CN109628383B - 重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法，该重编程培养基由DMEM‑F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL‑180μg/mL的L‑抗坏血酸、5.3μmol/L‑74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL‑89ng/mL的***钠、8μmol/L‑23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L‑7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL‑60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL‑12μg/mL的IGF、0.2μmol/L‑0.6μg/mL的A‑83、2μmol/L‑6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L‑450μmol/L的丁酸钠。使用该重编程培养基不仅可以提高临床使用的安全性，还可以提高成体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。

Description

重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法。
背景技术
2006年，山中伸弥的团队发明了一种由OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced plμripotentstem cells，简称“iPSC”)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层，并最终形成多种成体细胞。该方法突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。
目前，国际上多个实验室已经开发出多种重编程方法，根据重编程载体分类，可以大致分为以下四类：
(1)病毒法：其中包括了基因组随即***型病毒载体(e.g.慢病毒)和非基因组***载体(e.g.仙台病毒)，该类方法的缺点在于基因组的随即***所带来的潜在风险，或者冗长的病毒稀释过程带来的不变。
(2)DNA法：其中包括Piggy Bac、Sleeping Beaμty以及Episomal在内的多种质粒类型，这类方法的特征为重编程效率低。
(3)RNA法和蛋白质法：这类方法操作过程复杂，在工业应用实用性较差。
(4)化合物小分子法：这是目前应用越来越广泛的一种重编程方法，但其重编程效率存在较大的个体差异。
然而，目前前3种方法在诱导过程中均使用含有血清成分的重编程培养基，例如在饲养层存在的情况下使用knockout serum或者在无饲养层的情况下使用含有N2或者B27添加剂的培养基，而且这些培养基中都还含有包括转铁蛋白在内的血清蛋白或者其他动物源性成份。由于血清蛋白成分的存在，造成了诱导多能干细胞在临床应用过程中的不便，不利于重编程的工业化诱导及标准化流程的制定。而化合物小分子法仍然需要解决个体差异大的问题，即如何在多种细胞类型实现近似等效的重编程效率仍是再生医学领域的一大难题。
从分化终端的分化细胞重编程到诱导多能干细胞，目前在工业及临床应用最为广泛的重编程培养方法有两种：
(1)滋养诱导法：将成体细胞在有滋养层的情况下重编程得到诱导多能干细胞并进行扩增。这种方法的缺点在于诱导多能干细胞在后续培养过程中均需要滋养细胞加以辅助培养，滋养细胞多为鼠源胚性成纤维细胞，在后续的定向分化及组织工程应用中，目的细胞容易受到滋养细胞的污染，这成为阻碍诱导多能干细胞应用的一大障碍。
(2)无滋养法培养：该方法得到的诱导多能干细胞不需要滋养细胞的辅助，能够在经过大分子基质胶或者层粘蛋白的支持下持续生长。
目前，无滋养层法是诱导多能干细胞的产业主流。但是无滋养层法需要细胞培养基提供复杂的营养成分，特别是血清的替代物，需要多种复合成分经过精准的浓度进行调配，从而达到既能为多能干细胞的生长提供充足的营养，同时又要保证维持多能干细胞的各种性能。
但是，这两种培养方法所使用到的培养体系均使用动物血清成份作为维持细胞活力的重要原料，这使得此类培养基中含大量动植物来源蛋白，添加物质的化学成分也不够明确，会对后续处理应用造成不利影响，例如目标蛋白的分离纯化困难等，同时培养基的成本也较高。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供既不使用血清成分、也不含有血清转铁蛋白的重编程培养基及利用该重编程培养重编程诱导多能干细胞的培养方法，不仅可以提高临床使用的安全性，还可以提高成体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种重编程培养基，所述重编程培养基由DMEM-F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL-180μg/mL的L-抗坏血酸、5.3μmol/L-74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL-89ng/mL的***钠、8μmol/L-23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L-7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL-60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.2μmol/L-0.6μg/mL的A-83、2μmol/L-6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L-450μmol/L的丁酸钠。
在其中一个实施例中，所述添加成分包括70μg/mL-90μg/mL的L-抗坏血酸、40μmol/L-60μmol/L的氢化可的松、10ng/mL-30ng/mL的***钠、8μmol/L-12μmol/L的Optiferrin、3μmol/L-6μmol/L的视黄醇乙酸酯、45ng/mL-55ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.3μmol/L-0.5μg/mL的A-83、3μmol/L-5μmol/L的CHIR99021以及280μmol/L-410μmol/L的丁酸钠。
在其中一个实施例中，所述添加成分包括80μg/mL的L-抗坏血酸、50μmol/L的氢化可的松、20ng/mL的***钠、10μmol/L的Optiferrin、4μmol/L的视黄醇乙酸酯、50ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、10μg/mL的IGF、0.4μg/mL的A-83、4μmol/L的CHIR99021以及400μmol/L的丁酸钠。
一种重编程诱导多能干细胞的培养方法，利用成体细胞采用上述任一项所述的重编程培养基进行重编程培养。
在其中一个实施例中，所述成体细胞为脐带来源人***、人CD34+细胞和/或人皮肤成纤维细胞。
在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法包括如下步骤：
重编程采用Epi5 Reprogramming Kit，将成体细胞重悬于电转化试剂盒中提供的Resuspension Buffer中，电转，得电转后的细胞；
将电转后的细胞打入Matrigel包被培养板的孔内，利用上述任一项所述的重编程培养基置于温度37±0.5℃、5％二氧化碳环境中进行培养，培养过程中，每天半换液至电转后的第十天，从第十天开始每隔一天换液一次，直至第28天。
在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法包括如下步骤：
重编程使用CytoTuneTM-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit，按照2×106细胞、MOI＝5的比例进行病毒转导，病毒加入后，置于温度37±0.5℃、5％二氧化碳环境中孵育12-16h，第二天开始将培养基更换为上述任一项所述的重编程培养基，培养至第28天。
在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法包括如下步骤：
重编程使用SimpliconTMRNA Reprogramming Kit，再利用上述任一项所述的重编程培养基，将细胞培养至第28天。
在其中一个实施例中，所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法还包括使重编程的诱导多能干细胞向神经细胞分化的步骤。
本发明的有益效果是：
本发明的重编程培养基通过向DMEM-F12基础培养基中添加特定种类和配比的添加成分，使用纯化学因子及非动物来源的生长因子相结合的方式，不含血清成分，也不含有血清转铁蛋白，不仅可以克服常规重编程过程中动物来源成分和滋养细胞污染的问题，提高临床使用的安全性，还可以克服常规重编程过程效率低的问题，从而显著提高成体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。
另外，采用该重编程培养基进行诱导多能干细胞的培养方法，经过持续传代，仍可使核型稳定性、细胞多能性及分化能力都维持在较高的水平。
附图说明
图1为成体细胞重编程为诱导多能干细胞的检测图；其中，图a为CD34+细胞诱导第1天(记为origin)的检测图；图b为CD34+细胞重编程形成的iPSC克隆(记为Codonies)的检测图；图c为CD34+细胞重编程形成的iPSC碱性磷酸酶染色(记为AP positive)图；图d为CD34+细胞重编程形成的iPSC克隆OCT3/4免疫荧光鉴定图(记为Oct4/DAPI)；图e为CD34+细胞重编程形成的iPSC克隆核型检测；图f为成纤细胞(HDF)诱导第1天的检测图；图g为HDF细胞重编程形成的iPSC克隆的检测图；图h为HDF细胞重编程形成的iPSC碱性磷酸酶染色图；图i为HDF细胞重编程形成的iPSC克隆OCT3/4免疫荧光鉴定图；图j为HDF细胞重编程形成的iPSC克隆核型检测；图k为***(MSC)诱导第1天的检测图；图l为MSC细胞重编程形成的iPSC克隆的检测图；图m为MSC细胞重编程形成的iPSC碱性磷酸酶染色图；图n为MSC细胞重编程形成的iPSC克隆OCT3/4免疫荧光鉴定图；图o为MSC细胞重编程形成的iPSC克隆核型检测。
图2为实施例2与对比例1的产生诱导多能干细胞克隆的数量差异图；其中，图a为使用传统N2B27+bFGF重编程培养基诱导得到的人源诱导多能干细胞AP染色阳性克隆；图b为使用实施例1的无血清无转铁蛋白重编程培养基，诱导得到的人源诱导多能干细胞AP染色阳性克隆。
图3为实施例3与对比例2的产生诱导多能干细胞克隆的数量差异图；其中，图a为使用传统N2B27+bFGF重编程培养基诱导得到的人源诱导多能干细胞AP染色阳性克隆；图b为使用实施例1的无血清无转铁蛋白重编程培养基诱导得到的人源诱导多能干细胞AP染色阳性克隆。
图4为实施例4与对比例3的产生诱导多能干细胞克隆的数量差异图；其中，图a为使用传统N2B27+bFGF重编程培养基诱导得到的人源诱导多能干细胞AP染色阳性克隆；图b为使用实施例1的无血清无转铁蛋白重编程培养基诱导得到的人源诱导多能干细胞AP染色阳性克隆。
图5为实施例2制备的诱导多能干细胞分别进行Endoderm分化、Mesoderm分化、Ectoderm分化的检测图。
图6为实施例2制备的诱导多能干细胞在分化过程中神经干细胞标志物的表达结果统计图。
图7为利用对比例4中各组培养基进行成体细胞重编程为人诱导多能干细胞后所得的AP染色阳性克隆。
具体实施方式
以下对本发明进行举例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种无血清无转铁蛋白重编程培养基，其由DMEM-F12基础培养基和添加成分组成，添加成分为：80μg/mL的L-抗坏血酸、50μmol/L的氢化可的松、20ng/mL的***钠、10μmol/L的Optiferrin、4μmol/L的视黄醇乙酸酯、50ng/mL的植物源重组人碱性生长因子(OsrbFGF)、10μg/mL的IGF、0.4μg/mL的A-83、4μmol/L的CHIR99021以及400μmol/L的丁酸钠。
实施例2
本实施例提供一种成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，包括如下步骤：
使用Matrigel(STEMCELL Technologies)包被6孔培养板，铺板后置于37℃恒温箱中孵育一个小时以上。
重编程使用Epi5 Reprogramming Kit(具体步骤可参见试剂盒说明书)，使用Neon电转化试剂盒(Thermo Fisher)分别进行多种人成体细胞的操作，操作步骤如下：分别将脐带来源人***、人CD34+细胞、人皮肤成纤维细胞人成体细胞经过离心洗涤后，重悬于电转化试剂盒中提供的Resuspension Buffer中，按照以下程序进行电转：PulseVoltage：1650V，PulseWidth：10ms，PulseNumber：3，电转结束，得电转后的细胞。
将电转后的细胞打入到含6mL实施例1的重编程培养基的管内，混匀后均匀，再分别加入6孔培养板内的各孔中，进行细胞培养。细胞培养的条件：温度37℃、5％二氧化碳。此后，每天采用半换液的方式进行换液至电转后第十天，从第十天开始，每隔一天换液一次直至第28天，培养板中出现大量人诱导多能干细胞克隆。
传代培养：每种细胞类型选择6孔板中的一孔，使用Accutase消化液，在37℃孵育5分钟，从而将培养板里的细胞消化为单个细胞，消化后的细胞离心洗涤后分别使用新的培养基重悬，按照1:1比例传代至同等大小培养板，在TeSRTM-e8(STEMCELL Technologies)培养基中进行培养，直至板中出现大小合适的克隆。使用1μg/mL的Matrigel(STEMCELLTechnologies)包被48孔培养板，在解剖显微镜下将重编程板中的克隆用枪头撮动后吸出，放置于48孔板中，每孔中放置一个克隆，使用商品化TeSRTM-e8(STEMCELL Technologies)培养基，于37℃、5％的CO2中进行培养。当细胞生长达到70％的覆盖率时，使用0.05％trypsin/EDTA,在37℃孵育5min进行消化，消化后的细胞离心洗涤后分别使用新的培养基重悬，并加入培养基传代到包被好的T25培养瓶中，于37℃、5％的CO2中进行培养至下次传代。细胞在TeSRTM-e8(STEMCELL Technologies)培养基中培养传代10次后，将细胞进行核型比较。细胞培养至10代左右，对细胞进行分子鉴定，验证在上述重编程培养基中诱导得到的人诱导多能干细胞具备完备的分子标记。分子鉴定通过免疫荧光和Q-PCR结合进行。
采用碱性磷酸酶染色(Cat#SCR004，Millipore)进行诱导多能干细胞克隆的计数及多能性鉴定：吸除培养皿中的细胞培养液，使用PBS清洗后加入4％多聚甲醛固定1～2min，之后TBST清洗3次，加入足量新鲜配制的AP染色工作液(以24孔板为例，每孔加入0.5mL)，室温避光放置15～20min；染色结束后吸走染色液，用PBS清洗2-3次，显微镜下观察染色结果。
将制备的诱导多能干细胞进行内胚层(Endoderm)分化：在解剖显微镜下将重编程板中的克隆用枪头撮动后吸出，放置于48孔板中，每孔中放置一个克隆，使用商品化TeSRTM-e8(STEMCELL Technologies)培养基，于37℃、5％的CO2中进行培养。当诱导多能干细胞达到70％的覆盖率时，用0.05％trypsin/EDTA在37℃条件下处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后，按照1×105每孔的比例重新接种于24孔板中，置于37℃、5％的CO2环境中培养48小时。然后使用以下培养基进行Endoderm分化：在DMEM/F12基础培养基中添加1xN-2 supplement(Invitrogen),1xB-27 supplement(Invitrogen),non-essentialamino acids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，Activin为10μg/ml(配方出自参考文献D'Amour,et al.Nat Biotechnol 23(12):1534-1541(2005))。分化培养条件为：37℃、5％的CO2中。培养4天后进行鉴定。
将制备的诱导多能干细胞进行中胚层(Mesoderm)分化：当诱导多能干细胞达到70％的覆盖率时，用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照1×105每孔的比例重新接种于24孔板中，置于37℃、5％的CO2环境中培养48小时。使用以下培养基进行Mesoderm分化：在RPMI基础培养基中添加1xB-27 supplement(Invitrogen),CHIR99021为5μg/ml(配方出自参考文献Lian et al.,ProcNatlAcadSciUSA,2012.)。分化培养条件为：37℃、5％的CO2中。培养4天后进行鉴定。
将制备的诱导多能干细胞进行外胚层(Ectoderm)分化：当诱导多能干细胞达到70％的覆盖率时，用0.05％trypsin/EDTA在37℃处理5分钟，使用DMEM终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照5×105每孔的比例重新接种于24孔板中，置于37℃、5％的CO2环境中培养48小时。使用以下培养基进行Endoderm分化：在DMEM/F12基础培养基中添加1xN-2supplement(Invitrogen),1xB-27 supplement(Invitrogen),non-essential aminoacids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，10uM SB431542和2uM JW55。分化培养条件为：37℃、5％的CO2中。进行培养21天，每天换液一次，之后进行鉴定。鉴定结果见图5。
采用Q-PCR检测从胚胎干细胞向神经干细胞转变过程中的转录变化。分别取神经干细胞诱导前的诱导多嫩干细胞(iPSC)、诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞(NSC)，作为两种材料进行分析。通过Q-PCR检测从胚胎干细胞向神经干细胞转变过程中SOX1、PAX6、OCT3/4、NANOG的转录变化情况。两种细胞的总RNA使用RNeasyMini or Micro Kit(QIAGEN)进行抽提，1mg RNA用SuperScript III First-StrandSynthesis System(Invitrogen)合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)和ThermalCycler Dice Real Time System(TaKaRa)来进行Quan-titative PCR的标记和反应，beta-Actin用来作为内参。所有数据用delta-Ct method进行分析。用于鉴定神经干细胞标志物SOX1、PAX6、OCT3/4、NANOG的编码基因的引物序列如下表1所示。
表1用于鉴定细胞标志物的编码基因的引物序列表
采用免疫荧光实验鉴定从诱导多能干细胞向神经干细胞转变过程中的蛋白标记(多种不同细胞类型标志物的免疫荧光染色):分别取神经干细胞诱导前的iPSC、诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞，作为两种材料进行如下免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用0.1％Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2h，用DPBS缓冲液清洗三遍后，拍照。抗体使用细节如表2所示。
表2神经干细胞标志物的免疫荧光染色使用的抗体
抗体 购自 稀释倍数
Sox1 Abcam 1:150
NESTIN Abcam 1:500
GATA4 Abcam 1:500
BRACHYURY Abcam 1:250
OCT3/4 Abcam 1:150
以神经干细胞诱导前的iPSC标志物的表达量作为1，计算诱导完成后使用神经干细胞扩增培养基扩增2周后的神经干细胞标志物和iPSC标志物的相对表达倍数。Q-PCR检测结果如图6所示。
染色体核型检测：染色体核型分析流程按照Chromosome Preparation FromCultured Cells(Howe等，2014，DOI:doi:10.3791/50203)进行。利用悬垂法制备人染色体玻片，于70℃烤箱中处理2h。用生理盐水配制含0.01％EDTA、0.05％胰蛋白酶的溶液，调节pH为7.0。水浴至37℃后，将染色体玻片在上述溶液中处理5-20s后，用生理盐水重洗两次。然后将玻片浸入Giemsa溶液中染色5-10分钟直至显色清晰。将玻片冲洗晾干后镜检。
检测结果详见图1、图5以及图6。
由图1可以看出，本重编程培养能够使多种不同成体细胞形成诱导多能干细胞，而且形成的诱导多能干细胞具有正常的核型，表达多能干细胞的标记。
由图5可以看出，该人诱导多能干细胞分化为器官发育需要的三种胚层：(1)分化得到GATA4表达阳性的内胚层细胞；(2)分化得到Brachyury表达阳性的中胚层细胞；(3)分化得到SOX1和NESTIN表达阳性的外胚层细胞。从而证明了采用本实施例的重编程培养方法得到的诱导多能干细胞具有分化为三种不同胚层的能力，从而验证了其完备的分化潜能。
由图6可以看出，本方法利用人诱导多能干细胞培养的人源诱导神经干细胞，显著上调了细胞的神经干细胞标志物(SOX1、PAX6)的表达水平，同时，iPSC标志物(OCT3/4、NANOG)的表达量显著下降。本实施例重编程培养得到的诱导多能干细胞在转录层面表达高水平的多能干细胞标记基因，而且能够成功分化为表达神经标记物的神经前体细胞。
实施例3
本实施例提供一种成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，包括如下步骤：
使用Matrigel(STEMCELL Technologies)包被6孔培养板，铺板后置于37℃恒温箱中孵育一个小时以上。重编程使用CytoTuneTM-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(具体步骤可参见试剂盒说明书)，按照2×106细胞、MOI＝5的比例进行病毒转导，病毒加入后，将细胞置于37℃、5％二氧化碳的环境胡总孵育12-16小时。第二天开始将培养基更换为实施例1的重编程培养基，培养至第28天，培养板中出现大量人诱导多能干细胞克隆。
后续对制备的诱导多能干细胞克隆进行分化、鉴定的步骤与实施例4中分化、鉴定的步骤相同。
实施例4
本实施例提供一种成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，包括如下步骤：
使用Matrigel(STEMCELL Technologies)包被6孔培养板，铺板后置于37℃恒温箱中孵育一个小时以上。按照SimpliconTMRNA Reprogramming Kit(OKSG)(Millipore)说明书进行操作，使用实施例1的重编程培养基培养至第28天，直至培养板中出现大量人诱导多能干细胞克隆。
后续对制备的诱导多能干细胞克隆进行分化、鉴定的步骤与实施例4中分化、鉴定的步骤相同。
对比例1
本对比例提供一种成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，采用Epi5Reprogramming Kit，其操作步骤与实施例4的步骤基本相同，区别在于：本对比例采用的培养基为传统N2B27+bFGF重编程培养基，即在DMEM/F12基础培养基中添加1xN-2 supplement(Invitrogen),1xB-27 supplement(Invitrogen),non-essential amino acids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，bFGF为100ng/ml(配方出自参考文献：Humaninduced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science324(5928):797-801)。
将本对比例得到的人诱导多能干细胞采用碱性磷酸酶染色(Cat#SCR004，Millipore)进行诱导多能干细胞克隆的计数，统计结果见图2a。
由图2可以看出，与传统N2B27+bFGF重编程培养基相比，在使用Epi5Reprogramming Kit情况下，采用实施例1的重编程培养能够得到更多的人源多能干细胞克隆。
对比例2
本对比例提供一种成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，采用CytoTuneTM-iPS 2.0Sendai Reprogramming Kit(Thermo Fisher)，其操作步骤与实施例2的步骤基本相同，区别在于：本对比例采用的培养基也为传统N2B27+bFGF重编程培养基，即在DMEM/F12基础培养基中添加1xN-2supplement(Invitrogen),1xB-27 supplement(Invitrogen),non-essential amino acids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，bFGF为100ng/ml(配方出自参考文献：Human induced pluripotent stem cellsfree of vector and transgene sequences.Science 324(5928):797-801)。
将本对比例得到的人诱导多能干细胞采用碱性磷酸酶染色(Cat#SCR004，Millipore)进行诱导多能干细胞克隆的计数，统计结果见图3。
由图3可以看出，与传统N2B27+bFGF重编程培养基相比，在使用CytoTuneTM-iPS2.0Sendai Reprogramming Kit情况下，采用实施例1的重编程培养能够得到更多的人源多能干细胞克隆。
对比例3
本对比例提供一种成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，采用SimpliconTMRNA Reprogramming Kit(OKSG)(Millipore)，其操作步骤与实施例2的步骤基本相同，区别在于：本对比例采用的培养基也为传统N2B27+bFGF重编程培养基，即在DMEM/F12基础培养基中添加1xN-2supplement(Invitrogen),1xB-27 supplement(Invitrogen),non-essential amino acids为0.1mM，GlutaMAX为1mM，β-mercaptoethanol为0.1mM，bFGF为100ng/ml(配方出自参考文献：Human induced pluripotent stem cells free ofvector and transgene sequences.Science 324(5928):797-801)。
将本对比例得到的人诱导多能干细胞采用碱性磷酸酶染色(Cat#SCR004，Millipore)进行诱导多能干细胞克隆的计数，统计结果见图4。
由图4可以看出，与传统N2B27+bFGF重编程培养基相比，在使用SimpliconTMRNAReprogramming Kit(OKSG)(Millipore)情况下，采用实施例1的重编程培养能够得到更多的人源多能干细胞克隆。
对比例4
本对比例探究重编程培养基中部分组分的浓度对重编程培养的影响，采用与实施例4相同步骤的成体细胞重编程为人诱导多能干细胞的培养方法，具体试验分组如下表3所示:
表3探究重编程培养基中部分组分的浓度对重编程培养的影响的分组表
采用碱性磷酸酶染色法检测对比例1中各组试验中所得诱导多能干细胞细胞克隆的形态，统计结果见图7。由图7可以看出，当培养基中上述成分超出范围后，利用上述成分超出范围的重编程培养基不能顺利维持诱导多能干细胞的稳定性，碱性磷酸酶染色显示细胞出现死亡或者异常克隆形态。
另外，申请人经大量探究，在本发明的重编程培养基中，当L-抗坏血酸为60-180μg/mL、氢化可的松为5.3-74μmol/L、***钠为3-89ng/mL、Optiferrin为8-23μmol/L、视黄醇乙酸酯为0.5-7.4μmol/L、植物源重组人碱性生长因子为40-60ng/mL、IGF为8-12μg/mL、A-83为0.2-0.6μg/mL、CHIR99021为2-6μmol/L、丁酸钠为100-450μmol/L时，整体上能够顺利维持诱导多能干细胞的稳定性。
其中，当L-抗坏血酸为70μg/mL-90μg/mL、L氢化可的松为40μmol/L-60μmol/、***钠为10ng/mL-30ng/mL、Optiferrin为8μmol/L-12μmol/L、视黄醇乙酸酯为3μmol/L-6μmol/L、植物源重组人碱性生长因子为45ng/mL-55ng/mL、IGF为8μg/mL-12μg/mL、A-83为0.3μmol/L-0.5μg/mL、CHIR99021为3μmol/L-5μmol/L以及丁酸钠为280μmol/L-410μmol/L时，重编程制备的诱导多能干细胞的稳定性最好。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉睿健医药科技有限公司
<120> 重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggaaagcg ttttcttg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatctgact tctcctccc 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggagttat gatacctaca cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaatgagtc ctgttgaagt gg 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcttcagga gatatgcaaa gcaga 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgatctgctg cagtgtgggt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acctcagcta caaacaggtg aa 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccctggaga agagctacga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcactgtgt tggcgtacag 20

Claims (8)

1.一种重编程培养基，其特征在于，所述重编程培养基由DMEM-F12基础培养基和添加成分组成，所述添加成分包括60μg/mL-180μg/mL的L-抗坏血酸、5.3μmol/L-74μmol/L的氢化可的松、3ng/mL-89ng/mL的***钠、8μmol/L-23μmol/L的Optiferrin、0.5μmol/L-7.4μmol/L的视黄醇乙酸酯、40ng/mL-60ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.2μmol/L-0.6μg/mL的A-83、2μmol/L-6μmol/L的CHIR99021以及100μmol/L-450μmol/L的丁酸钠。
2.根据权利要求1所述的重编程培养基，其特征在于，所述添加成分包括70μg/mL-90μg/mL的L-抗坏血酸、40μmol/L-60μmol/L的氢化可的松、10ng/mL-30ng/mL的***钠、8μmol/L-12μmol/L的Optiferrin、3μmol/L-6μmol/L的视黄醇乙酸酯、45ng/mL-55ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、8μg/mL-12μg/mL的IGF、0.3μmol/L-0.5μg/mL的A-83、3μmol/L-5μmol/L的CHIR99021以及280μmol/L-410μmol/L的丁酸钠。
3.根据权利要求2所述的重编程培养基，其特征在于，所述添加成分包括80μg/mL的L-抗坏血酸、50μmol/L的氢化可的松、20ng/mL的***钠、10μmol/L的Optiferrin、4μmol/L的视黄醇乙酸酯、50ng/mL的植物源重组人碱性生长因子、10μg/mL的IGF、0.4μg/mL的A-83、4μmol/L的CHIR99021以及400μmol/L的丁酸钠。
4.一种重编程诱导多能干细胞的培养方法，其特征在于，利用成体细胞采用权利要求1至3任一项所述的重编程培养基进行重编程培养。
5.根据权利要求4所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法，其特征在于，所述成体细胞为脐带来源人***、人CD34+细胞或人皮肤成纤维细胞。
6.根据权利要求5所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
重编程采用Epi5 Reprogramming Kit，将成体细胞重悬于电转化试剂盒中提供的Resuspension Buffer中，电转，得电转后的细胞；
将电转后的细胞打入Matrigel包被培养板的孔内，利用权利要求1至3任一项所述的重编程培养基置于温度37±0.5℃、5％二氧化碳环境中进行培养，培养过程中，每天半换液至电转后的第十天，从第十天开始每隔一天换液一次，直至第28天。
7.根据权利要求5所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
重编程使用CytoTuneTM-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit，按照2×106细胞、MOI＝5的比例进行病毒转导，病毒加入后，置于温度37±0.5℃、5％二氧化碳环境中孵育12-16h，第二天开始将培养基更换为权利要求1至3任一项所述的重编程培养基，培养至第28天。
8.根据权利要求5所述的重编程诱导多能干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
重编程使用SimpliconTMRNA Reprogramming Kit，再利用权利要求1至3任一项所述的重编程培养基，将细胞培养至第28天。
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