反转录成cDNA；
(2)以步骤(2)的cDNA为模板，利用如SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物对、荧光定量PCR(qPCR)扩增GOT1基因，检测GOT1基因的表达水平。
作为优选，上述步骤(2)中，所述荧光定量PCR扩增以18S rDNA作为内参基因。
进一步优选地，18S rDNA的荧光定量PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.6-7所示。
作为优选，上述步骤(2)中，所述qPCR的反应体系如下：2×GoTaq qPCR MasterMix 10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
所述qPCR的反应程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃30min，60℃15s制作熔解曲线。
作为优选，上述步骤(2)中，对qPCR实时监测得到的扩增曲线和熔解曲线进行分析。以对照组作为外参(设置外参的目的在于消除不同批次的试验误差)计算GOT1基因的表达量。采用独立样本T检验分析比较GOT1基因在不同处理中表达差异，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。所有统计分析采用SPSS version20.0软件完成。
本发明的有益效果至少包括：
本发明利用CRISPR/Cas9敲除***进行猪GOT1基因的敲除。通过猪GOT1基因靶位点的特异选择以及针对该靶位点的sgRNA的特异设计，获得了可高效打靶猪GOT1基因的sgRNA，显著提高了猪GOT1基因的敲除效率。经实验验证，本发明提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够实现较高的猪GOT1基因敲除效率，显著提高了GOT1基因敲除细胞和GOT1基因敲除猪的构建效率。
本发明提供的检测猪GOT1基因表达水平的特异性引物能够快速、准确地对猪GOT1基因的表达水平进行定量分析。
本发明提供的猪GOT1基因的敲除方法和猪GOT1基因表达水平的检测方法具有很强的实用性，为猪GOT1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中pHS-CR054载体的图谱；图中标出了BsmBI酶切位点的位置，在3058bp和3741bp处有两个BsmBI酶切位点。
图2为本发明实施例2中含有3个特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体***的带BsmBI酶切位点的sgRNA序列的测序结果；其中，GOT1_KO1为含有sgRNA-1的CRISPR/Cas9基因敲除载体，GOT1_KO2为含有sgRNA-2的CRISPR/Cas9基因敲除载体，GOT1_KO3为含有sgRNA-3的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
图3为本发明实施例3中转染PK15细胞的显微镜观察结果图；其中，GOT1_KO1、GOT1_KO2和GOT1_KO3分别为携带sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的pHS-CR054载体的转染细胞。
图4为本发明实施例3中转染48h后GOT1基因的mRNA表达量检测结果；其中，NC为空载体，GOT1_KO1、GOT1_KO2和GOT1_KO3分别为携带sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的pHS-CR054载体；*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。
图5为本发明实施例3中转染48h后GOT1蛋白的Western blotting检测结果；其中，Control为空载体对照，GOT1_KO1、GOT1_KO2和GOT1_KO3分别为携带sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的pHS-CR054载体；*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明通过从数据库中下载猪GOT1基因的核苷酸序列，基于对猪GOT1基因序列的分析，根据CRISPR/Cas9识别靶位点的设计原理，进行猪GOT1基因的靶位点的筛选和针对该靶位点的sgRNA的设计和筛选，最终筛选获得了敲除效率最高的sgRNA-3(如SEQ ID NO.3所示)，并构建了含有该sgRNA的CRISPR/Cas9敲除载体，实现了猪GOT1基因的高效敲除。以下实施例中以本发明设计的针对不同靶位点的大量候选sgRNA中的3条为例进行效果说明。
实施例1特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的获得
sgRNA-1靶向猪GOT1基因第518位至第537位的序列，sgRNA-2靶向猪GOT1基因第919位至第938位的序列，sgRNA-3靶向猪GOT1基因第517位至第536位的序列。sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的序列如下：
SEQ ID NO.1：sgRNA-1：5’-CATTCGGTCCTATCGCTATT-3’；
SEQ ID NO.2：sgRNA-2：5’-AGAAGATCGTGCGAGTGACG-3’；
SEQ ID NO.3：sgRNA-3：5’-ACATTCGGTCCTATCGCTAT-3’。
为便于后续与载体连接，在sgRNA的两端添加BsmBI酶切位点序列，得到的双链DNA序列如表1所示。
表1 3个sgRNA对应的双链DNA序列
实施例2含有特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建
本实施例提供含有特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法。
含有特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法包括如下步骤：
1、线性化载体的构建
复苏并扩大培养携带有pHS-CR054载体的菌株(pHS-CR054载体图谱如图1所示，购自北京合生基因科技有限公司)，按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书，进行质粒提取。
提取产物用限制性内切酶BsmBI进行酶切，酶切的反应体系为：限制性内切酶BsmBI 1μL，pHS-CR054载体质粒500ng，NEB 3.1Buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL。酶切的反应程序为：55℃酶切1h，80℃失活20min。
2、sgRNA序列的退火
将如表1所示的3对携带BsmBI酶切位点的sgRNA序列的片段分别进行退火，形成含有BsmBI酶切位点粘性末端的片段。退火的反应体系如下：PNK buffer 2μL，上游序列100μM，下游序列100μM，ddH2O补齐至20μL。退火的反应程序如下：95℃，5min；95℃到25℃缓慢冷却，每分钟降2℃。
3、连接
将步骤2中得到的sgRNA退火产物与步骤1得到的线性化载体pHS-CR054连接。连接反应体系如下：退火产物1μL，酶切产物1μL，T4DNA Ligase 1μL,10×buffer 1μL，ddH2O补齐至10μL，连接反应程序如下：16℃过夜。
4、转化
取步骤3中的连接产物5μL加入刚解冻的50μL DH5α感受态细胞里，混匀，冰浴30min后，42℃热激45s，立即放冰上静置2min，加入950μL于37℃预热的LB液体培养基，37℃震荡培养45min，将菌液低速离心2-3min，倒掉部分上清液，剩余上清液用枪头吹打沉淀，取100μL菌液涂于氨苄抗生素的平板中，于37℃恒温培养箱中正放1h后，倒置培养12h。
5、筛选阳性菌落并进行测序鉴定
挑取步骤4中培养得到的单个菌落，进行菌落PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测。合格的菌落进行摇菌，将1mL菌液送华大基因公司测序测序引物序列如下：CAGGAAGAGGGCCTATTTCCC。对测序正确的菌液样品进行保菌和质粒提取。将测序正确的分别含有3个sgRNA的pHS-CR054载体分别命名为GOT1_KO1(含有sgRNA-1的pHS-CR054载体)、GOT1_KO2(含有sgRNA-2的pHS-CR054载体)、GOT1_KO3(含有sgRNA-3的pHS-CR054载体)，其测序结果如图2所示。
实施例3猪GOT1基因的敲除和检测
本实施例提供利用实施例2构建的含有特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体GOT1_KO1、GOT1_KO2和GOT1_KO3进行猪GOT1基因的敲除的方法以及猪GOT1基因表达水平的检测方法。
1、猪GOT1基因的敲除
(1)细胞培养与收集
使用完全培养基复苏PK15细胞，传代3次后，待细胞进入对数生长期进行转染。转染前一天，将5×105～8×105个细胞接种至6孔板，并在每孔中加入2mL无抗生素培养基，当细胞密度达到60％-80％时进行转染。
(2)转染
按照Lipofectamine 2000说明的要求，将实施例2构建的含有特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体GOT1_KO1、GOT1_KO2和GOT1_KO3用Lipofectamine 2000进行转染，48h后收集细胞；以NC质粒(空质粒)作为对照。转染PK15细胞的显微镜观察结果如图3所示。
2、猪GOT1基因表达水平的qPCR检测
对步骤1得到的阳性细胞进行qPCR检测，具体包括如下步骤：
(1)细胞RNA提取及cDNA合成
采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒提取待测细胞的总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop 1000微量紫外分光光度计测定。
(2)引物设计
根据NCBI公布的猪GOT1基因mRNA序列(GenBank:EU822301.1)设计可检测猪GOT1基因敲除的引物对，经筛选得到能够实现高效的猪GOT1基因检测的一对引物GOT1-1。引物对GOT1-1的序列如下：
上游引物，GOT1-1F：5′-CATCCTGCGAGTCCTTTC-3′；
下游引物，GOT1-1R：5′-CGGTCAGCCATTGTCTTC-3′；
根据NCBI公布的18S基因序列设计引物对18S，引物对18S的序列如下：
上游引物，18S-F：5′-ATGCCAGAGTCTCGTTCGTTAT-3′；
下游引物，18S-R：5′-CGGACAGGATTGACAGATTGAT-3′。
(3)qPCR扩增
以上述步骤(1)中得到的细胞cDNA为模板，利用步骤(2)的引物对GOT1-1和引物对18S进行qPCR扩增。
qPCR的反应体系为：GoTaq qPCR Master Mix(2×)10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。qPCR反应体系的配制采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个去RNA酶的1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到荧光定量PCR专用的8联管中，然后分别加入模板cDNA，再瞬时离心后进行荧光定量PCR扩增，整个操作过程尽量避光。
qPCR的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃30min，60℃15s制作熔解曲线。
(4)qPCR的数据分析
对qPCR结果的扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果表明，各基因扩增曲线均呈“S”形且到达平台期，说明为有效扩增；且各基因的熔解曲线峰值单一，说明扩增产物特异、无引物二聚体及其他非特异性扩增，可以进行后续结果的分析。根据不同处理组的CT值，以NC质粒(空质粒)的对照组作为外参(设置外参是为消除不同批次试验误差)采用相对定量方法计算猪GOT1基因敲除的相对表达量＝2-△△CT。
(5)作图
根据相对定量的计算结果，利用SPSS version 20.0软件进行差异显著性检验，并通过GraphPad Prism 5作图，结果如图4所示，图中个体重复数为3，qPCR加样技术重复为4。结果显示，与对照组相比，敲除GOT1基因使其转录水平显著下调；在3条sgRNA介导的猪GOT1基因敲除中，sgRNA-3介导的敲除细胞中的GOT1基因的转录水平最低，表明sgRNA-3具有优异的猪GOT1基因敲除效率，能够实现猪GOT1基因的高效敲除。
3、猪GOT1基因表达水平的Western blotting检测
采用Western blotting进一步验证猪GOT1基因表达水平，具体方法如下：
提取敲除组和相应空白对照组细胞的总蛋白，取200ng蛋白上样，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。再经过转膜、封闭、孵育一抗和二抗后使用LICOR仪器曝光，再使用仪器自带软件Image Studio计算分析条带光密度值。结果如图5所示，在3条sgRNA介导的猪GOT1基因敲除中，sgRNA-3介导的敲除细胞中的GOT1基因的表达水平最低，表明sgRNA-3具有优异的猪GOT1基因敲除效率，能够实现猪GOT1基因的高效敲除。
综述所述，利用本发明提供的特异型靶向猪GOT1基因的sgRNA(SEQ ID NO.3)以及含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体能够实现高效的猪GOT1基因敲除；同时利用本发明提供的猪GOT1基因的特异性引物能够实现GOT1基因表达水平的快速准确检测；本发明为猪GOT1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 利用CRISPR/Cas9***敲除猪GOT1基因的方法
<130> KHP191113496.5
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cattcggtcc tatcgctatt 20
<210> 2
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 3
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggaagagg gcctatttcc c 21
Claims (3)
1.一种特异性靶向猪GOT1基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体，其特征在于，其为连接有特异性靶向猪GOT1基因的sgRNA的编码基因的pHS-CR054载体，所述sgRNA靶向猪GOT1基因的第517位至第536位的序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体在猪GOT1基因敲除中的应用。
3.一种制备GOT1基因敲除细胞的方法，其特征在于，将权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞，敲除GOT1基因。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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