CN113652449B - 基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种基于Cre‑Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用。具体地,基于Cre‑Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体包括部分GDF11基因序列和两个Loxp位点;其中,两个Loxp位点分别位于GDF11基因中第二外显子的上下游,接着通过CRISPR/Cas9的技术方案获得floxp小鼠,通过floxp小鼠与CaMKIIα‑Cre小鼠杂交后获得了兴奋性神经元GDF11基因特异性敲除的小鼠,简称GDF11cKO小鼠,通过衰老相关的β半乳糖苷酶染色,基于实验结果首次发现兴奋性神经元的GDF11特异性敲除后,促进脑组织的特定脑区颞叶和梨状皮层加速衰老,为研究抗衰老提供了有利的工具。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域,尤其涉及一种基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用。
背景技术
细胞衰老(Cellular Senescence)是细胞发生不可逆的细胞周期停滞、大分子损伤、形成分泌型表型和代谢失调的现象,涉及不同的生理和年龄相关疾病的多种特征。细胞衰老研究大多聚焦于高增殖的细胞,由于细胞增殖引起端粒缩短,进而引起细胞复制性衰老。近期以来,以终末分化细胞神经元为主的脑和视网膜等器官的衰老研究表明,终末分化细胞也可发生细胞衰老,其衰老机制与高增殖细胞不同,其具体机制才刚刚揭示冰山一角。同时,对于脑衰老的研究,尚缺乏通过敲除非端粒酶相关基因的脑早衰的小鼠模型。
发明内容
有鉴于此,本公开的目的在于提出一种基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用。
基于上述目的,第一方面,本公开提供了基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体,所述打靶载体包括部分GDF11基因序列和两个Loxp位点;其中,两个Loxp位点分别位于GDF11基因中第二外显子的上下游。
进一步地,所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列。
第二方面,本公开还提供了基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的试剂盒,所述试剂盒包括:
Cas9 mRNA;
打靶载体,所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列;以及
gRNA,所述gRNA的作用位点的DNA序列为ggggtgaaggtatcagttagTGG。
进一步地,所述试剂盒还包括如下引物:
GDF11-floxp-F:5-TGAAGGTATCAGTTACACTCGCTAT-3;
GDF11-floxp-R:5-TGAGCACTTCTCTTGACATCTAGAC-3;
GDF11-wt-F:5-GGGTGAAGGTATCAGTTAGTGGG-3;
GDF11-wt-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3;
loxp1-F:5-CAGGTGCAGCAAAGAGCATTAG-3;
loxp2-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
第三方面,本公开还提供了基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的方法,所述构建方法包括如下步骤:
构建条件性敲除GDF11基因的打靶载体;所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列;
通过CRISPR/Cas9技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠;
采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型,简称GDF11cKO小鼠。
进一步地,GDF11cKO小鼠的鉴定引物包括:
loxp1-F:5-CAGGTGCAGCAAAGAGCATTAG-3;
loxp2-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
进一步地,所述通过CRISPR/Cas9技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠的步骤,具体包括:
将Cas9 mRNA、gRNA和打靶载体注射到小鼠受精卵中;
移植受精卵到***鼠体内并产出F0代;
筛选得到条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠;其中,所述gRNA的作用位点的DNA序列为ggggtgaaggtatcagttagTGG。
进一步地,条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠的鉴定引物包括:
GDF11-floxp-F:5-TGAAGGTATCAGTTACACTCGCTAT-3;
GDF11-floxp-R:5-TGAGCACTTCTCTTGACATCTAGAC-3;
GDF11-wt-F:5-GGGTGAAGGTATCAGTTAGTGGG-3;
GDF11-wt-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
进一步地,所述采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型的步骤,具体包括:
将杂合子floxp小鼠与CaMKⅡα-Cre工具鼠杂交获得CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠;
基于CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠,得到特异性敲除GDF11基因的小鼠模型(GDF11cKO小鼠),即CaMKⅡα-Cre/GDF11f/f基因鼠。
第四方面,本公开还提供了前述任一所述的构建方法得到的小鼠模型在筛查治疗或预防脑组织衰老的药物中的应用。
从上面所述可以看出,本公开提供的基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用,先通过CRISPR/Cas9的方案构建了包括两个loxp位点且两个loxp位点分别位于GDF11基因中的exon2上下游的floxp小鼠,通过floxp小鼠与CaMKIIα-Cre小鼠杂交后获得了兴奋性神经元GDF11特异性敲除的小鼠,简称GDF11cKO小鼠,通过衰老相关的β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色,基于实验结果首次发现兴奋性神经元的GDF11特异性敲除后,促进脑组织的特定脑区颞叶和梨状皮层加速衰老,为研究抗衰老提供了有利的工具。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案,下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开实施例构建的小鼠GDF11基因敲除的打靶载体的部分结构示意图;
图2为本公开实施例构建GDF11基因敲除小鼠模型的原理设计图;
图3A为公开实施例构建的打靶载体中Loxp1测序结果,其中,黑色区域为loxp1的位点;
图3B为公开实施例构建的打靶载体中Loxp2测序结果,其中,黑色区域为loxp2的位点;
图4为本公开实施例中F0代小鼠基因型鉴定策略示意图;
图5A和图5B为本公开实施例中采用不同引物对F0代小鼠基因型鉴定的结果示意图;
图6为本公开实施例中构建GDF11cKO小鼠的原理示意图;
图7为本公开实施例对GDF11cKO小鼠基因型鉴定的结果示意图;
图8A为本公开实施例对纯合子floxp小鼠和GDF11cKO小鼠进行衰老相关的β半乳糖苷酶检测的显微图片;图8B为对应的阳性细胞的比例;
图9为本公开实施例提供的GDF11cKO小鼠脑早衰的具体脑区分布示意图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本公开进一步详细说明。
需要说明的是,除非另外定义,本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
生长分化因子11(Growth differentiation factor 11,简称GDF11),又称骨形成蛋白11(Bone morphogenetic protein 11,BMP11)。GDF11是转化生长因子β-超家族(TGFβ)的新成员之一,参与调控多种器官的胚胎发育过程,在早期胚胎发育过程中起着至关重要的作用。通过异种联体共生手术,使得年轻和年老小鼠的血管融合,从而共用同一个血液循环***,既往研究工作结果发现,老年小鼠因衰老导致的肌肉萎缩、心肌肥厚和神经功能衰退等老龄化特征均可以因年轻的血液而得到好转,甚至达到年轻的水平。研究者进而通过蛋白质筛选技术发现GDF11在上述逆转衰老的过程中起着关键作用。但是,进一步的研究表明,体外重组rGDF11抑制了老年小鼠的干细胞增殖、抑制了肌肉再生,对老年鼠的心肌肥大无改善作用,得到相反的实验结果。所以,GDF11在再生和延缓衰老的功能方面仍存在着很大的争议。
为了探索内源性的GDF11是否在***后神经元的衰老中发挥作用,本公开通过CRISPR/Cas9的方案构建了GDF11f/f小鼠,通过GDF11f/f与CaMKIIα-Cre小鼠杂交后获得了兴奋性神经元GDF11特异性敲除的小鼠,简称GDF11cKO小鼠,以用于研究GDF11基因在特定脑组织衰老中的作用,同时也可以作为脑组织衰老小鼠模型应用于筛查治疗或预防脑组织衰老的药物。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除
GDF11基因的floxp小鼠
目的基因名称:GDF11;详细信息如下GDF11 NM_010272,CDS:34..1251,Chr10.ENSMUSG00000025352。
一、根据基因组序列设计打靶载体。
请参阅图1和图2,小鼠GDF11转录本共有3个外显子。打靶载体自上游到下游依次包括5’同源臂、Loxp1、Exon 2、Loxp2和3’同源臂。
也就是说,Loxp 1***第二外显子(Exon 2)的上游,Loxp 2***第二外显子(Exon2)的下游。
其中,如图3A所示,Loxp1的***位置如下所示:CTAGGAGAAATGTTATAGGGGATAGTATAGATCAGcgttcgggaattcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgtcggtgcAAGGCCTAACAGACTCATCATCCTAGTGA(SEQ ID NO.1)。
其中,如图3B所示,Loxp2的***位置如下所示:CTGGATTTGGGGTGAAGGTATCAGTTAcactcgctATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATactagtcgttcGGGAGATCCGTGGGAACACAAAG(Seq SEQ ID NO.2)。
其中,所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列。
可选地,打靶载体为线性载体。可选地,打靶载体可以通过PCR、酶切的方式获得。
二、Cas9 mRNA和sg RNA的体外转录
Cas9 mRNA购自生物技术公司。可选地,Cas9 mRNA可以通过对Cas9核酸酶进行体外转录获得,这里不再赘述。
向导RNA(guide RNA,简写gRNA)可以通过构建载体,体外转录获得。具体地,gRNA的作用位点的DNA序列为:ggggtgaaggtatcagttagTGG(Seq SEQ ID NO.4)。
三、通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠
将Cas9 mRNA、gRNA和打靶载体注射到C57BL/6小鼠受精卵中;移植受精卵到***鼠体内并产出F0代,通过同源重组在GDF11基因第二外显子上下游引入两个loxp位点。
四、F0代小鼠基因型的鉴定
1、小鼠基因组DNA制备
取鼠龄为3-4周的2~3mm小鼠尾巴末端组织,放置于灭菌的1.5mL EP管中,加入150μl小鼠基因组DNA粗提A液,100℃于金属浴中加热30分钟后加入150μl小鼠基因组DNA粗提B液,颠倒混匀,充分涡旋震荡,快速离心取上清液,-20℃保存。
表1 DNA粗提A液和B液配方
需要说明的是,这里的小鼠基因组DNA的制备方法也可以用于其他小鼠的鉴定,例如F1代小鼠,不限于F0代小鼠。
2、F0代小鼠基因型鉴定
PCR引物对包括GDF11-floxp-F,GDF11-floxp-R和GDF11-wt-F,GDF11-wt-R。
表2 PCR鉴定体系和反应条件
根据表2的PCR鉴定体系和反应条件,若野生型小鼠,PCR产物是单条带,长度是167bp;若纯合子小鼠,则PCR产物是单条带,长度是349bp;若杂合子小鼠,则PCR产物是双条带,长度是349bp和167bp。
其中,GDF11-floxp-F:5-TGAAGGTATCAGTTACACTCGCTAT-3(Seq SEQ ID NO.5);
GDF11-floxp-R:5-TGAGCACTTCTCTTGACATCTAGAC-3(Seq SEQ ID NO.6);
GDF11-wt-F:5-GGGTGAAGGTATCAGTTAGTGGG-3(Seq SEQ ID NO.7);
GDF11-wt-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3(Seq SEQ ID NO.8)。
请参阅图4,PCR引物对loxp1-F和loxp2-R,用于鉴定在GDF11的exon2两端是否各***了loxp,PCR产物的长度是1197bp(loxp1-exon2-loxp2)。
具体地,各引物序列如下:
loxp1-F:5-CAGGTGCAGCAAAGAGCATTAG-3(Seq SEQ ID NO.9);
loxp2-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3(Seq SEQ ID NO.10)。
示例性的,图5A示出了采用GDF11-floxp-F,GDF11-floxp-R和GDF11-wt-F,GDF11-wt-R引物对的鉴定结果,其中24、31、63、65、66号小鼠为杂合子;图5B示出了采用loxp1-F和loxp2-R引物对的鉴定结果,表明24、31号小鼠GDF11基因的exon2两端各***了一个loxp,即条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠。
实施例2构建特异性敲除GDF11基因的小鼠脑早衰模型(GDF11cKO小鼠)
采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型。
其中,CaMKⅡα-Cre工具鼠的鉴定引物包括:CaMKIIα-Cre-F:5-TGCCCAAGAAGAAGAGGAA-3(Seq SEQ ID NO.11);
CaMKIIα-Cre-R:5-TTGCAGGTACAGGAGGTAGTC-3(Seq SEQ ID NO.12)。若携带Cre对应的PCR产物的长度是250bp;野生型对应的PCR产物的长度是0bp。
如图6所示,将杂合子floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠杂交,获得CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠;
CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠和纯合子floxp(或杂合子floxp)小鼠杂交后得到敲除GDF11基因的小鼠模型;当然,雌雄CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠交配也可以获得敲除GDF11基因的小鼠模型。
需要说明的是,将实施例1得到的杂合子floxp小鼠与野生型小鼠交配,可以实现杂合子floxp小鼠(GDF11f/+)的扩繁。
需要说明的是,杂合子floxp小鼠间交配,可以得到纯合子floxp小鼠,简称GDF11f /f。
需要说明的是,CaMKIIα-Cre工具鼠只在特异性表达CaMKIIα蛋白的兴奋性神经元中表达Cre酶,因此在脑组织中只有兴奋性神经元特异性表达Cre酶。
需要说明的是,这里敲除GDF11基因的小鼠模型仅在兴奋性神经元中特异性敲除GDF11基因。
本领域技术人员能够理解的,GDF11基因在多种器官组织中分布广泛,因此可以利用实施例1制备的条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和其他品系Cre工具鼠,获得某特异组织或特异细胞类型GDF11敲除的基因鼠,例如hGFAP-Cre小鼠或者Nestin-Cre小鼠杂交后可以获得全脑敲除GDF11的基因鼠。
实施例3敲除GDF11基因的小鼠模型的鉴定
小鼠基因组DNA制备:取小鼠大脑皮层提取基因组,以基因组为模板进行PCR。
其中,PCR引物采用loxp1-F和loxp2-R。野生型小鼠的PCR为1090bp;GDF11f/f小鼠的PCR产物是1197bp,当floxp位点被Cre酶切割后,PCR产物为312bp。
PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,结果如图7所示。根据图7的结果可知,GDF11cKO小鼠的GDF11在基因组水平被编辑剪切,GDF11在基因组水平被敲除。
实施例4 GDF11cKO小鼠的脑组织衰老检测
采用Senescenceβ-Galactosidase Staining Kit(Beyotime)来检测衰老相关的β-半乳糖苷酶的活性,实验步骤按照试剂盒的说明书操作。只有当细胞衰老时,X-Gal作为底物在pH 6.0时可以被衰老相关的β-半乳糖苷酶催化生成蓝色的产物。因此可以根据是否生成蓝色产物判断细胞是否衰老,然后用Olympus BX53显微镜在相同的参数下拍摄照片,并统计SA-β-GAL阳性细胞的比例,其结果如图8A和图8B所示。
图8A中左侧为纯合子floxp小鼠,右侧为GDF11cKO小鼠,从图中可以明显看出,GDF11cKO小鼠出现了脑组织早衰表型。图8B的阳性细胞比例进一步证实了该结果。根据图8A结果,绘制出现脑早衰表型的脑区分布示意图如图9所示,其中颞叶和梨状皮层加速衰老,为研究抗衰老提供了有利的工具。
基于此,本公开实施例提供的GDF11cKO小鼠可以用于治疗或预防脑组织衰老的药物的筛查。
在一些实施例中,本公开提供了基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体,所述打靶载体包括部分GDF11基因序列和两个Loxp位点;其中,两个Loxp位点分别位于GDF11基因中第二外显子的上下游。
在一些实施例中,所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列。其中,SEQID NO.3的序列如下所示,其中,具有下划线的大写字母对应Loxp位点,具有下划线的斜体小写字母对应exon2。
在一些实施例中,本公开还提供了基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的试剂盒,所述试剂盒包括:
Cas9 mRNA;
打靶载体,所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列;以及
gRNA,所述gRNA的作用位点的DNA序列为ggggtgaaggtatcagttagTGG。
在一些实施例中,所述试剂盒还包括如下引物:
GDF11-floxp-F:5-TGAAGGTATCAGTTACACTCGCTAT-3;
GDF11-floxp-R:5-TGAGCACTTCTCTTGACATCTAGAC-3;
GDF11-wt-F:5-GGGTGAAGGTATCAGTTAGTGGG-3;
GDF11-wt-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3;
loxp1-F:5-CAGGTGCAGCAAAGAGCATTAG-3;
loxp2-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
在一些实施例中,本公开还提供了基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的方法,所述构建方法包括如下步骤:
构建条件性敲除GDF11基因的打靶载体;所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列;
通过CRISPR/Cas9技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠;
采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型。
在一些实施例中,敲除GDF11基因的小鼠模型的鉴定引物包括:
loxp1-F:5-CAGGTGCAGCAAAGAGCATTAG-3;
loxp2-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
在一些实施例中,所述通过CRISPR/Cas9技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠的步骤,具体包括:
将Cas9 mRNA、gRNA和打靶载体注射到小鼠受精卵中;
移植受精卵到***鼠体内并产出F0代;
筛选得到条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠;其中,所述gRNA的作用位点的DNA序列为ggggtgaaggtatcagttagTGG。
在一些实施例中,条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠的鉴定引物包括:
GDF11-floxp-F:5-TGAAGGTATCAGTTACACTCGCTAT-3;
GDF11-floxp-R:5-TGAGCACTTCTCTTGACATCTAGAC-3;
GDF11-wt-F:5-GGGTGAAGGTATCAGTTAGTGGG-3;
GDF11-wt-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
在一些实施例中,所述采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型的步骤,具体包括:
将杂合子floxp小鼠与CaMKⅡα-Cre工具鼠杂交获得CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠;
基于CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠,得到特异性敲除GDF11基因的小鼠模型。
在一些实施例中,本公开还提供了前述任一所述的构建方法得到的小鼠模型在筛查治疗或预防脑组织衰老的药物中的应用。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本公开的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,步骤可以以任意顺序实现,并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此,凡在本公开实施例的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰小鼠模型的打靶载体、试剂盒、方法及应用
<130> FI210555
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaggagaaa tgttataggg gatagtatag atcagcgttc gggaattcat aacttcgtat 60
aatgtatgct atacgaagtt atgtcggtgc aaggcctaac agactcatca tcctagtga 119
<210> 2
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggatttgg ggtgaaggta tcagttacac tcgctataac ttcgtataat gtatgctata 60
cgaagttata ctagtcgttc gggagatccg tgggaacaca aag 103
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<211> 4087
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggcagcagta gaggaaccct tgtccgaagg aagcagactt aagaaggata tcccatgacc 60
ctgtctcagc cttaagtggg atgtttagtt tataaaatga acatttattg ggaaactatt 120
attatttttc atgttattta atgcacagaa ttatttgtat gtccctcaga agtatagtgg 180
ctaaggttaa gtaccaggca acaacccagg cacatggtta aacctttcat tgttgccaga 240
agagtctggg aagaacctgc cattcaacat gtattcactg cttgacatga tgggagccac 300
agagaaacta caatggtgat aaaatattct caggacatca accctcacag agatgagtat 360
ctaatgacaa aaaaacagat aattcagctg gacctggtgg taccagcatg taatcccgac 420
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ggggttcttg cctagcaggt gtgaggccca aggtttgctc cccagtaaca cgcacatgag 600
tatgtgcata cacgcgctca cacgcacagc tgtgctgcaa tcagatgcag tgtgcatcta 660
ggcttactgt cacatcctaa tctctgcatt tccattcctc atccgtattc taccttacat 720
gagtaagtgt cagaacactg ggatcttgga tgctgcggga ggacatggtg tgtcctgttc 780
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gacctggact tcaccattac ttacacggct ctggaacaac ctcattccag attcttccta 960
tctagagaat gaacaattta gggcatctct aacccactta aagaggtcag gaaaagctgg 1020
gcatagtggt acatgctgta atctcaacac ctgggaagat gagacaggag aactgctatg 1080
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agctatctta gcagagggat cctttgtgct aggagaaatg ttatagggga tagtatagat 1800
cagcgttcgg gaattcataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat gtcggtgcaa 1860
ggcctaacag actcatcatc ctagtgatga gacaatttta ggtaccagag acataatagc 1920
caacaataca ggcacagaag ggtaaagagg aattggaaag caggctgaga agaatctgct 1980
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ccttctctct tatcagcgga ccctgcagtg cagacagatg gcagccctct ctgctgtcat 2100
ttccacttca gccccaaggt gatgttcacc aaggtactga aggcccaact gtgggtgtac 2160
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actggggaag ggaccgcagg gggagggggt ggaggccggc gtcacatccg tatccgttca 2280
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ctacacagct ggtttcgcca gccacagagc aactggggaa tcgagatcaa cgcctttgat 2400
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agggggcctg aagtggtggt ggaggatatg tataacctgt ccccaagaga tgggagttag 2520
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ggggtgaagg tatcagttac actcgctata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta 2700
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accttgttcc ctgaccaagc agtgtgcaat acaacagagg gaggcaggtg gggatggagg 3720
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gagaaggttt ggcaagaaga cagatgtagg gacagaggaa gaagatggat ggatagagac 3840
aagaggacag acagaacact gagaaagcaa aggaacagag aggcaaaaag attagagact 3900
aagcagacaa gtagagagat tgaaatggga gtaagcagag agccctgccc caagcctgtt 3960
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaaggtatc agttacactc gctat 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgagcacttc tcttgacatc tagac 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggtgaaggt atcagttagt ggg 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctctcatgt cgctcaggtt g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caggtgcagc aaagagcatt ag 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctctcatgt cgctcaggtt g 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgcccaagaa gaagaggaa 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttgcaggtac aggaggtagt c 21
Claims (6)
1.基于Cre-Loxp条件性敲除基因建立脑早衰的小鼠模型在筛查治疗或者预防脑组织衰老的药物中的应用,其中,建立脑早衰的小鼠模型的方法包括如下步骤:
构建条件性敲除GDF11基因的打靶载体;所述打靶载体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列;
通过CRISPR/Cas9技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠;
采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的应用,其中,敲除GDF11基因的小鼠模型的鉴定引物包括:
loxp1-F: 5-CAGGTGCAGCAAAGAGCATTAG-3;
loxp2-R: 5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
3.根据权利要求1所述的应用,其中,所述通过CRISPR/Cas9技术,利用所述打靶载体构建条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠的步骤,具体包括:
将Cas9 mRNA、gRNA和打靶载体注射到小鼠受精卵中;
移植受精卵到***鼠体内并产出F0代;
筛选得到条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠;其中,所述gRNA的作用位点的DNA序列为ggggtgaaggtatcagttagTGG。
4.根据权利要求3所述的应用,其中,条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠的鉴定引物包括:
GDF11-floxp-F:5-TGAAGGTATCAGTTACACTCGCTAT-3;
GDF11-floxp-R:5-TGAGCACTTCTCTTGACATCTAGAC-3;
GDF11-wt-F:5-GGGTGAAGGTATCAGTTAGTGGG-3;
GDF11-wt-R:5-GCTCTCATGTCGCTCAGGTTG-3。
5.根据权利要求1所述的应用,其中,所述采用条件性敲除GDF11基因的floxp小鼠和CaMKⅡα-Cre工具鼠,构建特异性敲除GDF11基因的小鼠模型的步骤,具体包括:
将杂合子floxp小鼠与CaMKⅡα-Cre工具鼠杂交获得CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠;
基于CaMKⅡα-Cre/GDF11f/+基因鼠,得到特异性敲除GDF11基因的小鼠模型。
6.根据权利要求1所述的应用,其中,所述脑组织衰老包括颞叶和梨状皮层衰老。
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Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Alexandra C McPherron.Redundancy of myostatin and growth/differentiation factor 11 function.BMC Developmental Biology.2009,第9卷(第24期),图2、图2注释. * |
Yingbo He.ALK5-dependent TGF-b signaling is a major determinant of late-stage adult neurogenesis.nature neuroscience.2014,第17卷(第7期),第944页右栏第1段. * |
赵素洁 ; 吴晓琰 ; 陆怡 ; 徐白雪 ; 张鹏 ; 雷克成 ; .siRNA介导的GDF11沉默对人脐静脉内皮细胞衰老的影响.老年医学与保健.2017,(第02期),全文. * |
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