CN112544613B

CN112544613B - 一种多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法

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Publication number: CN112544613B
Application number: CN202011563991.6A
Authority: CN
Inventors: 魏君; 蔡萌; 曹培; 周佳; 候梦莹
Original assignee: Wuhan Iregene Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Iregene Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112544613A

Abstract

本发明公开了一种多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法，涉及生物技术领域。本发明的冻存液包括无机盐，维生素，化学小分子抑制剂，细胞因子和DMSO等成份，冻存液成分明确，不含血清或动物源性成分。本发明的干细胞冻存液，大大提高了细胞冻存活力，冻存流程简便，而且细胞经受长期冻存后复苏，细胞各项特征稳定。因此，本发明冻存液大大拓展了人源多能干细胞的临床应用。

Description

一种多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法。

【背景技术】

再生医学是指利用多种新型技术学科来重建老化或功能损失的组织和器官，并通过多种医学手段来进行相关疾病治疗的新兴科学。再生医学的重要研究方向为正常组织特征与功能的机理，创伤后修复的生物学基础，以及组织器官的再生机制及多种干细胞分化机理，从而最终获得有效的生物治疗方法。其研究方法综合了多种手段，包括生命科学、材料科学，临床医学等学科的原理和方法，综合解决用于替代、修复、重建或再生人体各种组织器官的临床解决方案。在再生医学的发展过程中，有多个核心问题需要解决。理想的再生医学产品，尤其是细胞治疗产品，应该具备以下几个特征：第一，细胞来源必须是单一可无限增殖细胞类型；第二，细胞必须易于进一步的改造，例如使用基因编辑等工具对致病基因进行修正；第三，最终获得的产品性质均一。如何获得可用于细胞治疗的最初细胞来源，是再生医学领域早期的重要研究课题。其中，胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞)是早期再生医学研究中最受人瞩目的细胞类型。胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。但是这一细胞的获得和使用均具有较大的伦理争议，因为进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式。这一伦理争议大大阻碍了再生医学的推进和应用。

2006年，山中伸弥的团队发明了一种由OCT4,SOX2,KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluri potent cells)(Takahashi K,et al.，Cell，2006，126(4)pp.663-676；Takahashi K and Yamanaka S，Cell，2007，131(5)pp.861-872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层，中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一发明突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。使用包括胚胎干细胞及iPSC在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行外胚层细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了外胚层细胞在临床医学上的应用潜力。仅在再生医学领域，诱导多能干细胞在即将进入临床阶段的应用已经涉及的领域包括神经退行性疾病，脊髓损伤，I型糖尿病，肿瘤等方向。

以诱导多能干细胞为代表的多能干细胞，作为再生医学的核心技术平台，是当前全球干细胞研究的热点。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。为了能够将多能细胞长期保存，应用和长距离运输，应该使用有效的细胞冻存液及冻存方法，并且保持细胞反复复苏后特性不变。冷冻保存可以帮助在任何时候都及时使用细胞，同时降低微生物污染的风险，降低与其他细胞系交叉污染的风险。因此，多能干细胞的冻存方法的研究显得尤为重要。细胞和组织的“玻璃化冻存”(vitrification cryopreservation)，可以让细胞及其保护剂溶液以足够快的速率降温，从而让生物材料转化为完全玻璃化状态，并以这种状态实现低温下的长期保存。由于在这一过程中细胞内外避免了结冰，从而避免了细胞损伤。实现“玻璃化”的关键是细胞冻存剂，细胞冻存剂可以减少细胞或者组织在冻存过程中冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。常用的细胞冻存剂包括二甲基亚砜(DMSO)，乙二醇(EG)和丙二醇(PG)(Almansoori KA et.al.,Cryobiology.2012Jun；64(3):185-91)。目前，人多能干细胞一般采用DMSO作为冻存剂，DMSO为低分子化合物,相对分子质量小，溶解度大，渗透性强，可使冰点下降，提高胞膜对水的通透性，在降温过程中减少胞内形成冰晶的机会，减少冰晶对细胞的损伤，从而对细胞达到保护作用。高浓度的DMSO有细胞毒性，可以与细胞内蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，造成细胞损伤或者失活；而且在造血干细胞临床经验中，DMSO的残留会引起一定的副作用(ZambelliA et.al.,Anticancer Res 1998；18(6B):4705-4708)。10％DMSO是一种对细胞安全的使用浓度，因此，目前人类多能干细胞一般采用90％(胎)牛血清加10％DMSO作为冻存液来进行细胞冻存(Hanna J and HubelA,Organogenesis,01Jul2009,5(3):134-137)。虽然很多科学家通过多种含有血清成分的培养基来降低血清成分的浓度，但是这种通过大量动物血清来保护干细胞活性的方法并不适于再生医学产品的开发，血清成份会携带多种动物源性成分或者病毒，会引起严重的感染和并发症。

因此，如何开发一种无血清，化学成分明确，且能够保证多能干细胞活力的冻存试剂，是拓展多能干细胞的临床使用及应用前景的重要工具。

【发明内容】

本发明要解决的问题是提供一种多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法，本发明所述冻存液可以保证多能干细胞活力的前提下，化学成分明确，避免了血清传播动物源性病原体的风险，确保超低温冻存的安全性。

鉴于此，实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种多能干细胞冻存液，包括基本培养基和添加剂，所述添加剂包括Optiferrin，DMSO以及Y-276322HCl。

在具体的实施方案中，所述添加剂包括0.5-10μmol/L Optiferrin，2.5-10v/v％DMSO以及10nmol/L-10μmol/L Y-276322HCl。其中，所述DMSO优选为5-10v/v％。

在具体的实施方案中，所述添加剂还包括无机盐、氨基酸及细胞因子。

在具体的实施方案中，所述维生素包括1.2μmol/L维生素B12，64mg/L维生素C。

在具体的实施方案中，所述无机盐包括0.5g/L氯化钠，13.6μg/L***钠。

在具体的实施方案中，所述生长因子包括22μg/ml IGF，50ng/mL植物源重组人碱性生长因子，1.74ng/ml转化生长因子TGF-b。

在具体的实施方案中，本发明所述多能干细胞冻存液中所述添加剂还包括6.3ng/ml***，23μg/ml腐胺。

在具体的实施方案中，所述基本培养基为DMEM培养基。

本发明的另一个目的在于，提供上述的冻存液在冻存人源多能干细胞中的应用。

本发明的还有一个目的在于，提供一种人源多能干细胞的冻存方法，包括如下步骤：将扩增和传代后的多能干细胞悬液离心，去上清，然后将以上所述的诱导多能干细胞冻存液混合，分装，冻存。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明提供一种不使用动物源性成分，化学成分明晰的细胞冻存液，与商品化冻存液相比，不仅大大提高细胞复苏后细胞活力，而且经过长时间冻存后细胞功能完备。

2.本发明配置简便，使用方便，大大拓展了多能干细胞的临床应用前景。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是使用本发明iRePlur-F冻存液后人源多能干细胞复苏后的细胞形态图。

图2是本发明不同浓度的Optiferrin的冻存液对细胞活力的影响示意图。

图3是本发明不同浓度Y-27632盐酸盐的冻存液对人源多能干细胞复苏后凋亡率的影响示意图。

图4为本发明不同浓度DMSO的iRePlur-F细胞冻存液和对照组CELLBANKER冻存液冻存的人源多能干细胞复苏后凋亡率的检测结果示意图。

图5为本发明iRePlur-F细胞冻存液和CELLBANKER冻存液对人源多能干细胞冻存之后复苏凋亡率的检测结果示意图。

图6为人源多能干细胞复苏鉴定细胞多能性鉴定结果示意图。

【具体实施方式】

本发明提供一种多能干细胞液冻存液，包括基本培养基和添加剂，所述添加剂包括0.5-10μmol/L Optiferrin，2.5-10v/v％DMSO以及10nmol/L-10μmol/L Y-276322HCl。

根据本发明的一个实施例，所述DMSO优选为5-10v/v％。

本发明提供的多能干细胞冻存液，根据需要，所述添加剂还包括维生素、无机盐及细胞因子。

根据本发明的一个实施例，所述维生素包括1.2μmol/L维生素B12，64mg/L维生素C。根据本领域常识，所述维生素还可以选择其他常用的维生素，如维生素B6、维生素B2等。

根据本发明的一个实施例，所述无机盐包括0.5g/L氯化钠，13.6ug/L***钠。根据本领域常识，还可以选择其他常用的无机盐。

根据本发明的一个实施例，所述细胞因子包括22ug/ml IGF，植物源重组人碱性生长因子，50ng/mL，转化生长因子1.74ng/ml。根据本领域常识，还可以选择其他常用的细胞因子。

根据本发明的一个实施例，本发明提供的冻存液中还包括6.3ng/ml***，23ug/ml腐胺。

根据本发明的一个实施例，所述基本培养基为DMEM培养基。

以下实例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1人源多能干细胞液冻存液iRePlur-F的配制

按照如下配方配置iRePlur-F细胞冻存液，以下简称iRePlur-F：

杜氏改良伊格尔培养基(DMEM培养基)，维生素B12(1.2μmol/L)，维生素C(L-ascorbic acid，64mg/L)，***(Progesterone，6.3ng/ml)，腐胺(Putrescine，23ug/ml)，氯化钠(Sodium Chloride，0.5g/L)，***钠(13.6ug/L)，IGF(22ug/ml)，Optiferrin(0.5-10μmol/L)，植物源重组人碱性生长因子(OsrbFGF，50ng/mL)，TGF-b(1.74ng/ml)，2.5％-10％DMSO，Y-276322HCl(10nmol/L-10μmol/L)。

其中，对照试验使用

DMSO Free GMP grade(ZENOAQ)冻存液，以下简称CELLBANKER。

实施例2人源多能干细胞的冻存

人多能干细胞包括胚性多能干细胞，如H9细胞系和人诱导多能干细胞。其中人诱导多能干细胞按照“重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法”(ZL201910050800.7)进行从CD34+细胞重编程获得。

人多能干细胞使用Matrigel(STEMCELL Technologies)包被T25细胞培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育一个小时以上。按照1×10⁶/瓶的细胞数接种于T25培养瓶中进行扩增和传代。使用商品化TeSRTM-e8(STEMCELL Tech nologies)培养基培养，于37℃、5％的CO₂中进行培养。当细胞生长达到70％的覆盖率时，使用0.05％trypsin/EDTA，在37℃孵育5min进行消化，消化后的细胞离心洗涤后按照1×10⁶/毫升的密度重悬于iRePlur-F细胞冻存液中，然后将细胞放入程序降温冻存盒中，并置于-80℃冰箱24小时，之后转入液氮长期保存。对照试验采取同一批细胞进行，细胞使用CELLBANKER冻存。

实施例3人源多能干细胞的复苏

4.1DMSO浓度对人源多能干细胞复苏后细胞活力的影响

人多能干细胞使用Matrigel(STEMCELL Technologies)包被T25细胞培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育一个小时以上。将使用本发明iRePlur-F冻存液和对照组CELLBANKER冻存液冻存的细胞在37℃水浴快速解冻，解冻后细胞用DMEM培养基洗涤去除DMSO，消化后的细胞离心洗涤后按照1×10⁶/10毫升的密度接种于T25细胞培养板，于37℃、5％的CO₂细胞培养箱中进行培养。复苏后的多功能干细胞形态如图1所示。其中，图1a、图1b、图1c分别显示iRePlur-F细胞冻存液(10％DMSO)冻存的人源多能干细胞复苏后第1天、第2的天、第4天的细胞形态图；图1d、图1e、图1f分别显示iRePlur-F细胞冻存液(7.5％DMSO)冻存的人源多能干细胞复苏后第1天、第2的天、第4天的细胞形态图；图1g、图1h、图1i分别显示iRePlur-F细胞冻存液(5％DMSO)冻存的人源多能干细胞复苏后第1天、第2的天、第4天的细胞形态图；图1j、图1k、图1l分别显示iRePlur-F细胞冻存液(2.5％DMSO)冻存的人源多能干细胞复苏后第1天、第2的天、第4天的细胞形态图；图1m、1n、1o分别显示对照组CELLBANKER冻存液冻存的人源多能干细胞复苏后第1天、第2的天、第4天的细胞形态图。不难看出相对于对照组CELLBANKER冻存液冻存的细胞，iRePlur-F冻存液在DMSO浓度升高时，冻存后的细胞均表现更好的细胞形态。

1)用不同浓度Optiferrin的iRePlur-F冻存液冻存细胞，按照上述方法复苏后，使用Cyquant试验来进行细胞活力定量检测，从而比较不同浓度的Optiferrin的冻存液在此过程中对细胞活力的影响。包被96孔不透光细胞培养板，包被完成后将细胞按照5×10⁴每孔的细胞数量分别接种，并设置三组平行重复(三组的平均值作为数据进行计算)。在复苏24小时后取样，细胞活力检测使用CyQuant Kit(Invitrogen，X12223)进行，按照使用说明书操作，使用SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate Reader(VWR，型号ID3-STD)进行数据读取。结果如图2所示，其中，图2a-2b分别表示复苏24小时后细胞的形态，图2e显示代表细胞数量的Cyquant试验结果。不难看出，细胞复苏后的活力与Optiferrin浓度呈正相关。另外，根据图2d的细胞形态可以看出，在Optiferrin浓度为10μmol/L时，细胞复苏已经具备较佳的活力，同时基于成本的考虑Optiferrin浓度为0.5-10μmol/L比较适宜。

2)用不同浓度Y-276322HCl的iRePlur-F冻存液冻存细胞，并按照上述方法用Cyquant试验进行细胞活力定量检测。结果如图3所示，细胞复苏后的活力与Y-276322HCl浓度呈正相关。其中，图3a-3b分别表示复苏24小时后细胞的形态，图3e显示代表细胞数量的Cyquant试验结果。

实施例4人源多能干细胞复苏后活力检测

4.1不同冻存液之间短期复苏的活力差异

将在液氮罐中保存一个星期的细胞按照实施例3的步骤进行复苏，并于复苏后第1天收集上清液，第3天收集人源多能干细胞培养液和细胞。细胞的活率的检测通过乳酸脱氢酶(LDH)实验进行(碧云天)。通过检测培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)释放的浓度与贴壁细胞总的LDH浓度，计算细胞凋亡率的公式为：上清液LDH浓度/(上清液LDH浓度+贴壁细胞LDH浓度)×100％。检测结果如图4所示。结果表明，iRePlur-F复苏后的细胞凋亡率显著低于对照组，iRePlur-F中DMSO浓度最佳范围为5％-10％，在此范围内，细胞复苏后的凋亡率小于10％。

4.2不同冻存冻存液之间长期冻存的活力比较

参照实施例3及实施例4.1，依次在冻存后1周、2周、4周、8周、12周后进行细胞复苏，并收集样本并进行复苏后细胞活率检测。检测结果如图5所示。结果表明，使用iRePlur-F的人源多能细胞在不同时间段(1w、2w、4w、8w、12w)复苏后的细胞凋亡率差异不显著，且对细胞活率的影响较小；同时，iRePlur-F系列比对照组产生的细胞凋亡率要小。

实施例5人源多能干细胞复苏鉴定细胞多能性

将制备的诱导多能干细胞进行内胚层(Endoderm)分化：在解剖显微镜下将重编程板中的克隆用枪头撮动后吸出，放置于48孔板中，每孔中放置一个克隆，使用商品化TeSRTM-e8(STEMCELL Technologies)培养基，于37℃、5％的CO₂中进行培养。当诱导多能干细胞达到70％的覆盖率时，用0.05％trypsin/EDTA在37℃条件下处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后，按照1×10⁵每孔的比例重新接种于24孔板中，置于37℃、5％的CO₂环境中培养48小时。然后使用以下培养基进行Endoderm分化：在DMEM/F12基础培养基中添加1％N-2supplement(Invitrogen),2％B-27supplement(Invitrogen),no n-essentialamino acids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，Activin为10μg/ml(Nat Biotechnol,2005,23(12):1534-1541)。分化培养条件为：37℃、5％的CO₂中。培养4天后进行鉴定。

将制备的诱导多能干细胞进行中胚层(Mesoderm)分化：当诱导多能干细胞达到70％的覆盖率时，用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DM EM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照1×10⁵每孔的比例重新接种于24孔板中，置于37℃、5％的CO₂环境中培养48小时。使用以下培养基进行Mesoder m分化：在RPMI基础培养基中添加1xB-27supplement(Invitrogen),CHIR99021为5μg/ml(Lian et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2012.)。分化培养条件为：37℃、5％的CO₂中。培养4天后进行鉴定。

将制备的诱导多能干细胞进行外胚层(Ectoderm)分化：当诱导多能干细胞达到70％的覆盖率时，用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照5×10⁵每孔的比例重新接种于24孔板中，置于37℃、5％的CO₂环境中培养48小时。使用以下培养基进行Endoderm分化：在DMEM/F12基础培养基中添加1％N-2supplement(Invitrogen)，2％B-27supplement(Invitrogen),non-essential aminoacids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，10μmol/L SB431542和100nmol/L LDN。分化培养条件为：37℃、5％的CO₂中。进行培养21天，每天换液一次，之后进行鉴定。

采用免疫荧光实验鉴定人源多能干细胞复苏后的标志物鉴定，以及分化实验得到的不同胚层的标志物鉴定。采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用0.1％Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2h，用DPBS缓冲液清洗三遍后，拍照。抗体使用细节如表1所示。鉴定结果如图6所示，结果说明本发明使用的人源多能干细胞冻存液冻存细胞后，不改变多能干细胞的多能性，细胞仍然具有分化为三种不同胚层的能力。

表1：不同胚层荧光免疫鉴定使用的抗体

需要说明的是，上述实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，并不以任何形式限制本发明，凡根据本发明的技术方案等同替换或改变获得的技术方案，均涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种人源多能干细胞冻存液，其特征在于，包括基本培养基和添加剂，所述添加剂包括0.5-10μmol/LOptiferrin，5-10v/v％DMSO以及10nmol/L-10μmol/L Y-27632 2HCl。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述添加剂还包括无机盐、维生素、细胞因子。

3.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述维生素包括1.2μmol/L维生素B12，64mg/L维生素C。

4.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述无机盐包括0.5g/L氯化钠，13.6μg/L***钠。

5.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述细胞因子包括22μg/ml IGF，植物源重组人碱性生长因子，50ng/mL，转化生长因子TGF-b 1.74ng/ml。

6.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，还包括6.3ng/ml***，23μg/ml腐胺。

7.权利要求1所述的冻存液在冻存人源多能干细胞中的应用。

8.一种人源多能干细胞的冻存方法，包括如下步骤：将扩增和传代后的人源多能干细胞悬液离心，去上清，然后与权利要求1～6任意一项所述的人源多能干细胞冻存液混合，分装，冻存。