CN117511836A - 一种缺失sasA基因的底盘菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和酶工程领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种用于生产蛋白酶的底盘菌株及其构建方法。本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因。并且利用所述底盘菌株实现异源蛋白酶的高效表达，所述蛋白酶选自氨肽酶或碱性蛋白酶。

Description

一种缺失sasA基因的底盘菌株及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种用于生产蛋白酶的底盘菌株及其构建方法。
背景技术
碱性蛋白酶(Alkaline protease)，一类能够催化水解肽键的酶，在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高等优势，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。
氨肽酶(Aminopeptidase)作为一种外肽酶，能够特异性的识别蛋白和多肽链N末端的氨基酸残基，并将其逐个水解下来，与碱性蛋白酶、羧肽酶等协同水解可有效减轻蛋白水解液中的苦味，制备出多种生物活性肽，在食品、医疗行业等具有广阔的应用前景。但是氨肽酶目前产量较低，因此提高氨肽酶的表达量，为提高氨肽酶的应用效果，拓宽其应用领域具有重要价值。
解淀粉芽胞杆菌作为一类好氧、产芽胞的革兰氏阳性菌，具有遗传背景清楚、生长速度快、适应能力强、非致病性、分泌蛋白能力强、重组DNA比较容易转入的特点和良好的发酵基础及生产技术，并且已被美国食品药品管理局(FDA)认定为安全生产菌株。作为重要的异源蛋白生产宿主，其蛋白分泌能力要高于常见的蛋白生产模式菌株—枯草芽胞杆菌，但目前仅限于少量工业化酶的生产。
在生产异源蛋白过程中，生产菌株的活性保持是保证异源蛋白高产量的基础，然而在发酵过程中由于存在营养缺乏，生长环境压力，次级代谢产物和产物酶的积累以及菌体自然生长的限制导致了菌体死亡。细菌死亡会影响异源蛋白的生产，极大限制了持续表达外源蛋白的能力。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是通过对基因工程宿主的改造，提供一种有利于蛋白酶异源生产的的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因。
第二方面，本发明提供了一种生产氨肽酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达氨肽酶基因。
第三方面，本发明提供了一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达碱性蛋白酶基因。
第四方面，本发明提供了利用如上述第一方面至第三方面的基因工程菌生产蛋白酶的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产蛋白酶；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述蛋白酶。其中，所述蛋白酶选自氨肽酶或碱性蛋白酶。
本发明的有益效果如下：
先前研究中获得的解淀粉芽孢杆菌(参见专利CN116218750A)在发酵后期生长活力下降，活菌个数减少，生产蛋白的能力减弱，所以需要对菌株进行改造，提高生产异源蛋白的能力。本发明通过对解淀粉芽孢杆菌基因组上的双组分感觉组氨酸激酶sasA基因进行敲除，获得一种能够高效异源表达蛋白酶(例如氨肽酶、碱性蛋白酶)的底盘菌株，提高了解淀粉芽孢杆菌异源蛋白质生产的能力，同时实现氨肽酶、碱性蛋白酶在解淀粉芽孢杆菌胞外的高效表达对其工业化生产具有重要意义。
本发明提供了一种能够高产氨肽酶、碱性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌底盘菌株，在携带氨肽酶、碱性蛋白酶表达盒的情况下，分别摇瓶发酵，发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力是对照菌表达活性的139％，重组氨肽酶活力是对照菌表达活性的147％。
附图说明
图1：实施例1中温敏型敲除质粒pWH-T2-ΔsasA的构建过程。
图2：实施例1中基因敲除单交换验证；M：maker；1：Δ6ΔacfiΔsasA。
图3：实施例1中sasA基因敲除验证；M：maker；1：Δ6Δacfi；2：Δ6ΔacfiΔsasA。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，该基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因。
根据本发明，不表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使该基因失活或者将该基因敲除。
根据本发明，所述不表达是指该基因表达产物的量显著低于原有水平，例如，显著降低了至少50％、60％、70％、80％、90％、100％。
根据本发明一种优选的实施方式，所述解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因被敲除。敲除的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过同源重组的方式，构建敲除载体并电转化入解淀粉芽孢杆菌中，经过单双交换将上述基因从基因组上敲除，优选的，所述敲除载体是包含Kana抗性基因的pWH-T2质粒。
根据本发明一种优选的实施方式，所述基因工程菌的出发菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.11218(该菌种的生物保藏信息已公开于专利申请CN105087448A)。
优选的，所述双组分感觉组氨酸激酶sasA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述胞外蛋白酶基因aprE的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，GenBank:GU825966.1(594bp至1742bp)。
优选的，所述胞外蛋白酶基因bpr的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，GenBank:CP054415.1(全基因组1624354bp至1628643bp)。
优选的，所述胞外蛋白酶基因vpr的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，GenBank:CP002634.1(全基因组3706130bp至3708541bp)。
优选的，所述胞外蛋白酶基因mpr的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，GenBank:CP054415.1(全基因组886397bp至887311bp)。
优选的，所述胞外蛋白酶基因nprE的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，GenBank:K02497.1(254bp至1819bp)。
优选的，所述胞外蛋白酶基因epr的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，GenBank:CP054415.1(全基因组3751547bp至3753295bp)。
优选的，所述sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，GenBank:CP018902.1(全基因组3067621bp至3069039bp)。
优选的，所述胞外多糖基因簇eps具有如GenBank:CP018902.1全基因组2456935bp至2472647bp所示的核苷酸序列。
优选的，所述聚谷氨酸基因簇pgs具有如GenBank:CP018902.1全基因组2616648bp至2617796bp所示的核苷酸序列。
根据本发明，上述解淀粉芽孢杆菌基因工程菌可用于异源蛋白生产的底盘菌株。
第二方面，本发明提供了一种生产氨肽酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达氨肽酶基因ywaD。
优选的，所述氨肽酶基因ywaD编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，GenBank:QJR48409.1。
第三方面，本发明提供了一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其是在第一方面基因工程菌的基础上，异源过表达碱性蛋白酶基因aprE。
优选的，所述碱性蛋白酶基因aprE编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，GenBank:ACR24262.1。
根据本发明，异源过表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使基因ywaD或aprE的表达盒***在解淀粉芽孢杆菌的基因组中，或者通过本领域常规手段将包含有上述基因表达盒的表达载体转入解淀粉芽孢杆菌中。
根据本发明，所述过表达是指该基因表达产物的量显著高于原有水平。
第四方面，本发明提供了利用如上述第一方面至第三方面的基因工程菌生产蛋白酶的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产蛋白酶；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述蛋白酶。其中，所述蛋白酶选自氨肽酶或碱性蛋白酶。
第五方面，本发明提供了上述第一方面至第三方面基因工程菌的构建方法，包括：在解淀粉芽孢杆菌中，将六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因失活或敲除，并且可选的在解淀粉芽孢杆菌中引入碱性蛋白酶基因aprE或氨肽酶基因ywaD并使其过表达。
以上在第一方面中已详细介绍过的内容不再赘述。
根据本发明一种优选的实施方式，所述构建方法进一步包括如下步骤：
(1)敲除目的基因、获得底盘菌株
所述目的基因包括解淀粉芽孢杆菌的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因；所述目的基因均按照如下步骤敲除，需要说明的是，上述基因敲除的顺序并不影响本发明目的的实现，只要最终能达到上述目的基因全部敲除的结果即可：
1)通过PCR扩增获得目的基因两侧同源序列UP端与DOWN端；
2)通过双酶切与琼脂糖核酸凝胶电泳获得线性的敲除质粒载体；
3)通过无缝克隆技术连接同源序列与线性载体获得敲除质粒；
4)通过甲基化诱导使敲除质粒被甲基化修饰；
5)将甲基化修饰的敲除质粒电转化入解淀粉芽孢杆菌感受态细胞中；
6)通过单、双交换筛选出敲除菌株，并通过测序验证序列，获得底盘菌株；
7)通过摇瓶培养，测定生长性能。
上述各步骤的具体操作方法根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现。
(2)异源过表达蛋白酶基因
将携带有碱性蛋白酶基因aprE或氨肽酶基因ywaD表达盒的重组质粒分别电转化入以上敲除菌株中，并设置对比菌，分别获得碱性蛋白酶生产菌、氨肽酶生产菌，上述菌株通过摇瓶培养分别生产碱性蛋白酶、氨肽酶。
根据本发明一种优选的实施方式，蛋白酶基因ywaD或aprE通过重组质粒Ply-2-SPamyE-ywaD-pWB980或Ply-2-SPamyE-aprE-pWB980转入菌株，其中启动子Ply-2与信号肽SPamyE的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：
种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，其余为水；
发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。
解淀粉芽孢杆菌感受态制备培养基：
LBS培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L；
复苏培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L，甘露醇6.92246g/L。
氨肽酶的酶活力测定方法参照LNA法，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在60℃、pH 9条件下反应1min水解亮氨酸对硝基苯胺产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量。每一样品设三次重复，结果取平均值。
碱性蛋白酶酶活力测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。每一样品设三次重复，结果取平均值。
以下实施例所涉及的质粒见于表1：
表1：质粒
质粒 用途 抗性
pWH-T2 敲除载体 Kana
Ply-2-SPamyE-ywaD-pWB980 携带ywaD表达盒 Kana
Ply-2-SPamyE-AprE-pWB980 携带aprE表达盒 Kana
注：pWH-T2、pWB980均为商业质粒。
以下实施例所涉及的引物见于表2：
表2：引物
引物名称 序列 酶切位点
sasA-up-F CCCGGGCCGGAAGCTGAGAAACTTTTGC Sma I
sasA-up-R TTGATATTTTCCCATAGTCCCACCTG
sasA-down-F AAAAGGAGGAAAAATAACTTGCTTCTTTTTG
sasA-down-R TCTAGACTTGTACAGCACGCCTTCAG Xba I
SJH-F GTATCTACAGCGACAACAGAAGGC
SJH-R CTGAAAAGGCGGGCGATAAATACAA
SmaI-F ACGAATTCCTGCAGCCCGGG
DJH-UP-F TAATTCCTTTATTTTTACTGTAAACAAGTATATT
DJH-DOWN-R GCGTTCGATTTCTTCCTGGTAG
XbaI-R： CGCGGTGGCGGCCGCTCTAGA
实施例1：解淀粉芽孢杆菌底盘菌株的构建
首先一株解淀粉芽孢杆菌来源自专利申请CN116218750A(说明书0094-0116段)，该菌株已经敲除了解淀粉芽孢杆菌的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs和sacB基因，在本发明中命名为Δ6Δacfi。本发明在此基础上再敲除sasA基因，步骤如下：
(1)扩增目的基因同源序列
根据解淀粉芽孢杆菌sasA基因序列(SEQ ID NO：1)使用引物sasA-up-F/R和引物sasA-down-F/R通过PCR扩增获得sasA基因序列两端的同源臂序列UP端与DOWN端，同源臂扩增引物参见表2，解淀粉芽孢杆菌Δ6Δacfi基因组为模板；扩增反应体系如下：
扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：58℃45s；延伸：72℃10s；反应30个循环；延伸：72℃，10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，UP端和DOWN端电泳条带大小在500bp至1000bp之间，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，即获得sasA基因上、下游同源臂片段。
(2)表达载体的线性化
使用质粒小量提取试剂盒提取pWH-T2质粒。经XbaI和SmaI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体片段。
双酶切体系如下：
ddH2O 25μL
质粒模板 15μL
Q.cut Buffer 5μL
限制性内切酶XbaI 2.5μL
限制性内切酶SmaI 2.5μL
混匀后，37℃水浴酶切2h，反应完成后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带4260bp，再由小量DNA回收试剂盒回收酶切产物：线性pWH-T2质粒。
(3)构建敲除质粒
将双酶切获得的线性pWH-T2质粒片段和sasA基因的上、下游同源臂通过无缝克隆连接形成重组质粒pWH-T2-ΔsasA(构建示意图见图1)。
无缝克隆酶反应体系如下：
无缝克隆酶 5μL
线性载体 2μL
***片段 3μL
混合均匀后，50℃水浴反应15min。
(4)敲除载体的甲基化修饰以及电转化入解淀粉芽胞杆菌感受态细胞
将构建的敲除载体pWH-T2-ΔsasA通过化转转化入EC135.P.Bam.感受态细胞中，当培养液OD600值为0.2时，加入50mg/mL***糖水溶液80μL进行甲基化诱导，于30℃摇床过夜培养。
使用化转的方法将经甲基化修饰的敲除质粒化转入解淀粉芽孢杆菌Δ6Δacfi感受态细胞中，并使用敲除载体验证引物SmaI-F、XbaI-R进行菌落PCR验证。
(5)单交换验证
挑选成功电转的单克隆在45℃下培养3-4代后，经稀释涂布，挑单菌落进行菌落PCR验证，由于单交换过程中上游或下游同源序列均有可能发生单交换，因此使用两组引物SmaI-F、DJH-DOWN-R和DJH-UP-F、XbaI-R进行验证，如图2所示。
(6)双交换验证
挑选成功单交换的单克隆在37℃下培养6-9代，经稀释涂布，挑单菌落进行菌落PCR验证，所使用引物为SJH-F、SJH-R，结果如图3所示。单双交换验证正确后的菌株命名为：Δ6ΔacfiΔsasA。
需要说明，如果以其他解淀粉芽孢杆菌(例如CGMCC No.11218)作为出发菌株，也可以采用上述步骤(1)至(6)敲除目的基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB和sasA，引物依据目的基因选择，操作方法与条件基本相同。
基因工程菌Δ6ΔacfiΔsasA的生长情况：
基因工程菌Δ6ΔacfiΔsasA和对照菌Δ6Δacfi分别在种子培养基内培养72h，并且在24h、48h和72h时测菌浓变化以及测活菌数。取100uL菌液用生理盐水稀释不同倍数，选取不同浓度的菌悬液1mL放置于灭菌平皿内，将冷却至50℃左右的15～20mL培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培养计数。具有生长优势的菌株Δ6ΔacfiΔsasA与对照菌株Δ6Δacfi共同进行培养，由表3可以看出：Δ6ΔacfiΔsasA和Δ6Δacfi分别培养24h、48h和72h，在相同的菌液浓度时甚至更低的菌浓时，Δ6ΔacfiΔsasA所含有的活性菌株个数更多，显示出更高的生长优势以及生长活力。
表3：活菌个数
实施例2：氨肽酶生产菌的构建
在上述基因工程菌Δ6ΔacfiΔsasA、Δ6Δacfi中引入氨肽酶基因ywaD。
(1)由生物公司合成pLY-2启动子与amyE信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，以及氨肽酶基因(SEQ ID NO：9)；
(2)利用试剂盒提取pWB980质粒，进行EcoRI和BamHI双酶切，酶切体系同实施例1；
(3)利用无缝克隆酶将pLY-2启动子与解淀粉芽孢杆菌amyE信号肽、氨肽酶基因ywaD回收片段及酶切获得的线性化载体pWB980连接获得重组质粒Ply-2-SPamyE-ywaD-pWB980；连接体系如下：
pLY-2启动子与解淀粉芽孢杆菌amyE信号肽片段： 1μL
氨肽酶基因回收片段： 1μL
线性化载体pWB980： 3μL
无缝克隆酶： 5μL
混匀体系后，50℃反应15min；
(4)将步骤(3)中得到的重组质粒后电转到解淀粉芽孢杆菌Δ6ΔacfiΔsasA、Δ6Δacfi中，方法如下所述；
①75％酒精清洗电转杯，在紫外下照射20min以上，并在冰上预冷；
②将100μL感受态和连接产物DNA混合加入电转杯，冰上放置2min；
③2500V电击，电击时间一般为4-6ms；
④电击后立即加入1ml复苏培养基，37℃，复苏3h，取菌液涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。获得产氨肽酶的基因工程菌株分别命名为Δ6ΔacfiΔsasA-ywaD、Δ6Δacfi-ywaD。
实施例3：碱性蛋白酶生产菌的构建
在上述基因工程菌Δ6ΔacfiΔsasA、Δ6Δacfi中引入碱性蛋白酶基因aprE(SEQID NO：10)。利用重组质粒Ply-2-SPamyE-aprE-pWB980，构建过程与实施例2基本相同。获得产碱性蛋白酶的基因工程菌株分别命名为Δ6ΔacfiΔsasA-aprE、Δ6Δacfi-aprE。
实施例4：利用基因工程菌生产氨肽酶、碱性蛋白酶
摇瓶发酵：分别将实施例2-3构建的两组对照基因工程菌Δ6Δacfi-YwaD、Δ6ΔacfiΔsasA-YwaD，Δ6Δacfi-aprE、Δ6ΔacfiΔsasA-aprE在LB平板上进行三区划线，37℃倒置培养过夜，挑取活化的单菌落于5mL LB培养基中，37℃，220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于50mL LB液体培养基至OD600达1.0左右，再以2％的接种量转接于100mL发酵培养基的挡板瓶中，37℃，220r/min振荡培养24-60h。定时取样，4℃，12000r/min离心2min，取发酵液上清液。经适当稀释后测定氨肽酶、碱性蛋白酶活力，结果如表4所示，经测定Δ6ΔacfiΔsasA发酵上清液中重组氨肽酶活力是对照菌表达活性的147％，Δ6ΔacfiΔsasA发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力是对照菌表达活性的139％。
表4：产酶实验
Δ6ΔacfiΔsasA(U/mL) Δ6Δacfi(U/mL)
氨肽酶 13986 9516
碱性蛋白酶 29472 21202
本发明通过提高发酵过程中菌株的活性来提高工业酶的产量，所选解淀粉芽孢杆菌底盘是举例，所选蛋白酶也是举例，而不是限制，本领域技术人员也可利用该方法敲除或弱化其它芽孢杆菌相关基因的表达水平，用于培养菌体、生产化合物、或者表达其它蛋白。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

Claims (7)

1.一种解淀粉芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌不表达解淀粉芽孢杆菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的出发菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.11218。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述双组分感觉组氨酸激酶sasA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌基因组上的六种胞外蛋白酶基因aprE，bpr，vpr，mpr，nprE，epr，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，sacB基因，和双组分感觉组氨酸激酶sasA基因被敲除。
5.一种生产氨肽酶的基因工程菌，其特征在于：在权利要求1所述基因工程菌的基础上，异源过表达氨肽酶基因ywaD。
6.一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：在权利要求1所述基因工程菌的基础上，异源过表达碱性蛋白酶基因aprE。
7.利用权利要求1-6任一项所述基因工程菌生产蛋白酶的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产蛋白酶；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述蛋白酶；其中，所述蛋白酶选自氨肽酶或碱性蛋白酶。
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