CN108048390B - 一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒。所述试剂盒含有培养液II和培养液I；培养液II包括血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、VEGF、bFGF和不含血清的基础培养液；培养液I包括血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、BMP4、GSK3抑制剂和不含血清的基础培养液。实验证明，采用本发明提供的制备方法可以获得血管内皮细胞，且该制备方法使用的培养液不仅能够使人多能干细胞快速高效的分化成血管内皮细胞，而且化学成分确定、无动物源蛋白、无胰岛素添加。采用本发明提供的制备方法可大规模生产人血管内皮细胞，质量稳定，安全性高。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒。
背景技术
人多能干细胞(包括人诱导性多能干细胞和人胚胎干细胞)可分化为各种组织器官的功能性细胞，用于研究人类发育，制作疾病模型，并可通过细胞移植，取代损伤病变的细胞，促进机体创伤修复、治疗疾病。干细胞与再生医学将改变传统对于坏死性和损伤性等疾病的治疗手段，对疾病的机理研究和临床治疗带来革命性变化。
血管内皮细胞是人体血管的重要构成细胞，在损伤修复、血管重建、缺血性疾病治疗、组织工程、药物研发、建立疾病模型等等方面有重要应用价值。目前很难获得大量的血管内皮细胞，而且扩增能力有限，价格昂贵，培养液成分不确定，含动物源成分，大大限制了相关临床应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备血管内皮细胞。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于制备血管内皮细胞的试剂盒；所述试剂盒可含有培养液II；所述培养液II可包括血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和不含血清的基础培养液。
上述试剂盒中，所述培养液II具体可由血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、VEGF、bFGF和不含血清的基础培养液组成。
上述试剂盒中，每1mL所述培养液II可包括0.1-2.5mg血清白蛋白(如0.1-0.5mg血清白蛋白、0.5-2.5mg血清白蛋白、0.1mg血清白蛋白、0.5mg血清白蛋白或2.5mg血清白蛋白)、1-25μg转铁蛋白(1-5μg转铁蛋白、5-25μg转铁蛋白、1μg转铁蛋白、5μg转铁蛋白或25μg转铁蛋白)、0.04-1mg维生素C(0.04-0.2mg维生素C、0.2-1mg维生素C、0.04mg维生素C、0.2mg维生素C或1mg维生素C)、2-50ng***钠(2-10ng***钠、10-50ng***钠、2ng***钠、10ng***钠或50ng***钠)、10-250ng VEGF(10-50ng VEGF、50-250ng VEGF、10ng VEGF、50ng VEGF或250ng VEGF)和2-50ng bFGF(2-10ng bFGF、10-50ng bFGF、2ngbFGF、10ng bFGF或50ng bFGF)，所述培养液II的基础液可为不含血清的基础培养液，pH值可为7.0～7.6(如7.0～7.3、7.3～7.6、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。
上述试剂盒中，每1mL所述培养液II可为含0.1-2.5mg血清白蛋白(如0.1-0.5mg血清白蛋白、0.5-2.5mg血清白蛋白、0.1mg血清白蛋白、0.5mg血清白蛋白或2.5mg血清白蛋白)、1-25μg转铁蛋白(1-5μg转铁蛋白、5-25μg转铁蛋白、1μg转铁蛋白、5μg转铁蛋白或25μg转铁蛋白)、0.04-1mg维生素C(0.04-0.2mg维生素C、0.2-1mg维生素C、0.04mg维生素C、0.2mg维生素C或1mg维生素C)、2-50ng***钠(2-10ng***钠、10-50ng***钠、2ng***钠、10ng***钠或50ng***钠)、10-250ng VEGF(10-50ng VEGF、50-250ng VEGF、10ng VEGF、50ng VEGF或250ng VEGF)和2-50ng bFGF(2-10ng bFGF、10-50ng bFGF、2ngbFGF、10ng bFGF或50ng bFGF)的不含血清的基础培养液；pH值可为7.0～7.6(如7.0～7.3、7.3～7.6、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。
所述培养液II中，所述VEGF具体可为VEGF-A。
所述培养液II中，所述血清白蛋白可为重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白，也可以是其它非动物来源的重组人血清白蛋白，如植物来源的重组人血清白蛋白。
所述培养液II中，所述转铁蛋白可为人转铁蛋白或其它非动物来源的重组人转铁蛋白，如植物来源的重组人转铁蛋白。
所述培养液II中，所述不含血清的基础培养液可为RPMI 1640培养基或其它常用于细胞培养的基础培养液。
上述试剂盒中，所述培养液II具体可为表1所示的培养液II-1、培养液II-2或培养液II-3。
表1
Figure BDA0001518399540000021
上述任一试剂盒还可含有培养液I；所述培养液I可包括血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、骨形态发生蛋白4(BMP4)、糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂和不含血清的基础培养液。
所述培养液I具体可由血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、BMP4、GSK3抑制剂和不含血清的基础培养液组成。
上述试剂盒中，每1mL所述培养液I可包括0.1-2.5mg血清白蛋白(如0.1-0.5mg血清白蛋白、0.5-2.5mg血清白蛋白、0.1mg血清白蛋白、0.5mg血清白蛋白或2.5mg血清白蛋白)、1-25μg转铁蛋白(1-5μg转铁蛋白、5-25μg转铁蛋白、1μg转铁蛋白、5μg转铁蛋白或25μg转铁蛋白)、0.04-1mg维生素C(0.04-0.2mg维生素C、0.2-1mg维生素C、0.04mg维生素C、0.2mg维生素C或1mg维生素C)、2-50ng***钠(2-10ng***钠、10-50ng***钠、2ng***钠、10ng***钠或50ng***钠)、2-50ng BMP4(2-10ng BMP4、10-50ng BMP4、2ngBMP4、10ng BMP4或50ng BMP4)和1-10μM GSK3抑制剂(1-5μM GSK3抑制剂、5-10μM GSK3抑制剂、1μM GSK3抑制剂、5μM GSK3抑制剂或10μM GSK3抑制剂)，所述培养液II基础液可为不含血清的基础培养液，pH值为7.0～7.6(如7.0～7.3、7.3～7.6、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。
上述试剂盒中，每1mL所述培养液I可为含0.1-2.5mg血清白蛋白(如0.1-0.5mg血清白蛋白、0.5-2.5mg血清白蛋白、0.1mg血清白蛋白、0.5mg血清白蛋白或2.5mg血清白蛋白)、1-25μg转铁蛋白(1-5μg转铁蛋白、5-25μg转铁蛋白、1μg转铁蛋白、5μg转铁蛋白或25μg转铁蛋白)、0.04-1mg维生素C(0.04-0.2mg维生素C、0.2-1mg维生素C、0.04mg维生素C、0.2mg维生素C或1mg维生素C)、2-50ng***钠(2-10ng***钠、10-50ng***钠、2ng***钠、10ng***钠或50ng***钠)、2-50ng BMP4(2-10ng BMP4、10-50ng BMP4、2ngBMP4、10ng BMP4或50ng BMP4)和1-10μM GSK3抑制剂(1-5μM GSK3抑制剂、5-10μM GSK3抑制剂、1μM GSK3抑制剂、5μM GSK3抑制剂或10μM GSK3抑制剂)的不含血清的基础培养液；pH值可为7.0～7.6(如7.0～7.3、7.3～7.6、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6)。
所述培养液I中，所述血清白蛋白可为重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白，也可以是其它非动物来源的重组人血清白蛋白如，植物来源的重组人血清白蛋白。
所述培养液I中，所述转铁蛋白可为人转铁蛋白或其它非动物来源的重组人转铁蛋白，如植物来源的重组人转铁蛋白。
所述培养液I中，所述不含血清的基础培养液可为RPMI 1640培养基或常用于细胞培养的基础培养液。
所述培养液I中，所述GSK3抑制剂可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)CHIR-99021；a2)B216763；a3)BIO；a4)TWS119。
上述试剂盒中，所述培养液I具体可为表2所示的培养液I-1、培养液I-2、培养液I-3、培养液I-4或培养液I-5。
表2
Figure BDA0001518399540000031
Figure BDA0001518399540000041
上述任一试剂盒还可含有培养液III-1和/或培养液III-2；
所述培养液III-1可为TeSR-E8完全培养液或者其他用于培养人多能干细胞的培养液；
所述培养液III-2可为含2－10μM(如2-5μM、5-10μM、2μM、5μM或10μM)ROCK抑制剂的TeSR-E8完全培养液。
上述任一所述TeSR-E8完全培养液具体可为STEM CELL Technologies公司的产品，产品目录号为05940。
上述任一所述TeSR-E8完全培养液(500mL)具体可由474mL TeSR-E8基础培养液、25mL 20×补充剂1和1mL 500×补充剂2混合而成。TeSR-E8基础培养液、20×补充剂1和500×补充剂2具体可为TeSR-E8完全培养液中的组件。
所述培养液III-2中，所述Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂具体可为Y27632。
上述任一所述试剂盒可由上述任一所述培养液II和/或上述任一所述培养液I和/或上述任一所述培养液III-2和/或上述任一所述培养液III-1组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培养血管内皮细胞的方法。
本发明所提供的一种培养血管内皮细胞的方法，可包括如下步骤：
(3)将人多能干细胞接种至上述任一所述培养液I，培养，得到心血管前体细胞；
(4)完成步骤(3)后，将心血管前体细胞接种至上述任一所述培养液II，培养；得到血管内皮细胞。
上述方法中，所述方法还可包括步骤(5)：完成步骤(4)后，将血管内皮细胞接种至上述任一所述培养液II，培养。
上述方法中，所述方法还可包括如下步骤：在进行所述步骤(3)前，进行步骤(1)和(2)；
所述步骤(1)可为：将人多能干细胞接种至上述任一所述培养液III-2，培养1天±0.5天；
所述步骤(2)可为：将完成步骤(1)的人多能干细胞至上述任一所述培养液III-1，培养1天±0.5天。
所述步骤(1)中，人多能干细胞在培养体系中的浓度可为2.0×104个/平方厘米(cm2)－5.0×104个/平方厘米(cm2)(如2.0×104个/cm2－2.5×104个/cm2、2.5×104个/cm2－5.0×104个/cm2、2.0×104个/cm2、5.0×104个/cm2或2.5×104个/cm2)。
所述步骤(4)中，“将完成步骤(3)的细胞接种至上述任一所述培养液II”的接种密度可为0.25×105个/cm2-1.0×105个/cm2(如0.25×105个/cm2-5×104个/cm2、5×104个/cm2-1.0×105个/cm2、0.25×105个/cm2、5×104个/cm2或1.0×105个/cm2)。
所述步骤(3)中，所述培养的时间可为3天±0.5天。
所述步骤(4)中，所述培养的时间可为3天-10天。
所述步骤(5)中，所述培养的时间可为3天-30天。
上述任一所述方法中，所述培养的参数可为：36℃-38℃(如36℃、37℃或38℃)。
上述任一所述培养可采用CO2培养箱进行。所述CO2培养箱设置的参数可为：5％CO2。
上述任一所述方法中，所述人多能干细胞可为消化液消化后的单细胞。所述消化液具体可为消化液Accutase。所述消化液Accutase具体可为Merk Millipore公司的产品，产品目录号为SF006。
上述任一所述人多能干细胞可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)：
b1)人胚胎干细胞系；
b2)人诱导性多能干细胞系；
b3)人胚胎干细胞系H1；
b4)人胚胎干细胞系H7；
b5)人胚胎干细胞系H9；
b6)人诱导性多能干细胞系CD34-iPSC。
需要说明的是，如果采用本发明提供的方法制备人血管内皮细胞，则培养液I和培养液II中的血清白蛋白可为重组人血清白蛋白，转铁蛋白可为人转铁蛋白。如果是采用本发明提供的方法制备非人血管内皮细胞，则培养液I和培养液II中的血清白蛋白可为牛血清白蛋白。
所述人胚胎干细胞系具体可为通过商业途径购买。所述人胚胎干细胞系H1、所述人胚胎干细胞系H7和所述人胚胎干细胞系H9均可为美国WiCell细胞库的产品。
实验证明，采用本发明提供的制备方法可以获得血管内皮细胞，且该制备方法使用的培养液不仅能够使人多能干细胞快速高效的分化成血管内皮细胞，而且化学成分确定、无动物源蛋白、无胰岛素添加。采用本发明提供的制备方法可大规模生产人血管内皮细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物研发和细胞治疗提供大量细胞来源。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为人多能干细胞未分化时的克隆形态图。
图2为人诱导多能干细胞(CD34-iPSC)分化到血管内皮细胞过程中不同时间点的形态变化。
图3为人胚胎干细胞(H1)分化到血管内皮细胞过程中不同时间点的形态变化。
图4为实施例2步骤二中1心血管前体细胞免疫荧光鉴定的实验结果。
图5为实施例2步骤二中2血管内皮细胞比例检测的实验结果。
图6为实施例2步骤二中3血管内皮细胞免疫荧光染色鉴定的实验结果。
图7为实施例2步骤二中4体外分化的血管内皮细胞在Matrigel基质胶上形成类血管网络的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
RPMI 1640培养液和重组人玻连蛋白(Vitronectin)均为ThermoFisher公司的产品。VEGF-A为SinoBiological公司的产品，产品目录号为11066-HNAB。CHIR-99021为TocrisBiosciences公司的产品，产品目录号为4423。Y27632为TargetMol公司的产品，产品目录号为T1725。维生素C(产品目录号为A8960)和人转铁蛋白(产品目录号为T1147)均为SigmaAldrich公司的产品。***钠为Sigma Aldrich公司的产品，产品目录号为S5261。bFGF为R&D Biosystems公司的产品，产品目录号为233-FB。PBS缓冲液为Wincent公司的产品，产品目录号为311-010-CL。胎牛血清为Hyclone公司的产品，产品目录号为SH30088.03。多聚甲醛为国药集团化学试剂公司的产品。消化液Accutase为Merk Millipore公司的产品，产品目录号为SF006。DMEM培养液(产品目录号11960044)和0.25％Trypsin(产品目录号25200056)为Gibco公司的产品。TeSR-E8完全培养液为STEMCELL公司的产品，产品目录号为05940。BMP4为R&D Bioystems公司的产品，产品目录号为314-BP。重组人血清清白蛋白为武汉禾元生物科技公司的产品。抗人MESP1抗体为Avia Systems Biology公司的产品，产品目录号为ARP39374_P050。DAPI为ThermoFisher公司的产品，产品目录号为D1306。FITC标记的抗人类CD31的抗体为BD Biosciences公司的产品，产品目录号为557508。抗人CD31抗体为Abcam公司的产品，产品目录号为ab76533。Matrigel为BD Biosciences公司的产品，产品目录号为356231。
人胚胎干细胞系H1、人胚胎干细胞系H7和人胚胎干细胞系H9均为美国WiCell细胞库的产品。在下文中，人胚胎干细胞系H1简称H1细胞，人胚胎干细胞系H7简称H7细胞，人胚胎干细胞系H9简称H9细胞。
人诱导性多能干细胞系CD34-iPSC为将人脐带血造血干细胞重编程而来。在下文中，人诱导性多能干细胞系CD34-iPSC简称CD34-iPSC细胞。
4％多聚甲醛：浓度为4％(4g/100mL)多聚甲醛的PBS缓冲液。
PBST缓冲液：含0.1％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液。
下述实施例中，滤膜的孔径均为0.22μm。
实施例1、培养液的制备
一、储液的制备
取重组人血清白蛋白，用无菌的PBS缓冲液溶解，然后用滤膜过滤，得到浓度为50mg/mL的重组人血清白蛋白储液。
取人转铁蛋白，用无菌的PBS缓冲液溶解，然后用滤膜过滤，得到浓度为1mg/mL的人转铁蛋白储液。
取维生素C，用细胞培养级水溶解，然后用滤膜过滤，得到浓度为50mg/mL的维生素C储液。
取***钠，用细胞培养级水溶解，然后用滤膜过滤，得到浓度为100μg/mL的***钠储液。
取CHIR-99021，用DMSO溶解，得到浓度为20mM的CHIR-99021储液。
二、培养液I的制备
将RPMI 1640培养基、重组人血清白蛋白储液、人转铁蛋白储液、维生素C储液、***钠储液、BMP4和CHIR-99021储液混合，得到培养液I-1、培养液I-2、培养液I-3、培养液I-4或培养液I-5。各个培养液的pH值和各组分的浓度见表2。
表2
Figure BDA0001518399540000071
三、培养液II的制备
将RPMI 1640培养基、重组人血清白蛋白储液、人转铁蛋白储液、维生素C储液、***钠储液、VEGF-A和bFGF混合，得到培养液II-1、培养液II-2或培养液II-3。各个培养液的pH值和各组分的浓度见表1。
表1
Figure BDA0001518399540000081
四、培养液III-1和培养液III-2的制备
培养液III-1由474mL TeSR-E8基础培养液、25mL 20×补充剂1和1mL 500×补充剂2混合而成。
培养液III-2：将培养液III-1和Y27632混合，得到培养液III-2；培养液III-2中，Y27632的浓度为5μM。
实施例2、血管内皮细胞的获得及其检测
人多能干细胞为H1细胞、H7细胞、H9细胞或CD34-iPSC细胞。
培养液II为培养液II-1、培养液II-2或培养液II-3。
培养液I为培养液I-1、培养液I-2、培养液I-3、培养液I-4或培养液I-5。
一、血管内皮细胞的获得
1、取生长至汇合度为70％-80％的人多能干细胞，弃上清，然后加入PBS缓冲液洗涤2次(目的为除去死细胞和残存的细胞代谢废物)。
人多能干细胞的形态图见图1(左上为H1细胞，右上为H7细胞，左下为H9细胞，右下为CD34-iPSC细胞)。
2、完成步骤1后，先加入适量消化液Accutase，37℃静置3-5分钟；然后加入适量DMEM培养液终止消化，离心，弃上清，加入培养液III-2重悬，得到人多能干细胞的悬浮液。
3、取培养皿，用重组人Vitronectin进行包被，然后37℃孵育2小时。
4、完成步骤3后，取所述培养皿，加入步骤2得到的人多能干细胞的悬浮液和培养液III-2，得到培养体系。该培养体系中，人多能干细胞的浓度为2.0×104个/cm2－5.0×104个/cm2。
5、将步骤4得到的培养体系置于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。
6、完成步骤5后，弃上清，然后加入培养液III-1，置于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。
7、完成步骤6后，弃上清，然后加入培养液I，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3天(培养期间每天换液)，得到细胞B。
8、完成步骤7后，弃上清，先加入适量0.25％Trypsin消化至单细胞状态，然后加入含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心，弃上清，加入培养液II重悬，得到细胞B的悬浮液。
9、另取一新的培养皿，用重组人Vitronectin进行包被，然后37℃孵育2小时。
10、完成步骤9后，取所述培养皿，加入步骤8得到的细胞B的悬浮液和培养液II，得到培养体系。培养体系中，细胞B的浓度为5×104个/cm2。
11、将培养体系置于37℃、5％CO2培养箱中培养5天(培养期间每天换液)，得到细胞C。
培养过程中，观察人多能干细胞的形态变化(第0天为加入培养液I的时刻)。部分人多能干细胞的形态变化见图2(CD34-iPSC细胞)和图3(H1细胞)。结果表明，人多能干细胞的形态逐渐转变为血管内皮细胞的形态。
二、检测
1、细胞B的检测
(1)取步骤一中7得到的细胞B，用4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后吸去4％多聚甲醛，用PBS缓冲液洗涤3次(目的为除去残存的多聚甲醛)。
(2)完成步骤(1)后，先加入含0.25％(v/v)Triton X-100的PBS缓冲液，室温静置20分钟；再加入含5％(v/v)BSA的PBS缓冲液室温封闭1h。
(3)完成步骤(2)后，加入(体积比1：100)抗人MESP1抗体，室温孵育2h，然后用PBST缓冲液洗涤3次。
(4)完成步骤(3)后，加入(体积比1：500)二抗(Abcam公司的产品)，室温孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次。
(5)完成步骤(4)后，加入(体积比1：1000)DAPI，室温孵育20分钟，然后用PBST缓冲液洗涤3次。在荧光显微镜下观察细胞染色情况。
荧光显微镜下细胞B的染色情况见图4(左图为MESP1表达情况，右图为细胞核染色情况)。结果表明，细胞B为心血管前体细胞。
结果表明，培养液I可以高效的将人多能干细胞诱导分化为心血管前体细胞。
2、细胞C的检测一
(1)取步骤一中11得到的细胞C，先加入适量0.25％Trypsin消化细胞至单细胞状态，然后离心，弃上清，加入含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液，得到细胞C的悬浮液。
(2)取步骤(1)得到的细胞C的悬浮液(含1×105个细胞C)，加入FITC标记的抗人类CD31的抗体，室温避光孵育20分钟(期间每隔5分钟混匀一次)；然后用含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液洗涤2次(目的为除去未结合的抗体)。
(3)完成步骤(2)后，加入500μL含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液重悬，然后采用流式细胞仪检测。
采用CD34-iPSC细胞得到的细胞C的检测结果见图5。结果表明，结果表明，采用培养液II培养的细胞C，50％以上的细胞表面均表达内皮细胞特异性表达的蛋白CD31。
3、细胞C的检测二
(1)取步骤一中11得到的细胞C，用4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后吸去4％多聚甲醛，用PBS缓冲液洗涤3次(目的为除去残存的多聚甲醛)。
(2)完成步骤(1)后，加入含5％(v/v)BSA的PBS缓冲液封闭1小时。
(3)完成步骤(2)后，加入(体积比1：200)抗人CD31抗体，室温孵育2小时，然后用PBST缓冲液洗涤3次。
(4)完成步骤(3)后，加入(体积比1：500)二抗(Abcam公司的产品)，室温孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次。
(5)完成步骤(4)后，加入(体积比1：1000)DAPI，室温孵育20分钟，然后用PBST缓冲液洗涤3次。在荧光显微镜下观察细胞染色情况。
采用H1细胞得到的细胞C的检测结果见图6。结果表明，采用培养液II培养的细胞C的表面表达蛋白CD31，可见细胞C为血管内皮细胞。
4、细胞C的检测三
(1)取培养皿，用Matrigel进行包被，然后37℃孵育2小时。
(2)完成步骤(1)后，将步骤一中11得到的细胞C铺设在Matrigel上，然后每隔12小时观察类血管网络的生成情况并记录。
采用H1细胞得到的细胞C的实验结果见图7(左图为类血管网络形成图，右图为类血管网络局部放大图)。结果表明，细胞C具有形成类血管网络的能力。
上述结果表明，采用培养液I和培养液II可以高效的将人多能干细胞诱导分化为血管内皮细胞。

Claims (11)

1.用于制备血管内皮细胞的试剂盒；所述试剂盒含有培养液II；
所述培养液II由血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、VEGF、bFGF和不含血清的基础培养液组成；所述不含血清的基础培养液为RPMI 1640培养基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每1mL所述培养液II中血清白蛋白为0.1-2.5mg、转铁蛋白为1-25μg、维生素C为0.04-1mg、***钠为2-50ng、VEGF为10-250ng和bFGF为2-50ng，所述培养液II溶剂为不含血清的基础培养液，pH值为7.0～7.6。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有培养液I；
所述培养液I由血清白蛋白、转铁蛋白、维生素C、***钠、BMP4、GSK3抑制剂和不含血清的基础培养液组成；所述不含血清的基础培养液为RPMI 1640培养基。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：每1mL所述培养液I由0.1-2.5mg血清白蛋白、1-25μg转铁蛋白、0.04-1mg维生素C、2-50ng***钠、2-50ng BMP4和1-10μM GSK3抑制剂组成，所述培养液I溶剂为不含血清的基础培养液，pH值为7.0～7.6。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有培养液III-1和/或培养液III-2；
所述培养液III-1为TeSR-E8完全培养液；
所述培养液III-2为含2－10μM ROCK抑制剂的TeSR-E8完全培养液。
6.一种培养血管内皮细胞的方法，包括如下步骤：
（3）将人多能干细胞接种至权利要求3或4中所述培养液I，培养，得到心血管前体细胞；
（4）完成步骤（3）后，将心血管前体细胞接种至权利要求1或2中所述培养液II，培养；得到血管内皮细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤（5）：完成步骤（4）后，将血管内皮细胞接种至权利要求1或2中所述培养液II，培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在进行所述步骤（3）前，进行步骤（1）和（2）；
所述步骤（1）为：将人多能干细胞接种至权利要求5中所述培养液III-2，培养1d±0.5d；
所述步骤（2）为：将完成步骤（1）的人多能干细胞至权利要求5中所述培养液III-1，培养1d±0.5d。
9.如权利要求6至8任一所述的方法，其特征在于：所述培养的参数为：36℃-38℃。
10.如权利要求6至8任一所述的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人胚胎干细胞系或人诱导性多能干细胞系。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞系为人胚胎干细胞系H1或人胚胎干细胞系H7或人胚胎干细胞系H9；
所述人诱导性多能干细胞系为人诱导性多能干细胞系CD34-iPSC。
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