JP7308380B2 - 遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入のための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年1月10日に出願された米国仮特許出願第62/444,629号、2017年6月2日に出願された米国仮特許出願第62/514,494号および2017年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/533,170号に対する合衆国法典第35編第119条(e)に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の試験のための実施において使用されてよいが、例示的な材料および方法が本明細書で説明される。本発明の説明および特許請求において、以下の用語が使用されるであろう。
本発明は、遺伝子編集技術を用いたインビトロ部位特異的変異導入を実施するための新規の方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、リボヌクレオチド粒子(RNP)とオリゴヌクレオチドとバッファと無細胞抽出物とそれらの使用のための取扱説明資料とを含むインビトロ部位特異的変異導入キットを包含する。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、よく研究されており、多数の化学修飾とバリエーションをそれらの組成に組み込むことができるため、遺伝子編集のために有用な合成DNA分子である。これらの修飾のいくつかは、二本鎖DNA標的に対するより高い結合親和性を可能にし、重要な反応中間体であるD-ループが遺伝学的交換を導くのに十分なほど安定であることを確実にする。標的遺伝子における所望の遺伝学的変化がより高い効率で生じるように、いくつかのクラスの化学修飾をこの研究において用いることができる。特定の実施形態では、一塩基ヌクレオチド改変、欠失または挿入は、無細胞抽出物におけるヌクレアーゼ消化を防ぐために化学修飾された末端連結を有する約72塩基長のオリゴヌクレオチドによって実施される。この主力オリゴヌクレオチドは、それが、完全な相同域(perfect homologous register)で、および変更のために指定された標的遺伝子中のヌクレオチドにおいて生じる単一のミスマッチを除き標的遺伝子配列と相補的に、結合するように設計される。ミスマッチ塩基対は、それが、相補鎖のアラインメントの間にオリゴヌクレオチド中の中央の塩基で生じる場合に最も効率的に修正される。二重のヌクレオチド置換または小さな挿入もしくは欠失が望まれる標的遺伝子の改変の場合、ターゲティングオリゴヌクレオチドにおいて2つのタイプの化学修飾が利用される。両方とも、標的親和性を高めるように設計され、その結果、標的遺伝子の一部を欠失させることができるか、または小さな挿入を遺伝子配列内に配置できる。結合親和性、および一本鎖オリゴドナー(ssODN)がヘリックスに組み込まれる際の侵入するssODNと二本鎖との間での安定なDNA対形成、を増加させる化学修飾は、単独で、または組み合わせて、ターゲティングオリゴヌクレオチド中に合成される。
発現ベクターまたはエピソーム標的に位置する遺伝子を編集するための酵素活性をもたらす細胞抽出物についてはいくつかの供給源が存在する。哺乳動物細胞のみから核抽出物を単離および精製する傾向があるかもしれないが、細胞質の活性を含む全細胞抽出物は、より高いレベルの遺伝子編集を可能にし、従って、本明細書で説明される実験において使用される。哺乳動物の無細胞抽出物は、HEK、HUH-7、DLD1、HCT116およびS.cerevisiae細胞を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの細胞から得ることができる。後者2つは結腸癌細胞に由来し、前者は肝臓に由来する。各細胞株は、遺伝子編集活性を触媒できる細胞抽出物のための豊富な供給源となっている。これらの細胞株は、1つ以上のミスマッチ修復タンパク質活性が欠損していることが知られており、これは、やや直感に反するものの、より高いレベルの遺伝子編集を実際に可能にする。ヌクレオチドの交換、挿入または欠失を可能にするために、侵入するオリゴヌクレオチドと標的遺伝子とによってミスマッチが生じると、野生型のミスマッチ修復経路の自然な傾向は、その対形成を認識して不安定化するはずである。広範な遺伝学的および生化学的な研究が実施され、標的部位でssODNによって駆動されるヌクレオチド交換が、そのような変異細胞のバックグラウンドでは亢進されるということが示された(Dekker et al. Nucleic Acids Res. 31(6) e27)。発現ベクターの遺伝学的改変を可能にする酵母(主にS.cerevisiae)からの無細胞抽出物の調製と利用は、エピソーム標的を改変するための革新的なアプローチをもたらす。著しく遺伝学的に扱いやすいS.cerevisiaeにおける遺伝学的バックグラウンドの多様性は、一塩基修復、小さなセグメントの欠失、小さなセグメントの挿入または遺伝子フラグメントの重複の実行においてより効率的な可能性がある酵素活性の豊富な供給源をもたらす。従って、最も有効かつ迅速な様式で成功を収めるために、目的に応じて適切な株を無細胞抽出物の供給源として利用できる。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、広範囲の適切な遺伝学的改変を生じさせるための最も効率的なストラテジーをもたらす。しかし、特定の一連の遺伝子変化が問題となるのであれば、追加の遺伝学的ツールを補充した細胞抽出物を用いてよい。哺乳動物細胞株で高発現する多種多様なCRISPR/Cas9発現コンストラクトが利用可能である。これらのコンストラクトの非限定的な例としては、ヒトのコドンに最適化されたSpCas9とキメラガイドRNAのための挿入部位とを含むプラスミドp42230、およびpX330バックボーンベクター(Addgene)を用いた他のコンストラクトが挙げられる。特定のCRISPR/Cas9コンストラクトを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、無細胞抽出物を調製する前に発現させることにより、遺伝子編集の酵素活性を高めることができる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、無細胞抽出物の補充は、オリゴヌクレオチドを特定の部位に導いて標的遺伝子の編集の頻度を間接的に高めるのに役立つ可能性がある。特定の実施形態では、標的遺伝子のDNAセグメントの単純な欠失または挿入が実験の目的であれば、最初にCRISPR/Cas9の機能を補充した無細胞抽出物を利用して、その遺伝学的変化の発生を可能にすることが好ましい可能性がある。長い一本鎖DNA分子を哺乳動物の遺伝子にインフレームで挿入して、その機能しない遺伝子にタグ付けする、革新的な一連の実験が実施されている(Miura et al. Sci Rep. 2015, Aug 5;5:12799)。そのようなアプローチも、無細胞抽出物を用いてインビトロで使用できる。
特定の態様では、本発明は、標的配列のためのインビトロ変異導入キットを提供する。一実施形態において、キットは、単離リボヌクレオチド粒子(RNP)と、二本鎖オリゴヌクレオチドと、プラスミドと、バッファと、無細胞抽出物と、DNAリガーゼと、それらの使用のための取扱説明資料と、を含む。RNPは、crRNAおよびCpf1酵素を含み、ここで、crRNAは、標的配列に対して相補的であり、二本鎖オリゴヌクレオチドは、Cpf1切断部位に対して相補的な5’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、NotI制限部位を含む。
CRISPR/Casシステムは、標的とされる遺伝学的変化を誘発するための容易かつ効率的な系である。Cas9タンパク質による標的の認識は、ガイドRNA(gRNA)中の「シード」配列と、gRNA結合領域の上流にプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を含む保存されたトリヌクレオチドと、を必要とする。そのため、CRISPR/Casシステムは、細胞株(293T細胞など)、初代細胞およびCAR T細胞における使用のためにgRNAを再設計することによって事実上任意のDNA配列を切断するように設計できる。CRISPR/Casシステムは、単一のCas9タンパク質を2種以上のgRNAと共発現させることによって複数のゲノム上の座位を同時に標的とすることができ、これにより、この系は、複数の遺伝子編集または複数の標的遺伝子の相乗的活性化に比類なく適したものとなっている。
本発明はさらに、以下の実験による実施例を参照することにより、詳細に説明される。これらの実施例は、単に説明を目的として提示されているに過ぎず、特に指定の無い限り、限定することを意図したものではない。従って、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
無細胞抽出物は、Cole-Strauss et al., 1999. Nucl.Acids Res. 27(5), 1323-1330に概説されている手法に従って2億個のHCT116-19細胞から調製した。得られた抽出物をすぐに等分し、-80℃で保存した。HEK293細胞(ATCC, American Type Cell Culture)を培養し、8×106個の細胞を回収し、すぐに冷低張バッファ(20mM HEPES、5mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、および250mM スクロース)で洗浄した。細胞を遠心分離し、洗浄し、スクロースを含まない冷低張バッファに再懸濁した後、氷上で15分間インキュベートしてから、25ストロークのDounceホモジナイザーで溶解させた。濃い細胞ライセートの細胞質画分を氷上で60分間インキュベートし、12,000g、4℃で15分間遠心分離した。次いで、上清を等分し、すぐに-80℃で凍結した。Bradfordアッセイを用いて無細胞抽出物の濃度を決定した。
Cas9およびtracrRNA:crRNA成分を、1反応あたり10pmolで8つの反応を行うことができるようにRNP複合体としてアセンブルさせた。
特定の実施形態では、表1に示される成分で反応を準備し、37℃で120分間インキュベートした。特定の実施形態では、インビトロDNA切断反応混合物は、20μlという最終体積で反応バッファ(100mM NaCl、20mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml BSA)中に混合された、250ngのpHSG299(Takara Bio Company、滋賀、日本)またはpKRAS6163のプラスミドDNAと10pmolのRNPを含んだ。各反応を37℃で15分間インキュベートした後、反応混合物からDNAを単離し、シリカスピンカラムを用いて精製した。二次的なインビトロ再環状化反応は、35μlという最終体積となるように反応バッファ(20mM TRIS、15mM MgCl2、0.4mM DTT、および1.0mM ATP)中に混合された、最初の切断反応から単離されたDNAと、リガーゼを補充された175μgの無細胞抽出物と、を含んだ。各反応を37℃で15分間インキュベートした。二本鎖の挿入フラグメントまたは置換フラグメントを含む反応の場合、100pmolを最終反応混合物に添加した。次いで、最終反応混合物からのDNAを、シリカスピンカラム(Qiagen, Hilden, ドイツ)を用いて精製した。
インキュベーションの後、各反応混合物をPBバッファにより1:5の比率で希釈した。QiagenのQIAprep Miniprepプロトコルに従ってシリカメンブレンスピンカラムを用いてプラスミドDNAを単離し、10μLの水で溶出した。ミニプレッププラスミドの収量は620ng~1.8μgの範囲であったが、対照混合物では全成分混合物よりもプラスミドの回収量が高かった。
8つの反応混合物の各々から単離された、完全なプラスミドDNAの濃度が様々な10μLを全て用いて、8つの形質転換を実施した。形質転換は、Invitrogen OneShot TOP10 Chemically Competent E.coliのプロトコルが概説するヒートショック手法のプロトコルに従って実施した。
形質転換細胞を1:5および1:100の希釈の後にカナマイシンプレートにプレーティングし、一晩インキュベートしてカナマイシン耐性コロニーを増殖させた。インキュベーションの後、最後の3つの全成分反応を優先しながら1:100希釈のプレートの8枚から30コロニーを選択し、密封し、シーケンシングのために発送した。
インビトロ反応から回収したプラスミドDNAをヒートショック法によってDH5α(Invitrogen, Carlsbad, CA)またはTOP10 One Shot(Thermo Fisher Scientific Wilmington, DE)のコンピテントE.coliに形質転換した。コンピテント細胞を氷上で30分間インキュベートし、42℃で20秒間ヒートショックを与え、氷上に2分間置き、225rpmで1時間、37℃にて1mlのSOC培地中でインキュベートした。無希釈のコンピテント細胞を、カナマイシンを含む培地上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。単一のカナマイシン耐性コロニーを選択し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, ドイツ)によってプラスミドDNAを単離した。細菌コロニーから選択されたプラスミドDNAに対する改変を、DNAシーケンシング(GeneWiz, South Plainfield, NJ)の後に評価した。関連するプラスミドの野生型配列に対してサンプルの配列をアラインメントするためにSnapGeneソフトウェアを用いて、配列分析と破壊パターンを評価した。
RNPのアセンブリのために、tracrRNAおよび(cr)isprRNAを別でアニーリングさせた後、精製Cas9タンパク質を添加した(図1)。RNPのアセンブリの条件およびCas9は、IDT(Integrated DNA Technologies(IDT), Coralville, IA)によって提供された。
本発明の遺伝学的読み出しの系の初期化と検証のストラテジーを図6に示す。RNP粒子のアセンブリから始まり、その後に、一本鎖オリゴヌクレオチドと無細胞抽出物と遺伝子標的(この非限定的な実施例ではeGFP遺伝子)を有する超らせんプラスミドDNAテンプレートとが添加される、反応全体が示されている。反応は40~60分間行われ、その後に、標準的なDNAミニプレップのプロトコルを用いて標的プラスミドを単離する。次いで、ヒートショックプロトコルによってプラスミド集団をエシェリキア・コリ(Escherichia coli)に形質転換し、アンピシリンを含む寒天プレート上に細胞をプレーティングする。元のプラスミドには野生型アンピシリン耐性遺伝子が含まれており、従って、アンピシリン耐性を有する単一の形質転換細菌細胞から増殖する細菌コロニーを選択できる。アンピシリン耐性コロニーを採取し(通常は一度に50個)、DNAシーケンシングのために処理する。eGFP遺伝子を含むDNA配列における対照の反応が、遺伝子の強調表示を伴ってプレートの下に示されている。本明細書で実証される実験では、TAGコドンが、TACへの変換の標的とされた。
Cas9タンパク質は、インタクトなタンパク質の結合ドメイン内に埋め込まれた2つの核酸分解ドメインを含む。Cas9に対して行われた遺伝子操作により、現在、野生型タンパク質の2つの変種が生み出されている;dead Cas9(dCas9)と呼称されることが多い不活性型Cas9、および2つのヌクレアーゼドメインのうちの一方が不活性に変更されている酵素であるニッカーゼ。この酵素は、二重らせんの2本の鎖のうちの一方を切断する能力を保持している。これらのCas9バリアントは両方とも、反応全体の頻度と汎用性を改善するためにインビトロ変異導入アッセイ内で系統的に試験することができる。その理論的根拠は、オリゴヌクレオチドによる変異導入の標的となる部位での単一の切断の導入またはDNAヘリックスの巻き戻しが、反応全体の特異性と効率を改善できるということである。
本発明は、標的遺伝子を改変するための新規の方法を提供し、無細胞抽出物系、RNP、オリゴヌクレオチドおよびプラスミド発現ベクターを利用する。発現ベクターは、目的の遺伝子(標的遺伝子)を含み、特定の実施形態では、遺伝学的に変化したプラスミドの選択のための修正マーカーとして働く変異型カナマイシン遺伝子を含む。特定のオリゴヌクレオチドによって導かれる遺伝子の変化は、E.coliにおける遺伝学的読み出しを利用することによって測定される。この実施形態では、発現コンストラクト中に挿入されたカナマイシンに対する耐性を付与する変異型遺伝子が、特定のホスホロチオエート結合を有する72塩基長の標準オリゴヌクレオチドによる修正に関して同時に標的となる。遺伝子編集は、哺乳動物細胞または酵母細胞から作製された無細胞抽出物において生じ、修復されたカナマイシン遺伝子の発現は、寒天プレート上のカナマイシン耐性細菌コロニーの出現によって測定される。カナマイシン耐性については、その目的は、遺伝子中の4021位のG/C塩基対(変異型)をC/G塩基対(機能型)に変換すると同時に標的遺伝子を遺伝学的に変化させることである。次いで、単離されたプラスミドは、機能するRecAタンパク質を欠くE.coliにエレクトロポレーションされる。この読み出しには、相同組換えとミスマッチ修復が欠損している細菌株が用いられるが、これは、これらの細菌が、それら自体では標的ヌクレオチド置換を触媒しないためである。このストラテジーは、バックグラウンドのレベルを最小化し、特定の標的遺伝子の変化を有するプラスミドのより効率的な特定を可能にする。E.coliからのプラスミドの単離とDNAシーケンシングは、そのプラスミド上で遺伝子編集活動が起こったことを示すカナマイシン耐性の最初の選択を介して遺伝学的変化を裏付ける。
本明細書で説明される同じ基本的反応ワークフローをヌクレオチドの挿入に利用した:RNP粒子によって触媒されるDNA切断;ドナーDNA(この場合は、予めアニーリングされた二本鎖フラグメント)の添加;その後の、外因的に添加されるDNAリガーゼを補充した、HEK293細胞から作製される、哺乳動物の無細胞抽出物の添加。ここでの目的は、二本鎖切断を生じさせてプラスミド中に含まれるDNA配列の除去を実行するという先の例における意図とは反対に、RNP切断の部位に15塩基の二本鎖フラグメントを挿入することであった。この実証は、遺伝子編集インビトロ変異導入アッセイの適用範囲を、インビトロ反応に関して越えるべき重要な障壁である遺伝子またはDNAの挿入の領域にまで広げる。
遺伝子編集のプロセスを研究するための完全に統合された無細胞系をここで構築した。図23Aは、プラスミドDNAの部位特異的切断を導くRNP粒子へとアセンブルされたCas9またはCpf1を用いる反応の初期化と、それに続くDNAリガーゼを補充した哺乳動物の無細胞抽出物の添加と、を図示する。反応を37℃で15分間インキュベートし、プラスミドDNAを回収し、その後のコロニー選択とプラスミドDNAの分析のためにE.coliに形質転換した。無細胞抽出物は、直鎖状となったプラスミドのプロセシングに必要な触媒活性(特にDNAの切除、リン酸化およびライゲーションを含む)を提供する。外因的に加えられたドナーDNAの存在下において、DNAのフラグメントを切断部位に正確に挿入できる。
本明細書で説明されるように、ヒト細胞におけるゲノム修飾を取り巻く分子経路と調節回路を解明するために使用できるCRISPRを利用した遺伝子編集システムが確立された。この目標に向けて、Cas9 RNP、pHSG299および哺乳動物の無細胞抽出物を伴うインビトロ反応においてpHSG299に対するDNA切断活性を利用した。主な目的は、切断部位に特異的欠失を生じさせることと、その後の再環状化および細菌での遺伝学的読み出しであった。図25Aは、関連する遺伝学的ツールと共に遺伝学的標的の概要を示し、図25Bは、その結果を図示する。協調的努力および18個のクローンの分析にもかかわらず、Cas9 RNPによって触媒される反応から生じる配列の欠失を有する改変されたプラスミド分子は特定されなかった。Cas9 RNP粒子のヌクレアーゼ活性を2つの別個のエキソヌクレアーゼ(T7およびExo I)と組み合わせたいくつかの予備的実験を実施した。酵素のユニークな組み合わせを用いた1つの事例においてのみ、切除されたDNA配列が観察された。この反応は、ロバストなものではなかった。このネガティブな結果は、Cas9による切断が、インビボとは異なりインビトロではDNA切除の影響を受けにくくなる可能性がある平滑末端の二本鎖DNA切断を生じさせる、という事実に起因する可能性がある。
指定のCpf1切断部位で相同組換え修復(homology directed repair)(HDR)を介してDNAの挿入を実行することを試みることによって実験系を拡張した。そのために、アニーリングさせると、pHSG299には固有の部位が存在しない制限酵素NotIのための切断部位を含む二本鎖DNAフラグメントが生じる、2つの短い相補的DNA分子を合成した。NotI制限部位および実験系は、それぞれ図26Aおよび図26Bに示されており、実験プロトコルは、図26Cに概要が示されている。個別の遺伝子編集事象を調査するために、外因的に加えられたフラグメントの組み込まれたアームとネイティブのlacZ遺伝子の領域との間の相同領域を、NotI部位に対して上流の位置に2塩基対の「バーコード」(TT:AA)を含めることによって識別した。中間ステップとして、および挿入されたフラグメントの存在をチェックするために、選択された細菌コロニーからプラスミドDNAを単離し、制限酵素NotIで消化した。図26Dに示されるように、いくつかの精製プラスミドDNAサンプルがNotIによって消化され、予想通りに直鎖状となったプラスミドDNAが生じた。フラグメントの挿入は、反応混合物中の無細胞抽出物の存在に依存していたが、これは、無細胞抽出物が存在しない場合にはNotIによる切断が観察されなかったためである。
アニーリングされた二本鎖DNAフラグメントの代わりに一本鎖DNA分子がHDRとフラグメントの挿入を導くことができる可能性を調査した。図28Aおよび図28Bは、この実験で用いられる一本鎖分子および標的部位に対するそれらの方向/位置の図を提示する。これらの一本鎖分子は、本明細書で説明される先の実験において用いられた二本鎖フラグメント(図26Bを参照のこと)を構成するものであった。各分子は、Cpf1の互い違いの切断部位のオーバーハングに対して相補的な5塩基の領域を伴う10塩基のオーバーハングを有する。図4Cに概要が示されている同じ実験プロトコルに従って、反応混合物から回収された精製DNAを細菌細胞に形質転換し、選択された細菌コロニーからプラスミドDNAを単離した。単離されたDNAサンプルに対してNotI制限消化を実施したが、その結果を図28Cに提示する。センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドNotI-Sを含む反応から単離されたDNAプラスミドにまず注目すると、挿入を含むいくつかの産物はNotI酵素消化によって切断できるということが観察された。非センス鎖に組み込まれる一本鎖オリゴヌクレオチドNotI-NSを含む反応からのサンプルも、NotI制限部位を有する産物分子を生じさせた。まとめると、NotIとのインキュベーションによって首尾よく切断できるプラスミド分子の集団が観察されたが、これは、NotI部位を含む一本鎖DNA分子の少なくとも一部の挿入が成功したことを示す。
この実験では、図29Aに示されるように、異なる部位で切断する2つのCpf1ヌクレアーゼを用いて、親プラスミドからフラグメントを切り出し、それを、相補的なオーバーハングを有する2つの相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングによって作製した186塩基対のフラグメントで置き換えた。図29B~図29Cに提示される配列は、このインビトロ反応について細菌における読み出しで得られた配列を示す。図29Dは、大部分は欠失であるが、挿入が成功した1つのクローンを含む、得られた結果のタイプを図示する。重要なことに、本明細書で提示される先のデータでは1つのCpf1酵素が用いられたのに対し、この実験では、2つのCpf1酵素を用いて、プラスミドのフラグメントを欠落させ、同様のサイズのドナーDNAフラグメントを首尾よく挿入するのに成功した。
Cpf1ヌクレアーゼを含むRNP複合体の部位特異的DNA切断活性を、ドナーDNAフラグメントを用いてプラスミド中でのDNA切除、DNA挿入および遺伝子セグメント置換を触媒できる哺乳動物の無細胞抽出物と組み合わせた(図23A)。CRISPRによって導かれる改変を含むプラスミドDNAをインビトロ反応から回収し、コンピテントE.coliに形質転換し、次いで、カナマイシンを含む寒天上に当該E.coliをプレーティングした。改変されたプラスミドDNAを、最初に抗生物質耐性および表現型の変化(すなわち、色)によって、および/またはDNA配列分析によって直接、特定した。2つのターゲティングシステムを利用した;lacZ遺伝子のインタクトな機能するコピーを含むプラスミドpHSG299、および癌遺伝子KRASのインタクトな機能するコピーを含むプラスミドpKRAS6163。lacZ遺伝子中で生じる挿入反応または置換反応は、遺伝子編集活性を示す、青から白への色の変化をもたらす。pKRAS6163における挿入または置換は、成功した遺伝子編集活性を特定するのにDNA配列分析を必要とする。
ここでは、おそらく非相同末端結合反応を反映する部位特異的欠失およびおそらく相同組換え修復を反映する一本鎖DNAフラグメントの部位特異的挿入の両方がこのインビトロ系において可能であるということが実証された。遺伝子のセグメントの正確な置換を触媒的にサポートするこの系の能力が試験された。遺伝子編集の長期的な目的の1つは、機能しない遺伝子または機能に異常のあるエクソンの機能するコピーを首尾よく元に戻すことである。挿入の評価のために実施したのと同じ反応ストラテジーを実施したが(図23Aを参照のこと)、但し、この反応では、遺伝子のセグメントを取り除くために、2つのCpf1 RNPを用いて、lacZ遺伝子に沿った異なる位置に2つの切断を生じさせた。81、136および177塩基対の遺伝子セグメントを置換するように別個の反応を設計し、81、136および186塩基のドナーDNAフラグメントの個々の集団を別個の置換反応の各々にそれぞれ添加した。81塩基のDNAドナーフラグメントを含む反応に関しては、回収されたコロニーの20%が、lacZ遺伝子のコード領域を保つ完全な置換をインフレームで含んでいた(図33A)。136塩基置換反応の66パーセントは、完全な置換を含むプラスミドをもたらし(図33B)、186塩基置換反応の10%は、完全な置換を有するプラスミドを含んでいた(図33C)。確実に5’オーバーハングの相同性をネイティブの遺伝子セグメントと区別できるように、ドナーDNAフラグメントの各々にバーコードAA/TT/GGGを組み込んだ。17、36および45塩基の長さのドナーDNAフラグメントでも同じ実験を実施した。これらのドナーDNAフラグメントはいずれも、正確な置換をもたらさなかったが(図35A)、但し、それらは、様々な長さと構成の、不正確な置換を生じさせた。これらの結果は、このインビトロ遺伝子編集システムが約81~186塩基の範囲の長さのドナーDNAフラグメントによる完全な遺伝子セグメント置換を触媒できるということを実証した。ドナーDNAセグメントを含む反応から生じた単離プラスミドの集団においても部位特異的欠失が見出されたということに注目することも重要であり(図35B)、これは、欠失/切除反応および置換反応の両方が同じインビトロ系において起こっていたという事実を裏付ける。
高精度でのlacZ遺伝子の一部のDNA置換の成功は、インビトロ遺伝子編集のユニークな用途の試験を促した。完全な遺伝子セグメント置換が注目すべき頻度で観察された(特に81~186塩基の長さを有するドナーDNAフラグメントを用いた場合)。KRAS遺伝子を標的として、コード領域内に見出される周知の発癌性変異を再設計することが決定された。最初の13個のコドン内に2つの目立った変異が見られた。35位では、GからAへの塩基転換により、これらのコドンから生じるアミノ酸がグリシンからアスパラギン酸に変化する(図36A)。隣接するコドン13では、2番目のGからAへの塩基転換が、やはり、グリシンをアスパラギン酸残基に変換する。これらの変異の各々は、単一の部位変化として、あるいは二重の部位変化として、KRASタンパク質の機能の再変更に重大な影響を与え得る。従って、G12D、G13DおよびG12DとG13Dの変異の組み合わせを有する3種のドナーDNAフラグメントで多重化することにより、単一の反応混合物において3種の変異の全てを生じさせた(図36B)。最適化反応の結果は、成功した効率的な置換を81~186塩基の範囲のフラグメントで達成できることを示したため、114塩基のドナーDNAフラグメントを利用した(図33A~図33C)。反応は、図23Aで説明されるように実施されたが、1点の変更を伴った:ドナーDNAフラグメントとRNPとの間のモル関係が維持され、その結果、この反応では、3種の異なるドナーフラグメントはそれぞれ、反応中に33%しか存在しなかった。結果を図36Cに提示する。KRAS遺伝子の部位特異的変異導入を単離し、14個の細菌コロニーから独立的に単離されたプラスミドDNAを分析することにより確認した。この集団内で、個々の変異および二重変異の両方が見出された。配列決定されたプラスミドの78%が個々の変異または二重変異のいずれかを含むことが見出され、50%は完全に置換されていた。これらの結果は、このインビトロ遺伝子編集反応を用いて、正確な遺伝子セグメント置換を多重化し、単一の反応混合物から部位特異的変異の集団を生じさせることができる、ということを明らかにした。さらに、この反応が本当に部位特異的であり、KRAS遺伝子のコード領域内に望ましくない標的外部位の変異を生じさせていないことを確認するために、KRAS遺伝子のコード領域を超えて上流および下流までプラスミドを配列決定した。シーケンシングストラテジーおよびKRASのコード領域内の置換部位の位置のマップが図36Dに示されている。図36Cに示されるG12D/G13DドナーDNAフラグメントを含むインビトロ反応から単離された再設計されたプラスミドDNA上の標的部位における意図された突然変異以外に、遺伝子に沿った他の位置ではDNA配列の変化は観察されなかった。これらの結果により、このインビトロ遺伝子編集システムは、検出可能な標的外部位の変異を生じさせることなく真核生物の遺伝子のコード領域内に複数の部位特異的変異を生じさせるために用いることができる、ということが示された。
本明細書中の可変物の定義における要素の列挙の記載は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ(またはサブコンビネーション)としての当該可変物の定義を包含する。本明細書中の実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としての、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせた、当該実施形態を包含する。
Claims (22)
- 標的配列のインビトロ変異導入を実施するための方法であって、
単離リボヌクレオチド粒子(RNP)と第1のプラスミドとオリゴヌクレオチドと遺伝子を編集するための酵素活性を有する細胞抽出物とを含む混合物をインキュベートするステップであって、
前記RNPは、前記標的配列に対して相補的であるcrRNAおよびCasエンドヌクレアーゼを含み、
前記第1のプラスミドは、前記標的配列のヌクレオチド配列を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して相補的であるが少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列を含み、
従って変異した第2のプラスミドを生じさせる、
ステップと;
複数の細胞に前記第2のプラスミドを与えるステップと;
を含む方法。 - 前記Casエンドヌクレアーゼは、Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Cpf1、Cpf2、CasY、およびCasXからなる群より選択される;または
前記Casエンドヌクレアーゼは、spCas9またはsaCas9である;
請求項1に記載の方法。 - 前記RNPは、tracrRNAをさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記tracrRNAおよび前記crRNAを単一のRNAコンストラクトが含む、
請求項3に記載の方法。 - 各オリゴヌクレオチドは、独立的に、25~200塩基長である;または
各オリゴヌクレオチドは、独立的に、72塩基長である、
請求項1に記載の方法。 - 前記インビトロ変異導入は、一塩基ヌクレオチド改変、欠失および挿入からなる群より選択される、前記標的配列のヌクレオチド配列における少なくとも1つの変異を含む、請求項1に記載の方法。
- 各オリゴヌクレオチドは、独立的に、化学修飾された末端連結をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞抽出物は、全細胞抽出物、無細胞抽出物、核抽出物、および細胞質抽出物からなる群より選択される;または
前記細胞抽出物は、真核細胞抽出物である;請求項1に記載の方法。 - 前記真核細胞抽出物は、哺乳動物細胞抽出物であるか、またはS.cerevisiaeに由来する、請求項8に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞抽出物は、HEK、HUH-7、DLD1、およびHCT116からなる群より選択される少なくとも1種の細胞に由来する、請求項9に記載の方法。
- (a)前記混合物が、(i)複数のRNPであって、各RNPが、前記複数のRNPの他のRNPのcrRNAと比較して異なる標的配列に対して相補的であるcrRNAを含む、複数のRNPと、(ii)複数のオリゴヌクレオチドであって、各オリゴヌクレオチドが、前記複数のオリゴヌクレオチドの他のオリゴヌクレオチドと比較して異なる標的配列に対して相補的であるがその異なる標的配列と比較して少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドと、を含み;
(b)複数の第2のプラスミドが生成され;
(c)前記複数の第2のプラスミドが前記複数の細胞に与えられ;
(d)インビトロ変異導入が前記異なる標的配列において生じる;または
前記第1のプラスミドが、前記異なる標的配列のヌクレオチド配列を1つ以上含む;または
複数のプラスミドをさらに含み、各プラスミドが、前記異なる標的配列のヌクレオチド配列を1つ以上含む、
請求項1に記載の方法。 - 第2の標的配列に対して相補的である第2のcrRNAを含む第2のRNPをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 単離リボヌクレオチド粒子(RNP)とオリゴヌクレオチドとプラスミドと遺伝子を編集するための酵素活性を有する細胞抽出物とを含む、標的配列のためのインビトロ変異導入キットであって、
前記RNPは、前記標的配列に対して相補的であるcrRNAおよびCasエンドヌクレアーゼを含み、
前記プラスミドは、前記標的配列のヌクレオチド配列を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して相補的であるが前記標的配列に関する少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドをその中に含む、ヌクレオチド配列を含む、
キット。 - 前記Casエンドヌクレアーゼは、Cas9、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Cpf1、Cpf2、CasY、およびCasXからなる群より選択される;または
前記Casエンドヌクレアーゼは、spCas9またはsaCas9である;
請求項13に記載のキット。 - 第2の標的配列に対して相補的な第2のcrRNAを含む第2のRNPをさらに含む、請求項13に記載のキット。
- 前記RNPがtracrRNAをさらに含む、
請求項13に記載のキット。 - 前記tracrRNAおよび前記crRNAを単一のRNAコンストラクトが含む、
請求項16に記載のキット。 - 各オリゴヌクレオチドは、独立的に、25~200塩基長である;または
各オリゴヌクレオチドは、独立的に、72塩基長である;
請求項13に記載のキット。 - 各オリゴヌクレオチドは、独立的に、化学修飾された末端連結をさらに含む、請求項13に記載のキット。
- 前記細胞抽出物は、全細胞抽出物、無細胞抽出物、核抽出物、および細胞質抽出物からなる群より選択される;または
前記細胞抽出物は、真核細胞抽出物である;
請求項13に記載のキット。 - 前記真核細胞抽出物は、哺乳動物細胞抽出物であるか、またはS.cerevisiaeに由来する、請求項20に記載のキット。
- 前記哺乳動物細胞抽出物は、HEK、HUH-7、DLD1、およびHCT116からなる群より選択される少なくとも1種の細胞に由来する、請求項21に記載のキット。
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