CN108633877A - 一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，包括人间充质干细胞外泌体以及冻干剂，该人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备的方法，所制备的外泌体冻干粉既能在室温条件下长期储存，又能很好保持外泌体的活性；冻干前和冻干后外泌体的活性不存在显著性差异；而且该人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，制备过程简单，便于进行保存和运输。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备的方法。
背景技术
外泌体是由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成，并主动分泌至胞外的大小均一，分子直径为40～100nm的亚细胞双层膜囊泡，其内含有与细胞来源相关的蛋白质、miRNA及mRNA等物质。外泌体既可以通过质膜受体直接激活受体细胞，也可以转运蛋白质、miRNA及mRNA甚至细胞器进入受体细胞内，同时也可以携带处于不同病例状态下的细胞所含有的特异性物质，从而在生理学和病理学上都发挥着重要的作用。外泌体的应用主要集中在临床诊断、抗肿瘤和美容抗衰方面。
间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSC）是具有自我更新和多向分化能力的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要作用。许多的研究表明MSCs外泌体在治疗组织损伤性疾病中具有重要的作用。人脐带组织中含有丰富的间充质干细胞，所获得的人脐带间充质干细胞(UC MSCs)可以在体外条件下稳定培养，细胞活性强，分泌旺盛，其细胞培养上清液中含有大量的外泌体。同时，所分泌的外泌体来源单一稳定。
目前所用的提取外泌体的方法主要包括超高速离心法，免疫磁珠法，液相色谱法，密度梯度离心法等。超高速离心机由于造价昂贵，普及率低并且耗时较长，免疫磁珠法和液相色谱法同样存在效率低，难以广泛普及的问题。基于外泌体的大小，我们利用旋转超滤技术能够快速地、大批量地从人脐带间充质干细胞细胞的培养上清液中分离出大量的外泌体。由于所提纯的外泌体悬液需要冷冻保存(-20℃到-80℃)，这使其在储存和运输以及应用方面带来了许多不便。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术提取外泌体的方法存在的不足。
为此，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，包括人间充质干细胞外泌体以及冻干剂。
所述冻干剂的成份包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、氯化钙。
所述冻干剂的各成份浓度比为氯化钠0.7%-1.1%，葡萄糖0.1%-5%，甘露醇5%-20%，右旋糖酐0.1%-2%，海藻糖0.2%-3%，乳酸钠0.2%-0.4%，氯化钾0.01%-0.05%，氯化钙0.01%-0.04%。
一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
（1）人脐带间充质干细胞的培养；
（2）进行外泌体的提取；
（3）制备人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉。
所述（1）人脐带间充质干细胞的培养，具体操作是：取生长良好的人脐带间充质干细胞，用α-MEM 培养基培养，待其生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS洗三遍，0.25％胰酶消化传代，继续传代培养，每次收集培养上清液，并更换新鲜的培养基，连续培养过程中收集培养上清液。
所述（2）进行外泌体的提取，具体操作步骤是：
a、取细胞培养上清液在300g～400g离心10min~20min，收集上清液，弃沉淀；
b、将步骤a收集的上清液取在2000g～3000g离心20min～30min，继续收集上清液，弃沉淀；
c、将步骤b收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；
d、在Stirred Cell 8050型超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30~60nm，超滤完毕后，加入PBS并再次超滤，重复3次。
e、PBS洗涤滤膜上的外泌体，制得浓缩培养液，用BCA试剂盒测蛋白浓度，并进行冷藏保存。
所述（3）人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，具体操作是：取制得的人脐带间充质干细胞外泌体，加入成份包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、氯化钙的冻干剂，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温冷冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，冷冻干燥结束后，得到外泌体冻干粉，室温，阴凉通风处储存。
本发明的有益效果：本发明提供的这种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备的方法，所制备的外泌体冻干粉既能在室温条件下长期储存，又能很好保持外泌体的活性；冻干前和冻干后外泌体的活性不存在显著性差异；而且该人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，制备过程简单，便于进行保存和运输。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1a为人脐带间充质干细胞收集培养上清的细胞放大40 倍状态图。
图1b为人脐带间充质干细胞收集培养上清的细胞放大100倍状态图。
图2人脐带间充质干细胞的表面标志物的流式检测图。
图3a为制备的人脐带间充质干细胞外泌体的形态图。
图3b添加冻干保护剂冻干后的人脐带间充质干细胞外泌体的形态图。
图4a为人脐带间充质干细胞提取的外泌体在冻干前后对人成纤维细胞生长促进作用的比较结果示意图。
图4b为人脐带间充质干细胞提取的外泌体在冻干前后对人成纤维细胞生长促进作用的比较结果条形图。
图5为人脐带间充质干细胞提取的外泌体在冻干前后对人成纤维细胞抗氧化效果比较的结果条形图。
图6a为人脐带间充质干细胞提取的外泌体在冻干前后对人成纤维细胞活性氧清除能力比较的示意图。
图6b为人脐带间充质干细胞提取的外泌体在冻干前后对人成纤维细胞活性氧清除能力比较的条形图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
为了克服现有技术提取外泌体的方法存在的不足；本发明提供一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，包括人间充质干细胞外泌体以及冻干剂。
上述冻干剂的成份包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、氯化钙。
进一步，冻干剂各成份的浓度可以为：冻干剂的各成份浓度比为氯化钠0.7%-1.1%，葡萄糖0.1%-5%，甘露醇5%-20%，右旋糖酐0.1%-2%，海藻糖0.2%-3%，乳酸钠0.2%-0.4%，氯化钾0.01%-0.05%，氯化钙0.01%-0.04%。
实施例2
一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
一、人脐带间充质干细胞的培养；
取生长良好的人脐带间充质干细胞，用α-MEM培养基培养，待其生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS洗三遍，0.25％胰酶消化传代，继续传代培养，每次收集培养上清液，并更换新鲜的培养基，连续培养过程中收集培养上清液。其中，用于收集培养上清的细胞状态如图1所示；细胞的表面标志物检测如图2所示。
二、进行外泌体的提取；
a、取细胞培养上清液在300g～400g离心10min~20min，收集上清液，弃沉淀；
b、将步骤a收集的上清液取在2000g～3000g离心20min～30min，继续收集上清液，弃沉淀；
c、将步骤b收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；
d、在Stirred Cell 8050型超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30~60nm，超滤完毕后，加入PBS并再次超滤，重复3次。
e、PBS洗涤滤膜上的外泌体，制得浓缩培养液，用BCA试剂盒测蛋白浓度，并进行冷藏保存。
三、制备人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉；
取制得的人脐带间充质干细胞外泌体，加入成份包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、氯化钙的冻干剂，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温冷冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，冷冻干燥结束后，得到外泌体冻干粉，室温，阴凉通风处储存。
实施例3
除了上述实施例的外泌体提取方法外，所述人脐带间充质干细胞外泌体的提取方法为在4℃下，人脐带间充质干细胞培养上清在300g～10000g的离心力下离心去除培养上清中的细胞及细胞碎片，收集上清，利用旋转超滤仪得到培养基中的外泌体。
实施例4
外泌体的形态检测：
第一组即为a为实施例2制备得到的人脐带间充质干细胞外泌体在冻干前的液体状态；第二组即为b为冻干后的外泌体状态，如图3所示。
实施例5
外泌体对人成纤维细胞增殖的影响：
对于冻干前超低温保存和冻干后室温保存的已知浓度的外泌体，分别取0.1、1、10ug/ml的浓度与人成纤维细胞共培养72h后检测其对人成纤维细胞增殖的影响，对照组即不添加外泌体的培养基培养，结果如图4所示；
从图4结果可以看出，实施例2制备的人脐带间充质干细胞外泌体在冻干前和复溶后对细胞的增殖均有促进作用，且效果没有显著性差异。
实施例6
外泌体抗氧化功效的检测：
对于冻干前超低温保存和冻干后室温保存的已知浓度的外泌体，分别取1、10、20ug/ml的浓度与人成纤维细胞共培养72h后检测细胞内Mn-SOD的相对表达量，对照组即不添加外泌体的培养基培养，结果如图5所示；
从图5结果可以看出，实施例2制备的人脐带间充质干细胞外泌体在冻干前和复溶后的抗氧化功效没有显著性差异。
实施例7
外泌体对活性氧的清除能力检测：
对于冻干前超低温保存和冻干后室温保存的已知浓度的外泌体，分别取1、10、20ug/ml的浓度与人成纤维细胞共培养72h后，利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧的检测，验证外泌体对胞内活性氧清除能力的影响，对照组即不添加外泌体的培养基培养，结果如图6所示；
从图6结果可见，实施例2制备的人脐带间充质干细胞外泌体在冻干后对活性氧清除能力有轻微下降，但在冻干前和复溶后的活性氧清除能力抗氧化能力不存在显著性差异。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，其特征在于：包括人间充质干细胞外泌体以及冻干剂。
2.如权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，其特征在于：所述冻干剂的成份包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、氯化钙。
3.如权利要求1或2所述的一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，其特征在于：所述冻干剂的各成份浓度比为氯化钠0.7%-1.1%，葡萄糖0.1%-5%，甘露醇5%-20%，右旋糖酐0.1%-2%，海藻糖0.2%-3%，乳酸钠0.2%-0.4%，氯化钾0.01%-0.05%，氯化钙0.01%-0.04%。
4.一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）人脐带间充质干细胞的培养；
（2）进行外泌体的提取；
（3）制备人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉。
5.如权利要求4所述一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述（1）人脐带间充质干细胞的培养，具体操作是：取生长良好的人脐带间充质干细胞，用α-MEM培养基培养，待其生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS洗三遍，0.25％胰酶消化传代，继续传代培养，每次收集培养上清液，并更换新鲜的培养基，连续培养过程中收集培养上清液。
6.如权利要求4所述一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述（2）进行外泌体的提取，具体操作步骤是：
a、取细胞培养上清液在300g～400g离心10min~20min，收集上清液，弃沉淀；
b、将步骤a收集的上清液在2000g～3000g离心20min～30min，继续收集上清液，弃沉淀；
c、将步骤b收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；
d、在Stirred Cell 8050型超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30~60nm，超滤完毕后，加入PBS并再次超滤，重复3次；
e、PBS洗涤滤膜上的外泌体，制得浓缩培养液，用BCA试剂盒测蛋白浓度，并进行冷藏保存。
7.如权利要求4所述一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，所述（3）人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉，具体操作是：取制得的人脐带间充质干细胞外泌体，加入成份包括氯化钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、氯化钙的冻干剂，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温冷冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，冷冻干燥结束后，得到外泌体冻干粉，室温，阴凉通风处储存。
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