CN108103021B - 一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用，本发明的细胞制备方法包括使用人源诱导多能干细胞进行无滋养细胞的单层细胞无血清培养，同时使用小分子抑制剂进行诱导细胞定向分化为神经干细胞。本发明证明这种方法诱导得到的神经干细胞具有分化为神经元的能力，且具有电生理功能。本发明使用纯化学分子替代蛋白质信号拮抗物，使用非动物源性的生长因子来替换传统的动物源性的生长因子，从而实现了无血清无动物源性的神经干细胞诱导培养方法，解决了动物源性培养方法制约神经干细胞在临床上的使用问题；同时无需使用滋养层细胞，因而得到的细胞不受其它细胞的污染，解决了长久以来滋养细胞污染的问题，在临床上更安全。

Description

一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用。
背景技术
神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴、神经核团毁损术或脑深部电刺激手术等治疗方法，但均不能达到很好的疗效，并且会带来“异动症”或“药效波动”等严重影响生活质量的不良反应。
神经退行性疾病的治疗难点在于中枢神经***的神经细胞具有不可再生性，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。目前药物研发仍然处于基础探索阶段。目前，神经干细胞的移植是最为有效的一种治疗方式，欧洲及美国均有使用异体神经干细胞进行异体移植的先例，但是因为异体移植存在的排异反应，且异体神经干细胞由于伦理限制以及获得技术困难难以大量成功扩增。然而，2012年诺贝尔奖获奖技术“诱导多能干细胞”(iPSCs)诱导的自体神经干细胞移植为这些疾病的治疗带来了治愈希望。
iPSC技术能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(iPSCs)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成组成人体的多种成体细胞。利用这一技术获得的患者特异性的iPSC，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。iPSC来源的神经干细胞具有更为广阔的临床前景。神经干细胞(NSCs)是一种成体干细胞，具有自我更新和分化为终端神经细胞的能力，例如神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。目前，神经干细胞的异体移植已经在临床上取得了长足的效果，但是异体神经干细胞由于伦理限制以及获得技术不便，进一步加大了以上疾病的治愈难度，因此利用人源化多能干细胞诱导制备神经干细胞成为解决这一医疗难题的关键。
目前将多能干细胞诱导制备神经干细胞最为广泛的诱导方法有两种。第一种方法分为两步，首先细胞聚合成团形成拟胚体(embryonic bodies)，然后细胞进一步被诱导成为神经干细胞；这种方法的缺点在于细胞分化不同步，且神经干细胞的纯度不高；此外，此方法使用的动物源性的生长因子也制约了神经干细胞在临床上的使用。第二种为SMAD途径双重抑制法(Dual SMAD inhibition)(Chambers et al.,2009)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经细胞(Fasano et al.,2010)，其原理是通过抑制BMP和TGFB途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生；该方法不使用滋养细胞，但是仍然需要使用动物源性的细胞因子或者蛋白质信号途径拮抗物，不能用于临床使用。
为了达到更加安全有效的临床效果，急需开发一种安全、高效的神经干细胞诱导方法，能够推进临床试验的展开。
发明内容
针对目前现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用。该方法使用人源诱导多能干细胞进行无滋养细胞的单层细胞无血清培养，同时使用小分子抑制剂进行诱导细胞定向分化为神经干细胞，且分化的神经干细胞具有自我更新、分化为神经元细胞的功能和电生理功能。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法，该方法具体包括如下步骤：
S1、人多能干细胞传代培养；
S2、移出S1的培养基并更换为无血清神经诱导培养基，然后在无血清神经诱导培养基中利用人多能干细胞定向诱导培养神经干细胞；
S3、在神经干细胞扩增培养基中扩增培养S2中获得的神经干细胞。
进一步地，S1的具体方法为：
(1)使用1μg/mL的层粘蛋白Laminin包被T25培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时；
(2)人诱导多能干细胞在TeSRTM-e8培养基中培养，使用0.05％trypsin/EDTA，在37度孵育5分钟进行消化；
(3)将步骤(2)中消化完成后的人诱导多能干细胞重悬于TeSRTM-e8培养基中，按照2x106每板的细胞数量接种于事前备好的LamininT25培养瓶中培养12小时。
进一步地，所述S2中神经诱导培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和神经诱导化合物，所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059在神经诱导培养基培养液中的终浓度为8μM，JW55在神经诱导培养基培养液中的终浓度为5μM。
进一步地，所述S2中神经干细胞诱导培养条件为37℃，5％二氧化碳。
进一步地，S2中神经干细胞定向诱导培养时每两天更换新的无血清神经诱导培养基，培养18-21天。
进一步地，S2中人多能干细胞定向诱导培养成神经干细胞完成后，将神经干细胞移出并用DPBS进行洗涤，然后用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化，最后细胞洗涤离心后按照1:6的比例重新接种于T25培养瓶中待扩增培养。
进一步地，S3中神经干细胞扩增培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和生长因子，所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，所述植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF在培养液中的终浓度为10-25ng/ml。
进一步地，所述S3中神经干细胞扩增培养条件为37℃，5％二氧化碳。
本发明的另一个目的是提供了一种采用上述的制备方法制备的一种新型人源诱导型神经干细胞。
本发明最后提供了上述的新型人源诱导型神经干细胞的应用，所述新型人源诱导型神经干细胞应用于制备治疗神经退行性疾病的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的新型人源诱导型神经干细胞的制备方法，使用纯化学分子替代蛋白质信号拮抗物，使用非动物源性的生长因子来替换传统的动物源性的生长因子，从而实现了无血清无动物源性的神经干细胞诱导培养方法，解决了动物源性培养方法制约神经干细胞在临床上的使用问题。
(2)本发明提供的新型人源诱导型神经干细胞的制备方法，无需使用滋养层细胞，因而得到的细胞不受其它细胞的污染，解决了长久以来滋养细胞污染的问题，在临床上更安全。
(3)本发明提供的新型人源诱导型神经干细胞具有各项完备的生物学功能，能够表达干细胞的转录因子Sox2，且可以分化成皮质神经元细胞和星状角质神经元，不仅能够用于神经***疾病的药物筛选，同时也能作为临床研究和临床治疗的材料。
附图说明
图1为不同源性重组FGF对细胞增殖的影响曲线。
图2为本发明的人源诱导型神经干细胞诱导产生皮质神经元和星状胶质神经元的结果图。
其中图2a为人源诱导型神经干细胞诱导第1天，图2b为人源诱导型神经干细胞诱导第21天，图2c显示神经干细胞诱导形成皮质神经元，图2d显示神经干细胞诱导形成星状胶质神经元。
图3为从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中SOX1、SOX2、NESTIN、PAX6、OCT3/4、NANOG的表达水平变化示意图。
图4为免疫荧光实验鉴定的从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中蛋白标记的结果图。
其中图4a表示诱导前诱导多能干细胞表达Oct4；图4b表示诱导神经干细胞表达Pax6及Sox2；图4c表示诱导神经干细胞表达Tuji和PSD95；图4d表示诱导神经干细胞分化末期表达Tuji和VGlut1。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明提供的一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法具体包括3个步骤：
S1、人多能干细胞传代培养，具体操作为：首先使用1μg/mL的层粘蛋白Laminin包被T25培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时；人诱导多能干细胞在TeSRTM-e8培养基中培养，使用0.05％trypsin/EDTA，在37度孵育5分钟进行消化；将消化完成后的人诱导多能干细胞重悬于TeSRTM-e8培养基中，按照2x106每板的细胞数量接种于事前备好的LamininT25培养瓶中培养12小时。
S2、移出S1的TeSRTM-e8培养基并更换为无血清神经诱导培养基，然后在无血清神经诱导培养基中利用人多能干细胞定向诱导培养神经干细胞，每两天更换新的无血清神经诱导培养基，培养18-21天；神经干细胞诱导培养条件为37℃，5％二氧化碳；神经诱导培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和神经诱导化合物，神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059在神经诱导培养基培养液中的终浓度为8μM，JW55在神经诱导培养基培养液中的终浓度为5μM。
S3、在神经干细胞扩增培养基中扩增培养S2中获得的神经干细胞
S2中人多能干细胞定向诱导培养成神经干细胞完成后，移出S2的无血清神经诱导培养基，之后用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理S2中获得的神经干细胞5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照1:6的比例重新接种于T25培养瓶中，使用神经干细胞扩增培养基进行神经干细胞扩增培养；细胞扩增培养条件为37℃，5％二氧化碳；神经干细胞扩增培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和生长因子，所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，所述植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF在培养液中的终浓度为10-25ng/ml。
此制备方法创新性的使用纯化学因子诱导及植物来源的生长因子相结合的方法，模拟胚胎发育早期神经产生的信号途径，无滋养细胞共同培养，也没有动物血清的培养，并且化学成分明确，解决了动物源性培养方法和滋养细胞污染的问题，大大拓展了神经干细胞在临床上的使用。
基于上述的制备方法，本发明提供了一种新型人源诱导型神经干细胞，该神经干细胞能够诱导为皮质神经元、星状胶质神经元，同时也能能够表达干细胞的转录因子Sox2，因此，这种人源诱导型神经干细胞可以应用于制备治疗神经退行性疾病的药物。
实施例1：人源诱导型神经干细胞的制备
1.人多能干细胞传代培养
(1)使用1μg/mL的层粘蛋白Laminin包被T25培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时；
(2)人诱导多能干细胞在TeSRTM-e8培养基中培养，使用0.05％trypsin/EDTA，在37度孵育5分钟进行消化；
(3)消化完成后使用DMEM终止消化，并离心洗涤，重悬于TeSRTM-e8培养基中，按照2x106每板的细胞数量接种于事前备好的LamininT25培养瓶中培养12小时。
2.人源诱导型神经干细胞的诱导培养
移出步骤1中的TeSRTM-e8培养基并更换为无血清神经诱导培养基，然后在无血清神经诱导培养基中利用人多能干细胞定向诱导培养神经干细胞，每两天更换新的无血清神经诱导培养基，培养18-21天，培养约18天后可以观察到均匀分布的神经干细胞花环状结构产生；神经干细胞诱导培养条件为37℃，5％二氧化碳；神经诱导培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和神经诱导化合物，N2B27基本配方为：DMEM-F12/Neurobasal 1:1,，N2supplement(1:100)，B27 supplement(1:50)，Glutamine(1:100)(Life Technologies)；神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059在神经诱导培养基培养液中的终浓度为8μM，JW55在神经诱导培养基培养液中的终浓度为5μM。
3.人源诱导型神经干细胞的扩增培养
细胞用神经诱导培养基培养21天后，移除神经诱导培养基用DPBS进行洗涤，之后用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照1:6的比例重新接种于T25培养瓶中，使用神经干细胞扩增培养基进行神经干细胞扩增。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。神经干细胞扩增培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和生长因子，N2B27基本配方为：DMEM-F12/Neurobasal 1:1,，N2 supplement(1:100)，B27supplement(1:50)，Glutamine(1:100)(Life Technologies)；生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，所述植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF在培养液中的终浓度为10-25ng/ml。
实施例2：不同源性重组FGF对细胞增殖的影响
取实施例1中经第2步诱导培养的神经干细胞，按照5×104每孔的细胞数量进行接种，并设置三组平行重复(三组的平均值作为数据进行计算)，使用两种神经干细胞扩增培养基分别扩增培养，其中第一种培养基包括N2B27基础培养基和植物来源的人碱性生长因子OsrbFGF，第二种包括N2B27基础培养基和含有动物源性的人碱性生长因子。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。分别在24小时，48小时及72小时取样，细胞增殖使用CyQuant kit(Invitrogen)进行，数据读取使用SpectraMax i3Multi-Mode Microplate Reader，细胞增殖情况如图1所示。
图中曲线1表示诱导的神经干细胞在含植物来源的人碱性生长因子OsrbFGFCyquant的培养基中的扩增情况，曲线2表示诱导的神经干细胞在含动物源性的人碱性生长因子的培养基中的扩增情况，Cyquant试验表明植物源性生长因子与动物源性生长因子在促进细胞增殖上无显著差异，使用植物源性生长因子也能促进诱导的人源诱导型神经干细胞增殖。
实施例3：神经干细胞体外诱导为皮质神经元和星状胶质神经元实验
本发明提供了一种新型人源诱导型神经干细胞，该神经干细胞能够诱导为皮质神经元、星状胶质神经元。
1.神经干细胞体外诱导为皮质神经元
将4x104个诱导神经干细胞接种于D型多聚赖氨酸包被的24孔板中，使用不含有化学诱导小分子的神经分化培养基进行培养，培养期间每隔两天换液一次。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。持续培养14天，皮质神经元开始形成。分化培养基的配方及用量为N2B27基本配方为：DMEM-F12/Neurobasal 1:1，N2 supplement(1:100)，B27 supplement(1:50)，Glutamine(Life Technologies)(1:100)。
2.神经干细胞体外诱导为星状胶质神经元
将1x105个诱导神经干细胞接种于D型多聚赖氨酸包被的24孔板中，使用含有10ng/ml BMP4蛋白的星状胶质神经元分化培养基进行培养，培养期间每隔两天换液一次。持续培养21天，星状胶质神经元形成。星状胶质神经元分化培养基的配方及用量为N2B27基本配方参照于(Ying et al.,2003)：DMEM-F12/Neurobasal 1:1,N2 supplement(1:100),B27 supplement(1:50)，Glutamine(1:100)(Life Technologies)，8ng/ml BMP4。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳。
3.结论
分化结果如图2所示，图2中a为细胞诱导第1天的图，b为细胞诱导第21天的图，c为神经干细胞诱导50天形成皮质神经元，d为神经干细胞诱导3周形成星状胶质神经元，结果表明iNSCs可以维持自我更新并分化成为皮质神经元和星状胶质神经元。
实施例4：Q-PCR检测从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中的转录变化
分别取神经干细胞诱导前的iPSC、诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞，作为两种材料进行分析。通过Q-PCR检测从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中SOX1、SOX2、NESTIN、PAX6、OCT3/4、NANOG的转录变化情况。
两种细胞的总RNA使用RNeasy Mini orMicro Kit(QIAGEN)进行抽提，1mg RNA用SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)合成cDNA。用SYBRPremix Ex Taq(TaKaRa)和Thermal Cycler Dice Real Time System(TaKaRa)来进行Quan-titative PCR的标记和反应，beta-Actin用来作为内参。所有数据用delta-Ctmethod进行分析。用鉴定神经干细胞标志物SOX1、SOX2、NESTIN、PAX6、OCT3/4、NANOG的编码基因的引物序列如表1所示。
表1 SOX1、SOX2、NESTIN、PAX6、OCT3/4、NANOG的引物序列
以神经干细胞诱导前的iPSC标志物的表达量作为1，计算诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞标志物和iPSC标志物的相对表达倍数；以Q-PCR检测结果如图3所示，图3表明，通过本发明的方法利用人源多能干细胞培养的人源诱导神经干细胞，显著上调了细胞的神经干细胞标志物(SOX1、SOX2、NESTIN、PAX6)的表达水平，同时，iPSC标志物的表达量显著下降。
实施例5：免疫荧光实验鉴定从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中的蛋白标记(神经干细胞标志物的免疫荧光染色)
分别取神经干细胞诱导前的iPSC、诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞，作为两种材料进行如下免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用0.1％TritonX-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用DPBS缓冲液清洗三遍后拍照。抗体使用细节如表2所示。
表2神经干细胞标志物的免疫荧光染色使用的抗体
照片见图4，标尺为100μm，图4a表示诱导前诱导多能干细胞表达Oct4；图4b表示诱导神经干细胞表达Pax6及Sox2；；图4c表示诱导神经干细胞表达Tuji和PSD95；图4d表示诱导神经干细胞分化末期表达Tuji和VGlut1。
综合以上结果表明，本发明制备的诱导神经干细胞能够分化为表达神经标记的多种神经细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉睿健医药科技有限公司
<120> 一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggaaagcg ttttcttg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatctgact tctcctccc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcaccgct acgacgtga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaggctggg gtaggtaggt 20

Claims (7)

1.一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：
S1、人诱导多能干细胞传代培养；
S2、移出S1的培养基并更换为无血清神经诱导培养基，然后在无血清神经诱导培养基中利用人诱导多能干细胞定向诱导培养神经干细胞，所述神经诱导培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和神经诱导化合物，所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55，PD98059在神经诱导培养基培养液中的终浓度为8μM，JW55在神经诱导培养基培养液中的终浓度为5μM；
S3、在神经干细胞扩增培养基中扩增培养S2中获得的神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，S1的具体方法为：
(1)使用1μg/mL的层粘蛋白Laminin包被T25培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育至少1小时；
(2)人诱导多能干细胞在TeSRTM-e8培养基中培养，使用0.05％trypsin/EDTA，在37度孵育5分钟进行消化；
(3)将步骤(2)中消化完成后的人诱导多能干细胞重悬于TeSRTM-e8培养基中，按照2x106每板的细胞数量接种于事前备好的LamininT25培养瓶中培养12小时。
3.根据权利要求1所述的一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述S2中神经干细胞诱导培养条件为37℃，5％二氧化碳。
4.根据权利要求1所述的一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，S2中神经干细胞定向诱导培养时每两天更换新的无血清神经诱导培养基，培养18-21天。
5.根据权利要求1所述的一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，S2中人诱导多能干细胞定向诱导培养成神经干细胞完成后，将神经干细胞移出并用DPBS进行洗涤，然后用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化，最后细胞洗涤离心后按照1:6的比例重新接种于T25培养瓶中待扩增培养。
6.根据权利要求1所述的一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，S3中神经干细胞扩增培养基培养液成分包括N2B27基础培养基和生长因子，所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF，所述植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF在培养液中的终浓度为10-25ng/ml。
7.根据权利要求1所述的一种人源诱导型神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述S3中神经干细胞扩增培养条件为37℃，5％二氧化碳。
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