CN114794088B - 人多能干细胞冻存液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人多能干细胞冻存液，包括基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物，所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR‑99021，ID‑8和Y‑27632，且人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。本发明的人多能干细胞冻存液，通过3种信号通路抑制剂的协同作用，在不含有蛋白质成分的情况下，冻存细胞后复苏，具有较高的复苏后细胞活率。此外，本发明的人多能干细胞冻存液冻存时不需要程序性降温，更加快速简便。本发明的人多能干细胞冻存液质量研究充分，产品性能高，成本低廉，适用于不同培养基。

Description

人多能干细胞冻存液及其应用
技术领域
本发明涉及细胞冻存复苏技术领域。更具体地，涉及人多能干细胞冻存液及其应用。
背景技术
人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）包括胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）、核移植胚胎干细胞（nuclear transfer embryonic stemcell，ntESC）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）等，具有“自我更新”和“三向分化”两大潜能，即人多能干细胞保持“干性”的同时可在体外无限增殖，并具有向三胚层所有类型细胞分化的潜能。通过人多能干细胞定向分化获得的衍生功能细胞可补充或替代病损细胞、组织和器官，是再生医学的核心。开发满足临床应用和工业生产关键质量属性的人多能干细胞冻存方法和试剂迫在眉睫。
首先，人多能干细胞冻存液属于细胞治疗产品的原材料。《中国药典》2020版明确指出，细胞治疗产品原材料的选择原则应基于风险控制原则，即在原料级别的选择上，药用级别优于非药用级别、化学源性优于生物源性、非动物源性优于动物源性。目前常用实验室配制、专利CN113025654A和专利CN108552156A公开的人多能干细胞冻存液都含有一定浓度的胎牛血清或血清替代物，属于含动物源性成分、成分不明确的冻存液。专利CN112544613A公开的人多能干细胞冻存液含多种细胞因子，包括转铁蛋白、碱性生长因子和转化生长因子，属于富含生物源性成分的冻存液。这些人多能干细胞冻存液在细胞治疗产品的原材料风险控制和级别方面存在较大提升空间，研发无动物源性成分、成分明确、无蛋白的人多能干细胞冻存液将大幅提高其作为细胞治疗产品原材料的合规性。
其次，人多能干细胞冻存液应满足工业生产的关键质量指标，包括成本低廉、稳定性高和简便快速。在成本控制方面，基于血清、血清替代物和多种蛋白成分的人多能干细胞冻存液成本高昂；使用化合物组合替代全部蛋白成分可将成本降低85%以上。在稳定性方面，人多能干细胞冻存液含有的血清、血清替代物和多种蛋白成分存在保存效期短、保存条件严苛、生物活性批次间稳定性差等缺点，导致不同批次冻存的人多能干细胞冻存复苏后细胞活率常常超出控制上下限。在简便快速方面，专利CN107494521A公开的冻存液和Thermo Fisher公司的CTS™ PSC 冻存试剂盒均需按浓度梯度逐级渗透、程序性降温至-80℃，操作繁琐、耗时长。研发成本低廉、稳定性高和简便快速的人多能干细胞冻存液是实现普惠型人多能干细胞保存及细胞治疗产品的工业基础。
参考《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》（试行）等合规性文件，使用人多能干细胞冻存液冻存的人多能干细胞是临床诊疗和细胞治疗产品的原材料，应能在液氮冻存条件下一定时间内保留人多能干细胞的生物学特性、安全性、稳定性、有效性等关键质量属性。市场广泛应用的Thermo Fisher公司的CTS™ PSC 冻存试剂盒和专利CN108552156A公开的冻存液均未全面考察冻存复苏后人多能干细胞的关键质量属性。Thermo Fisher公司官网未公开且不提供CTS™ PSC 冻存试剂盒的关键质量属性研究数据，专利CN108552156A仅考察了冻存复苏后人多能干细胞的部分生物学特性和部分稳定性指标，仅包括细胞形态、细胞标志物表达水平和存活率。缺乏合规的质量研究严重制约了人多能干细胞冻存液的产业转化和临床应用。
因此，亟待研发原料级别高、成分明确、不含蛋白质成分、成本可控、简便快速、验证充分的人多能干细胞冻存液，满足日益迫切的临床应用和工业生产需求。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种人多能干细胞冻存液，该人多能干细胞冻存液不含蛋白质成分、不需要程序降温、验证充分，解决现有人多能干细胞冻存液的技术缺陷、满足临床应用和工业生产关键质量属性的要求。
为达到第一个目的，本发明提供了一种人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述人多能干细胞冻存液包括以下组分：基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物；所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR-99021，ID-8和Y-27632，进一步地，所述CHIR-99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为50-500 nM，ID-8占整体冻存液的体积摩尔浓度为100-1000 nM，Y-27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为1-30 μM；且人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。
动物血清、转铁蛋白、人血清白蛋白等均属于蛋白质成分，冻存液中不含有上述蛋白质成分，原料级别高，风险控制好。
冻存液中不含有蛋白质成分，复苏后细胞活率较低；如果加入合适的信号通路抑制剂可以提高细胞活率，但活率仍偏低。但本申请发明人经过研究发现，如选择加入CHIR-99021，ID-8和Y-27632，分别属于GSK3β信号通路抑制剂、DYRK信号通路抑制剂和ROCK信号通路抑制剂，能够产生协同作用，在不含有蛋白质成分的情况下，大幅提高复苏后的细胞活率。在性能测试过程中发明人还发现，冻存液中同时加入CHIR-99021，ID-8和Y-27632，人多能干细胞冻存时，非程序性降温相对于程序性降温，复苏后细胞活率接近，从而使冻存过程更加简便快速。
进一步地，所述CHIR-99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为100-250 nM；ID-8占整体冻存液的体积摩尔浓度为250-750 nM；Y-27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为8-12μM。单位“nM”在本领域是明确的，代表nmol/L；单位“μM”在本领域是明确的，代表μmol/L。
本领域中，基础细胞培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。进一步，所述基础细胞培养基为：DMEM、RPMI1640和DMEM/F-12中的一种或几种。
优选地，所述基础细胞培养基为DMEM/F-12，占整体冻存液的体积百分比为78.5-98.5% v/v；
更优选的，所述DMEM/F-12培养基占整体冻存液的体积百分比为82-92.5% v/v。
进一步，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜和/或甲基纤维素。
优选地，二甲基亚砜占整体冻存液的体积百分比为1-15% v/v，甲基纤维素占冻存液的质量体积浓度为0.1-1.5 g/L；更优选地，二甲基亚砜占整体冻存液的体积百分比为5-12% v/v，甲基纤维素占冻存液的质量体积浓度为0.5-1.2 g/L。
进一步地，所述人多能干细胞冻存液还可以添加葡萄糖、微生物、多糖、无机盐等辅助组分。
本发明的第二个目的在于提供上述人多能干细胞冻存液在冻存人多能干细胞中的应用或在制备人多能干细胞冻存产品中的应用。
上述人多能干细胞冻存液在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
（1）在建立人多能干细胞库中的应用；
（2）在复苏后用于研究的人多能干细胞冻存中的应用；
（3）在复苏后用于生产的人多能干细胞冻存中的应用；
（4）在复苏后用于质量控制和质量检测的人多能干细胞冻存中的应用；
（5）在复苏后用于三胚层细胞分化和制备衍生功能细胞的人多能干细胞冻存中的应用。
本领域中，人多能干细胞为可在体外无限制的自我更新，并且具有向三胚层细胞分化潜能的干细胞。所述人多能干细胞包括受精胚胎来源胚胎干细胞、孤雌胚胎来源胚胎干细胞、孤雄胚胎来源胚胎干细胞、核移植胚胎干细胞、诱导多能干细胞、naive状态人胚干细胞等。
本发明中，所述产品可以为试剂或试剂盒。
本发明中，所述质量控制和质量检测项目为关键质量属性，包括生物学特性、安全性、稳定性、有效性。所述生物学特性包括但不限于细胞形态、细胞标志物表达水平、分化潜能、遗传学和代谢酶亚型谱等生物学特性指标。所述安全性包括但不限于无菌试验（细菌、真菌）、支原体检测、细胞内外源致病因子的检测、内毒素检测、异常免疫学反应、致瘤性检测、培养基及有关成分残留量等安全性指标。所述稳定性包括但不限于干细胞密度/浓度、存活率、生物学活性等稳定性指标。所述有效性包括但不限于干细胞体内体外分化潜能、分化细胞的形态结构和生理功能、特定基因和蛋白的表达及特定细胞因子的分泌等有效性指标。
本发明中，所述三胚层包括内胚层、中胚层和外胚层。所述三胚层细胞及衍生功能细胞包括但不限于：定型内胚层（definitive endoderm）细胞，及其衍生肝祖细胞、肝细胞、胆管细胞、胰岛细胞等；早期中胚层（early mesoderm）细胞，及其衍生间充质干细胞、造血干细胞、心肌细胞等；神经外胚层（neuroectoderm）细胞，及其衍生间神经干/前体细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。
本发明还提供了本发明人多能干细胞冻存液的制备方法：配制甲基纤维素水溶液，高压蒸汽灭菌后室温摇床摇晃过夜；配制ID-8的DMSO溶液配制，室温混匀；然后将冻存液所有组分混合，微调pH值，过滤器过滤分装冻存。
本发明的有益效果：
（1）原料级别高：本发明人多能干细胞冻存液采用全化学源性原料，无动物源性成分、成分明确、不含蛋白质成分。
（2）复苏后细胞活率：本发明人多能干细胞冻存液包括基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物，通过本发明的3种信号通路抑制剂的协同作用，在不含有蛋白质成分的情况下，具有较高的复苏后细胞活率，可达90%以上，甚至高达97%。
（3）不需要程序性降温：使用本发明人多能干细胞冻存液无需程序性降温，可直接冻存至-80℃，复苏后细胞活率仅略低于程序性降温，满足大批量细胞冻存的工业生产要求。
（4）成本低廉：与已上市人多能干细胞冻存试剂/试剂盒相比，本发明人多能干细胞冻存液的价格降低85%以上，满足普惠型人多能干细胞保存及细胞治疗产品对原材料成本控制的要求。
（5）普适性高：本发明人多能干细胞冻存液适用于不同培养基（包括但不限于mTeSR1、Essential 8）、不同培养基质（包括但不限于Vitronectin、Matrigel）培养的多种类型的胚胎干细胞和诱导多能干细胞，且可冻存细胞的密度范围为1E5-2E7个活细胞/mL冻存液，适用范围广。
（6）质量研究充分、产品性能高。稳定性研究方面，使用本发明人多能干细胞冻存液可在液氮条件下稳定冻存人多能干细胞长达42个月。生物学属性方面，复苏后细胞活率高、回收率高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出使用样品1-13，对照1-11采用程序性降温和非程序性降温冻存人胚胎干细胞H1细胞1个月，复苏后0小时细胞活率图，n≥3，冻存前细胞活率≥95%。
图2示出使用样品3冻存人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117细胞复苏后的细胞形态图，Scale bar = 100 μm。
图3示出使用样品12冻存人胚胎干细胞H1、H9和ATCC-BXS0117细胞复苏后碱性磷酸酶活细胞染色图，小鼠胚胎成纤维细胞不表达碱性磷酸酶，为碱性磷酸酶活细胞染色阴性对照，Scale bar = 100 μm。
图4示出使用样品4冻存人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117复苏后细胞核型分析图。
图5示出使用样品13冻存人胚胎干细胞H9复苏后形成的畸胎瘤三胚层分化组织切片和HE染色图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中所使用的抗体、试剂来源如下：
CTS™ KnockOut™ DMEM培养基，Thermo Fisher公司，货号A1286101。
BenchStable™ RPMI 1640培养基，Thermo Fisher公司，货号A4192301。
CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基，Thermo Fisher公司，货号A1370801。
二甲基亚砜（CAS号67-68-5），WAK-Chemie Medical GmbH公司，货号为WAK-DMSO-70。
甲基纤维素（CAS号9004-67-5），Sigma-Aldrich公司，货号M7027。
CHIR-99021（CAS号1797989-42-4），Selleck公司，货号S2924（10 mM in DMSO）。
ID-8（CAS号147591-46-6），Selleck公司，货号S7327。
Y-27632（CAS号129830-38-2），Selleck公司，货号S1049（10 mM in DMSO）。
人血清白蛋白（CAS号70024-90-7），Sigma-Aldrich公司，货号A1653。
CTS™ DPBS，Thermo Fisher公司，货号A1285602。
CTS™ Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated，ThermoFisher公司，货号A27940。
Corning® Matrigel® hESC-Qualified Matri×，Corning公司，货号为354277。
CTS™ Versene™ 溶液，Thermo Fisher公司，货号A4239010。
StemPro™ Accutase™ 细胞解离试剂，Thermo Fisher公司，货号A1110501。
CTS™ Essential 8™ 培养基，Thermo Fisher公司，货号A2656101。
mTeSR™1培养基，STEMCELL Technologies公司，货号85850。
Alkaline Phosphatase Live Stain，Thermo Fisher公司，货号A14353。
Alexa Fluor® 488 Rabbit monoclonal [EPR17929] to Oct4，Abcam公司，货号ab283741。
Alexa Fluor® 488 Rabbit monoclonal [EPR2027(2)] to Nanog，Abcam公司，货号ab196155。
Alexa Fluor® 488 Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control，Abcam公司，货号ab199091。
Anti-Human TRA-1-81 Antibody, Clone TRA-1-81, Alexa Fluor® 488-conjugated抗体，STEMCELL公司，货号60065AD。
Mouse IgM, kappa Isotype Control Antibody, Clone MM30, Alexa Fluor®488，STEMCELL公司，货号60069AD。
Alexa Fluor® 647 Mouse anti-human SSEA-4抗体，BD Pharmingen公司，货号560796。
Alexa Fluor® 647 Mouse IgG3，k Isotype control，BD Pharmingen公司，货号560803。
FITC Mouse anti-human CD3抗体，BD Pharmingen公司，货号555339。
FITC Mouse IgG2，k Isotype control，BD Pharmingen公司，货号555573。
FITC Mouse anti-human CD56抗体，BD Pharmingen公司，货号562794。
FITC Mouse anti-human CD45抗体，BD Pharmingen公司，货号560976。
FITC Mouse IgG1，k Isotype control，BD Pharmingen公司，货号555748。
Cellometer-ViaStain™ AOPI Staining Solution，Nexcelom公司，货号CS2-0106。
4%多聚甲醛固定液，生工生物工程（上海）股份有限公司，货号E672002。
STEMdiff™ NK Cell Kit，STEMCELL公司，货号100-0170。
UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water，Thermo Fisher公司，货号为10977023。
本发明用于人多能干细胞的程序降温冻存方法，包括以下步骤：
1)冻存液保存于-20℃，使用前于2-8℃融化；
2)弃掉旧的培养基，加入2 mL CTS™ DPBS洗一遍；
3)加入CTS™ Versene™溶液，加入的量以刚好盖过培养皿底部为宜，37℃消化 3min；
4)待细胞集落消化到比较松散的贴壁状态时，小心弃掉CTS™ Versene™，用基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基）轻轻清洗一次；
5)用基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基）重悬细胞，200g离心5min，弃掉上清；
6)用2-8℃预冷的冻存液重悬细胞，分装到冻存管中，推荐1E5-2E7个人多能干细胞/mL冻存液密度冻存；
7)将冻存管放入2-8℃冰箱，放置30 min后转移到-20℃冰箱中；
8)将冻存管放入-20℃冰箱，放置2 h后转移到-80℃冰箱中；
9)将冻存管放入-80℃冰箱，放置过夜后转移到液氮罐中。
本发明用于人多能干细胞的非程序降温冻存方法，包括以下步骤：
1)冻存液保存于-20℃。使用前于2-8℃融化；
2)弃掉旧的培养基，加入2 mL CTS™ DPBS洗一遍；
3)加入CTS™ Versene™溶液，加入的量以刚好盖过培养皿底部为宜，37℃消化 3min；
4)待细胞集落消化到比较松散的贴壁状态时，小心弃掉CTS™ Versene™，用基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基）轻轻清洗一次；
5)用基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基）重悬细胞，200g离心5min，弃掉上清；
6)用2-8℃预冷的冻存液重悬细胞，分装到冻存管中，推荐1E5-2E7个人多能干细胞/mL冻存液密度冻存；
7)将冻存管直接放入-80℃冰箱过夜，一周内转移到液氮罐中。
本发明用于人多能干细胞的复苏方法，具体步骤如下：
1)室温下预热人多能干细胞完全培养基（CTS™ Essential 8™ 培养基或mTeSR™1培养基）和基质（CTS™ Vitronectin (VTN-N)或Corning® Matrigel）包被的6孔板；
2)从液氮库中取出人多能干细胞，用干冰将其转移到细胞房；
3)将冻存管浸入37℃水浴中，瓶盖不被淹没。轻轻旋转冻存管，当只剩下一个冰晶时，从水浴锅中取出冻存管，在其外面喷上70%酒精，然后置于超净台中；
4)将解冻后的细胞转移至15 mL离心管，缓慢加入10 mL人多能干细胞完全培养基（CTS™ Essential 8™ 培养基或mTeSR™1培养基）。1 mL人多能干细胞完全培养基（CTS™Essential 8™ 培养基或mTeSR™1培养基）冲洗冻存管，并将其转移至有细胞的15 mL管中；
5)200 g，离心5 min，弃去上清，用2 mL人多能干细胞完全培养基（CTS™Essential 8™ 培养基或mTeSR™1培养基）重悬细胞；
6)将人多能干细胞悬液缓慢加入预热过的基质（CTS™ Vitronectin (VTN-N)或Corning® Matrigel）包被的6孔板中，每孔接种1E6活细胞；
7)快速左右移动培养板，使细胞在孔中均匀分散，然后将平板轻轻放入37℃，5%CO2的培养箱中；
8)第二天，吸弃旧培养基，加入新鲜人多能干细胞完全培养基（CTS™ Essential8™ 培养基或mTeSR™1培养基），直到细胞密度达到85%。
本发明用于人多能干细胞计数和活率检测方法，具体步骤如下：
1)弃掉旧的培养基，加入2 mL CTS™ DPBS洗一遍；
2)弃去CTS™ DPBS，加入StemPro™ Accutase，加入量以刚好完全覆盖细胞为宜；
3)37℃培养箱孵育2-5 min，直至单个细胞变圆，轻轻吹打细胞，使细胞脱落；
4)将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™DMEM/F-12培养基）重悬细胞，200 g离心5 min，弃掉上清；
5)加入适量基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基）重悬细胞；
6)取20 μL细胞悬液置于离心管中，加入20 μL AOPI Staining Solution，轻轻吹打混匀；
7)取20 μL染色细胞悬液加入计数板，将细胞计数板***仪器，选择合适的AOPI活性测定方法；
8)预览明场和荧光图像，计数。
本发明用于人多能干细胞的传代扩增方法，具体步骤如下：
1)弃掉旧的培养基，加入2 mL CTS™ DPBS洗一遍；
2)加入CTS™ Versene™溶液，加入的量以刚好盖过培养皿底部为宜，37℃消化 3min；
3)待细胞集落消化到比较松散的贴壁状态时，小心弃掉CTS™ Versene™，用基础细胞培养基（CTS™ KnockOut™ DMEM/F-12培养基）轻轻清洗一次；
4)用人多能干细胞完全培养基（CTS™ Essential 8™ 培养基或mTeSR™1培养基）重悬细胞，接种至事先包被好基质（CTS™ Vitronectin (VTN-N)或Corning®Matrigel）的6孔板中；
5)每天吸弃旧培养基，加入新鲜人多能干细胞完全培养基（CTS™ Essential 8™培养基或mTeSR™1培养基），直到细胞密度达到85%。
本发明用于计算细胞群体倍增时间的方法，具体步骤如下：
1)按上述方法进行冻存复苏后第3天、第6天、第9天和第12天的人多能干细胞活细胞计数；
2)计算细胞群体倍增时间（PDT），PDT=T2-1*log2/（log N2-logN1），其中T2-1为两次细胞计数的时间间隔（h）； N2/N1为第2次/第1次细胞计数的活细胞数。
本发明用于人多能干细胞进行碱性磷酸酶表达检测的方法，具体步骤如下（以1个24孔板孔为例）：
1)去除待染色孔的细胞培养液，每次用500 μL事先预热至37℃的DMEM/F12清洗细胞，共清洗三次，每次3 min（不需要摇床摇动）；
2)按照1:500的比例用DMEM/F12稀释AP Live solution至1×，得到AP染色工作液，取150 μL加入到待染色的细胞中，37℃ CO2培养箱中孵育30 min；
3)弃掉AP染色工作液，每次用500 μL DMEM/F12清洗细胞，共清洗三次，每次3 min（不需要摇床摇动）；
4)加入500 μL DMEM/F12，荧光显微镜下观察拍照，碱性磷酸酶阳性的细胞呈绿色荧光阳性，碱性磷酸酶阴性的细胞呈绿色荧光阴性。
本发明用于人多能干细胞进行免疫荧光染色和流式细胞分析的方法，具体步骤如下：
1.表面标志物检测；
1)加入200 μL含1E6个活细胞的细胞悬液至1.5 mL离心管中，离心并弃上清。每管中再加入1 mL CTS™ DPBS重悬，离心并弃上清；
2)每管加入100 μL TRA-1-81/SSEA4/CD34/CD3/CD56/CD45抗体或相应Isotypecontrol。轻轻振荡充分混匀后，置于4℃冰箱避光孵育30 min；
3)每管加入1 mL CTS™ DPBS离心；
4)弃上清，每管加入1 mL CTS™ DPBS重悬，离心；
5)弃上清，每管加入500 μL CTS™ DPBS重悬，流式细胞仪检测各组细胞表面TRA-1-81、SSEA4、CD34、CD3、CD56和CD45分子的表达。
2.核标志物检测
细胞制备、固定、通透和封闭：
1)弃掉旧的培养基，用DMEM/F12润洗一次；
2)加入0.5 mM EDTA，加入的量以刚好没过培养皿底部为宜，37℃消化3 min；
3)待细胞消化到比较松散的贴壁状态时，小心弃掉EDTA，用DMEM/F12轻轻润洗一次；
4)用1 mL 4%PFA重新悬浮细胞，收集到15 mL离心管，室温固定30 min；
5)弃掉4%PFA，用2 mL PBS洗三遍，每次摇床5 min（若固定隔夜或更长时间，需要延长摇床上PBS洗的时间至每次30 min）；
6)弃掉PBS，用1 mL 0.3%Triton室温通透30min，此步转移到1.5 mL EP管中；
7)弃掉Triton，用1 mL 5%BSA室温封闭1小时；
8)弃掉5%BSA，每管加入100 μL OCT4抗体/NANOG抗体/ Isotype control，室温摇床孵育1小时；
9)弃掉OCT4抗体/NANOG抗体/Isotype control，用1 mL PBS洗三遍，每次摇床5min；
10)弃上清，每管加入500 μL CTS™ DPBS重悬，流式细胞仪检测各组细胞OCT4和NANOG分子的表达。
本发明用于人多能干细胞进行核型检测分析的方法，具体步骤如下：
1)去除细胞培养上清，更换含0.2 μg/mL秋水仙素的新鲜培养液，继续培养2-4 h；
2)弃细胞培养液，并用1/2培养液体积的 CTS™ DPBS清洗一遍，然后加入1/2培养液体积的StemPro™ Accutase溶液，37℃消化5 min，加入4倍体积的CTS™ DPBS轻柔吹打成单细胞，并收集到15 mL离心管，200g离心5 min；
3)弃上清，加入4 mL预热的75 mM KCl低渗液，用1 mL移液器轻柔吹打重悬细胞沉淀至没有细胞团块存在为止，37℃处理20 min；
4)向低渗处理后的细胞悬液中加入0.5 mL固定液（甲醇：冰醋酸 = 9:4），200g离心5 min；
5)弃上清，加4 mL固定液，室温固定30 min后200 g离心5 min，重复固定1-2次；
6)弃上清，加0.35 mL固定液重悬沉淀，备用；
7)烧适量开水，加入100 mL烧杯，从4℃冰箱取出用水预冷的载玻片，混匀步骤6）的细胞悬液并吸取约80μL，分3-5滴滴加到载玻片中央，立即置于烧杯口用水蒸气熏蒸玻片5 min；
8)晾干玻片，收到玻片架；60℃烘片2 h后室温干燥保存；
9)取出1个玻片，放入装有0.005%胰酶消化液的染缸中消化4-5 min；
10)取出玻片放入装有CTS™ DPBS的染缸中，上下抽插几下并放置30 s；
11)从CTS™ DPBS中取出玻片，在卫生纸上蘸去残留的液体，放入装有吉姆萨染液工作液的染缸中，染色6-8 min；
12)染色完毕后，用自来水冲洗玻片；
13)将冲洗后的玻片甩几下后放到玻片架上晾干，然后在正置显微镜下观察，10×物镜找到有***相的视野，转换100×油镜观察显带效果，扫描分析。
本发明用于人多能干细胞定向分化为NK细胞的方法按STEMdiff™ NK Cell Kit产品技术手册的步骤进行。
本发明用于人多能干细胞畸胎瘤形成实验方法，具体步骤如下：
1)按照上述方法制备含有1.5E7个活人多能干细胞/100 μL的CTS™ DPBS细胞悬液;
2)选取5周龄以上NPG雄鼠，每只鼠两侧睾丸包膜下分别注射100 μL含有1.5E7个活人多能干细胞的CTS™ DPBS细胞悬液;
3)细胞注射6-10周后，视肿瘤生长情况终止实验（a.小鼠体重减轻大于20%，b.肿瘤大小大于1.5g或者任一维度直径超过20mm）;
荷瘤成功后，剖开睾丸后进行剥瘤，剥瘤后对瘤组织进行切块、石蜡包埋、切片、HE染色和图片采集。
实施例1 人多能干细胞冻存液的配制
配制方法如下：
甲基纤维素（20 g/L，H2O）溶液配制：称取粉末，加入相应的水至终浓度为20 g/L，高压蒸汽灭菌后室温摇床摇晃过夜。ID-8（10 mM in DMSO）溶液配制：称取粉末，加入相应的DMSO至终浓度为10 mM，室温混匀。其他组分按照正常的混合方法即可，配制完成后，微调pH值至7.20-7.25。0.22 μm滤器过滤分装，冻存于-20℃。
本实施例1的冻存液中，样品1-13为本发明的人多能干细胞冻存液，采用不同的用量比例；对照组1-6与样品1-13不同之处在于仅含有1种或2种信号通路抑制剂；对照组7-10与样品不同之处在于还加入了人血清白蛋白（HSA）；对照组11为美国Thermo Fisher公司的CTS™ PSC 冻存试剂盒，所述组织冻存液包含CTS™ PSC Cryomedium以及CTS™RevitaCell™ 补充剂（100 ×）两个组分。
冻存液的组成及比例如表1所示，其中培养基DMEM/F-12、DMEM 和RPMI1640的用量单位为v/v，二甲基亚砜（DMSO）用量单位为v/v，甲基纤维素（MC）的用量单位为g/L，信号通路抑制剂CHIR-99021用量单位为nM，信号通路抑制剂ID-8用量单位为nM，信号通路抑制剂Y-27632用量单位为μM，人血清白蛋白（HSA）用量单位为mg/mL。
表1 实施例1冻存液的组成及比例
Figure 188076DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 使用不同冻存液、不同降温方法冻存复苏后人多能干细胞活率对比试验
以人多能干细胞H1为受试细胞，以样品1-13的冻存液为受试冻存液，以对照1-11的冻存液作为对照冻存液，按照本发明中程序性降温和非程序性降温冻存方法对人多能干细胞H1进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时进行细胞活率检测，统计数据以比较不同冻存液对人多能干细胞的冻存效果，如图1所示，纵坐标表示的是复苏后0小时H1细胞活率（%）。
使用配对t检验对图1数据进行统计学分析，使用样品1-13细胞冻存液，采用程序性降温和非程序性降温冻存H1细胞，复苏后0小时H1细胞活率93%以上，说明即便不含有蛋白质成分，本发明的人多能干细胞冻存液仍能够达到较好的技术效果。使用样品1-13细胞冻存液，采用程序性降温或非程序性降温冻存H1细胞，复苏后0小时H1细胞活率无显著性差异，因而采用本发明的冻存液冻存时，可以选择非程序性降温，从而简便快速。
使用样品5、样品11-13与使用对照7-10细胞冻存液相比，区别在于对照7-10的冻存液加入了人血清白蛋白，从结果上看，无论采用程序性降温或非程序性降温冻存H1细胞，复苏后0小时H1细胞活率均无显著性差异。说明本发明的冻存液通过3种信号通路抑制剂的协同作用，可以避免使用蛋白质成分，能够达到类似的技术效果。
与使用样品1-13细胞冻存液相比，使用对照1-6、11，无论采用程序性降温或非程序性降温冻存H1细胞，复苏后0小时H1细胞活率均显著降低。说明如果在冻存液中仅加入1种或2种信号通路抑制剂，都会大幅降低细胞冻存液的技术效果，特别是非程序性降温。
实施例3 冻存复苏后不同时间点人多能干细胞活率检测
以人多能干细胞H9为受试细胞，以样品5和样品13的冻存液为受试冻存液，以对照11的冻存液作为对照冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞H9进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时、24小时、48小时和72小时进行细胞活率检测。
由表2可以看出，使用样品5或样品13细胞冻存液冻存H9细胞，复苏后0小时和24小时H9细胞活率可达90%以上，较少/无延迟冷冻损伤。
表2冻存复苏后不同时间点人多能干细胞H9的细胞活率
（n≥3，冻存前细胞活率≥95%）
Figure 105217DEST_PATH_IMAGE003
实施例4冻存细胞密度研究
以人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品5冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对不同密度的ATCC-BXS0117细胞进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后0小时进行细胞活率检测。
由表3可以看出，使用样品5冻存液冻存1E5-2E7个活细胞/mL的ATCC-BXS0117细胞，复苏后0小时细胞活率可达90%以上，适用范围广。
表3不同细胞密度冻存复苏后人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117的细胞活率
（n≥3，冻存前细胞活率≥95%）
Figure 884954DEST_PATH_IMAGE005
实施例5 冻存复苏后人多能干细胞形态观察
以人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品3冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存12个月后进行复苏，采集细胞光镜图片。
由图2可以看出，使用样品3冻存的H1、H9和ATCC-BXS0117细胞，复苏后细胞呈克隆团生长、克隆边缘清晰，核质比高，克隆内细胞与细胞之间接触紧密，为人多能干细胞的典型形态。
实施例6冻存复苏后人多能干细胞群体倍增时间检测
以人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品3和样品12冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存12个月后进行复苏。以未冻存的H1、H9和ATCC-BXS0117细胞为对照细胞，以冻存复苏后的H1、H9和ATCC-BXS0117细胞为受试细胞，按照本发明中上述方法在复苏后第3天、第6天、第9天和第12天进行活细胞计数，计算细胞群体倍增时间。
使用配对t检验对表4数据进行统计学分析，使用样品3和样品12冻存H1、H9和ATCC-BXS0117细胞，复苏后细胞群体倍增时间与未冻存细胞无显著差异，可长期体外扩增。
表4冻存复苏后不同时间点人多能干细胞的细胞群体倍增时间
（n≥3，冻存前细胞活率≥95%）
Figure 280163DEST_PATH_IMAGE007
实施例7 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-冻存复苏后人多能干细胞活率检测
以人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品8和样品11冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存0、12、24和36个月后进行复苏。按照本发明中上述方法在复苏后0小时进行细胞活率检测。
使用配对t检验对表5数据进行统计学分析，结果显示，使用样品8和样品11冻存液，冻存不同时间后复苏的H1、H9和ATCC-BXS0117细胞与冻存前相比细胞活率无显著差异。
表5冻存不同时间复苏后人多能干细胞的细胞活率（n≥3）
Figure 828956DEST_PATH_IMAGE009
实施例8 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-冻存复苏后人多能干细胞碱性磷酸酶表达水平检测
以人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品12冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存24个月后进行复苏。按照本发明中上述方法在复苏后72小时进行人多能干细胞碱性磷酸酶检测。
由图3可以看出，使用样品12冻存液冻存24个月后复苏的人胚胎干细胞H1、H9和ATCC-BXS0117细胞高比例表达人多能干细胞标志蛋白碱性磷酸酶。
实施例9 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-冻存复苏后人多能干细胞标志蛋白检测
以人胚胎干细胞H1和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品9和样品10冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存24个月后进行复苏。按照本发明中上述方法在复苏后72小时进行人多能干细胞标志蛋白检测。
结果显示，使用样品9和样品10冻存液，冻存24个月后复苏的H1和ATCC-BXS0117细胞高比例表达人多能干细胞标志蛋白OCT4、NANOG、TRA-1-80和SSEA4，超过《人胚胎干细胞》团体标准要求。
表6长期冻存复苏后人多能干细胞的细胞标志蛋白检测（流式细胞分析法，n≥3）
Figure 651419DEST_PATH_IMAGE011
实施例10 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-冻存复苏后人多能干细胞核型检测
以人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品4冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存24个月后进行复苏。按照本发明中上述方法进行人多能干细胞核型检测。
结果如图4显示，使用样品4冻存24个月后复苏的人胚胎干细胞H1、H9和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117细胞核型正常，分别为46，XY 、46，XX和46，XX。
实施例11 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-冻存复苏后人多能干细胞定向分化能力检测
以人胚胎干细胞H1和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117为受试细胞，以样品6和样品7冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存24个月后进行复苏。按照本发明中上述方法进行NK细胞定向分化并进行细胞标志蛋白检测。
结果显示，使用样品6冻存液，冻存24个月后的H1和人诱导多能干细胞ATCC-BXS0117细胞可高效定向分化为CD34+的造血干/祖细胞和CD3-CD56+CD45+的NK细胞，具有中胚层分化潜能。
表7长期冻存复苏后人多能干细胞定向分化的细胞标志蛋白检测
（流式细胞分析法，n≥3）
Figure 918452DEST_PATH_IMAGE013
实施例12 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-冻存复苏后人多能干细胞畸胎瘤形成能力检测
以人胚胎干细胞H9为受试细胞，以样品13冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞进行冻存，冻存24个月后进行复苏。按照本发明中上述方法进行体内畸胎瘤形成能力检测。
结果如图5显示，使用样品13冻存液，冻存24个月后的H9细胞可在裸鼠体内形成具有三胚层结构的畸胎瘤，具有体内三胚层分化潜能。
实施例13 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-人多能干细胞冻存液外观检测
以样品5-10冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞冻存液进行冻存，冻存0、12、24和36个月后进行复苏。按照本发明中上述方法进行外观和pH值检测。
结果显示，冻存不同时间复苏后，样品5-10冻存液外观稳定，未出现结团、絮状物等现象。
表8冻存不同时间复苏后人多能干细胞冻存液的外观
Figure 117352DEST_PATH_IMAGE015
实施例14 人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-人多能干细胞冻存液pH值检测
以样品5-10冻存液为受试冻存液，按照本发明中非程序性降温冻存方法对人多能干细胞冻存液进行冻存，冻存0、12、24和36个月后进行复苏。按照本发明中上述方法进行pH值检测。
结果显示，冻存不同时间复苏后，在25℃时，样品5-10冻存液的pH值为7.2±0.2。
表9冻存不同时间复苏后人多能干细胞冻存液的pH值
Figure 786231DEST_PATH_IMAGE017
实施例15人多能干细胞冻存液的长期稳定性研究-人多能干细胞冻存液细菌内毒素检测
以样品1-10冻存液为受试冻存液，按照本发明中上述方法对人多能干细胞冻存液进行冻存，冻存0、12、24和36个月后进行复苏。按照本发明中上述方法进行细菌内毒素检测。
结果显示，冻存不同时间复苏后，样品1-10冻存液的细菌内毒素均≤0.5 EU/mL。
表10冻存不同时间复苏后人多能干细胞冻存液的内毒素含量
Figure 700966DEST_PATH_IMAGE019
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，在本发明的基础上做出的各种变化、变动、替换和变性，仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述人多能干细胞冻存液包括以下组分：基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物；所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR-99021、ID-8和Y-27632，所述CHIR-99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为50-500 nM，所述ID-8占整体冻存液的体积摩尔浓度为100-1000 nM，所述Y-27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为1-30 μM；且所述人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。
2.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述CHIR-99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为100-250 nM，ID-8占整体冻存液的体积摩尔浓度为250-750 nM，Y-27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为8-12 μM。
3.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述基础细胞培养基为：DMEM、RPMI1640和DMEM/F-12中的一种或几种，占整体冻存液的体积百分比为78.5-98.5%v/v。
4.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述基础细胞培养基为DMEM/F-12，占整体冻存液的体积百分比为78.5-98.5% v/v。
5.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜和/或甲基纤维素，所述二甲基亚砜占整体冻存液的体积百分比为1-15% v/v，甲基纤维素占冻存液的质量体积浓度为0.1-1.5 g/L。
6.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜和/或甲基纤维素，所述二甲基亚砜占整体冻存液的体积百分比为5-12% v/v，甲基纤维素占冻存液的质量体积浓度为0.5-1.2 g/L。
7.权利要求1-6任一项所述的人多能干细胞冻存液在冻存人多能干细胞中的应用或在制备人多能干细胞冻存产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
9.权利要求1-6任一项所述的人多能干细胞冻存液在如下任一中的应用：
（1）在建立人多能干细胞库中的应用；
（2）在复苏后用于研究的人多能干细胞冻存中的应用；
（3）在复苏后用于生产的人多能干细胞冻存中的应用；
（4）在复苏后用于质量控制和质量检测的人多能干细胞冻存中的应用；
（5）在复苏后用于三胚层细胞分化和制备衍生功能细胞的人多能干细胞冻存中的应用。
10.权利要求1-6任一项所述的人多能干细胞冻存液的制备方法：配制ID-8的DMSO溶液，室温混匀；将人多能干细胞冻存液所有组分混合，微调pH值至7.20-7.25，过滤器过滤分装冻存。
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