CN112438200A

CN112438200A - 一种鲜食葡萄的组织快繁方法

Info

Publication number: CN112438200A
Application number: CN201910801531.3A
Authority: CN
Inventors: 何非; 朱元娣; 王军; 张明悦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-03-05

Abstract

本发明涉及植物组织培养育苗技术领域，特别涉及一种鲜食葡萄的组织快繁方法。该方法包括如下步骤：取鲜食葡萄的休眠枝条，剪成单芽茎段，打破生理休眠，将单芽茎段水培至萌发，待新梢长度至10～20cm时采样，得到外植体；剪切外植体的顶端和基部伤口，接种于启始培养基中进行启始培养；待新梢长至5～6cm时，将新稍接种于增殖培养基中进行增殖培养，每40～50d继代一次，继代培养3～4代；选取组培苗进行炼苗、移栽。本发明的启始培养基可显著诱导鲜食葡萄的茎段长出新梢或丛生芽。本发明增殖培养基经过启始培养的新梢或丛生芽可经增殖培养同时萌芽和生根一步诱导成苗，只需配制一种增殖培养基，提高了繁殖效率。

Description

一种鲜食葡萄的组织快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养育苗技术领域，特别涉及一种鲜食葡萄的组织快繁方法。

背景技术

鲜食葡萄美味可口，营养丰富，优质的鲜食品种更是具有较高的经济价值。利用优质鲜食葡萄品种的快速繁殖技术可以在较短时间内大量获得无病毒苗木，驯化移栽技术可使组培苗用于田间种植，有利于较快获得优质的鲜食葡萄果实，增加经济效益。我国引进了多种优质的鲜食葡萄品种，广泛种植于我国多个葡萄产区。鲜食葡萄‘夏黑’是一个优良品种，欧美杂种葡萄，日本培育，果皮呈紫黑色，具有抗病、丰产、早熟、耐贮藏、口感好等特点。鲜食葡萄‘红宝石’是美国加利福尼亚州最先培育的晚熟无核品种，欧亚种葡萄，果皮呈***，果粒大。鲜食葡萄‘红地球’又名‘晚红’、‘红提’，从美国引入，果皮中厚，暗紫色，果肉硬脆，味甜。鲜食葡萄‘美人指’是日本植原葡萄研究所杂交育成的二倍体欧亚种，果粒细长形，先端***，光亮，基部稍淡，如染红指甲油的美女手指，外观漂亮，经济价值高。

欲通过组织培养技术快速繁殖鲜食葡萄，需要选取合适的外植体材料，设置适当的培养基组分及植物生长调节剂浓度，并给予其适宜的温度、光照培养条件。在驯化移栽组培苗的过程中，需要经过炼苗过程，使组培苗逐渐适应大田环境，提高移栽成活率。

以鲜食葡萄‘巨峰’为例，组培快繁技术中需挑选生长健壮、无病虫害的“巨峰”葡萄植株当年新生的嫩梢，剪取4cm长的带芽茎段。并将取得的茎段用流水冲洗20min，再将茎段依次于70～75％的酒精中浸泡30s、0.2％～0.3％的升汞浸泡3min、0.3％～0.5％次氯酸钠溶液浸泡5min，浸泡结束后，再用无菌水冲洗三次，每次30s。将消毒后的茎段简单修剪后，留取2cm左右的带芽茎段依次经分化培养MS+GA₃ 0.3mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L、增殖培养MS+GA₃ 0.3mg/L+6-BA 0.3mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L、生根培养1/2MS+IAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L后，获得葡萄组培苗。

然而，在现有鲜食葡萄组培快繁技术中，以新梢为外植体材料，取材受到季节的限制，且消毒外植体的消毒剂升汞有毒性，实际操作不方便。在增殖培养中，其分化、增殖和生根培养基成分不同，操作不便，也没有给出驯化移栽组培苗的完整解决方案，不能使诱导得到的组培苗直接应用于田间种植。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鲜食葡萄的组织快繁方法。该方法的应用不受时间和季节的限制，且可以大大提高组培苗移栽至田间的成活率，提升大规模田间育苗的效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鲜食葡萄的组织快繁方法，该方法包括如下步骤：

取鲜食葡萄的休眠枝条，剪成单芽茎段，打破生理休眠，将单芽茎段水培至萌发，待新梢长度至10～20cm时采样，剪切为4～6cm的茎段，消毒，得到外植体；

剪切外植体的顶端和基部伤口，接种于启始培养基中进行启始培养；启始培养基为含有IBA 0.1～0.3mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.2～0.8mg/L、腺嘌呤2.0～6.0mg/L、蔗糖25～35g/L、琼脂8～9g/L的MS培养基；

待新梢长至5～6cm时，将新稍接种于增殖培养基中进行增殖培养，每40～50d继代一次，继代培养3～4代；增殖培养基为含有IBA 0.1～0.3mg/L、蔗糖25～35g/L、琼脂6～7g/L的WPM培养基；

继代培养后，选取株高≥5cm、根系长度≥3cm、不定根≥3的组培苗进行炼苗、移栽。

在本发明中，鲜食葡萄为夏黑、红宝石、红地球或美人指。

作为优选，单芽茎段的芽上端为平口，距芽2～3cm，下端为斜口，距芽3～4cm。

作为优选，打破生理休眠的条件为：经44～46℃水浴处理85～95min。

优选地，打破生理休眠的条件为：经45℃水浴处理90min。

作为优选，水培为：利用泡沫板将单芽茎段漂浮在水中培养，3～4d换一次水，培养30～40d；水培的光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14～16h，温度为25±2℃。

作为优选，消毒的程序为：将茎段清洗干净，用75％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2～3次；再用质量体积百分浓度为0.3％～0.5％的次氯酸钠溶液浸泡15～20min，无菌水冲洗4～5次，去除茎段表面水分。

优选地，再用质量体积百分浓度为0.4％的次氯酸钠溶液浸泡20min。

作为优选，启始培养基为含有IBA 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、KT 0.5mg/L、腺嘌呤4.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8.2g/L的MS培养基。

作为优选，增殖培养基为含有IBA 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5～7g/L的WPM培养基。

作为优选，启始培养的条件为光强30～40μmol·m^-2·s^-1、光照时间14～16h，温度为25±2℃。

作为优选，增殖培养的条件为光强30～40μmol·m^-2·s^-1、光照时间14～16h，温度为25±2℃。

作为优选，炼苗为：在温室条件下，将组培苗置于Hoagland半营养液中，覆膜培养6～8d，再用Hoagland全营养液培养6～8d，之后揭膜炼苗1～2周。

优选地，炼苗为：在温室条件下，将组培苗置于Hoagland半营养液中，覆膜培养7d，再用Hoagland全营养液培养7d，之后揭膜炼苗1～2周。

作为优选，移栽为：炼苗后，将组培苗移栽在覆盖有棚膜的营养基质中，营养基质由园土、泥炭基质、蛭石组成，园土、泥炭基质、蛭石的体积比为1：1：1；逐步掀开棚膜，光照强度控制在90～180μmol·m^-2·s^-1，温度控制在20℃～28℃；移栽后第4周去掉棚膜，将组培苗定植于田间。

本发明提供了一种鲜食葡萄的组织快繁方法。该方法包括如下步骤：取鲜食葡萄的休眠枝条，剪成单芽茎段，打破生理休眠，将单芽茎段水培至萌发，待新梢长度至10～20cm时采样，剪切为4～6cm的茎段，消毒，得到外植体；剪切外植体的顶端和基部伤口，接种于启始培养基中进行启始培养；启始培养基为含有IBA 0.1～0.3mg/L、6-BA 0.5～1.5mg/L、KT 0.2～0.8mg/L、腺嘌呤2.0～6.0mg/L、蔗糖25～35g/L、琼脂8～9g/L的MS培养基；待新梢长至5～6cm时，将新稍接种于增殖培养基中进行增殖培养，每40～50d继代一次，继代培养3～4代；增殖培养基为含有IBA 0.1～0.3mg/L、蔗糖25～35g/L、琼脂6～7g/L的WPM培养基；继代培养后，选取株高≥5cm、根系长度≥3cm、不定根≥3的组培苗进行炼苗、移栽。本发明具有的技术效果为：

(1)本发明以休眠枝条经水培后的新梢为外植体材料，利用温水浴打破枝条休眠后水培促发萌芽，降低了从田间直接取材带来的组培实验污染风险，并且扩大了取材的时间范围，使取材更方便。

(2)本发明采用75％的乙醇和低浓度次氯酸钠(0.3％～0.5％)溶液作为组培实验外植体的消毒剂，毒性低，浓度合适，且消毒效果好，降低了消毒操作的难度。

(3)本发明的启始培养基为MS+IBA 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+腺嘌呤4.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.2g/L，诱导鲜食葡萄的茎段长出新梢或丛生芽。

(4)本发明增殖培养基为WPM+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L，经过启始培养的新梢或丛生芽可经增殖培养同时萌芽和生根一步诱导成苗，只需配制一种增殖培养基，提高了繁殖效率。

(5)本发明在驯化移栽前需使组培苗经过Hoagland营养液水培炼苗的过程，操作简单，水培成活率高，在80％以上，使组培苗逐渐适应后续驯化移栽环境，增加移栽成活率。

(6)本发明在驯化移栽时将经水培炼苗的组培苗移栽到营养钵中，并通过逐步揭开简易棚膜降低环境湿度、逐步增加光照等手段，使组培苗逐步适应低湿、强光的环境，以达到组培苗的移栽成活率在85％以上的效果。

具体实施方式

本发明公开了一种鲜食葡萄的组织快繁方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

外植体(explants)：植物组织培养所利用的植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓布细胞、胚乳等)或细胞以及原生质体，称为外植体。

污染(contamination)：培养基或培养材料生长有真菌或细菌等微生物的现象。

灭菌(sterilization)：通过物理、化学及理化方法杀灭一切微生物(包括孢子等)的过程。

外植体褐化(explant browning)：在离体培养中，外植体受表面消毒剂伤害和剪切损伤，外观褐变，严重时死亡。

启始培养(initiation culture)：把灭过菌的外植体接种于无菌培养基上，外植体成活后在适宜的培养条件下诱导出愈伤组织或不定芽的培养过程。

增殖培养(multiplication subculture)：将培养材料(繁殖体)周期性的分株，分割后转接入新鲜培养基中继续培养的过程，也称为继代培养。

增殖系数(propagation coeffecient)：一个培养周期内试管苗增殖的倍数，即1个繁殖体培养一个周期后的平均增殖个数。

组培苗(plantlet)：利用植物组织、器官或细胞等作为外植体，采用植物组织培养技术获得的根、茎、叶俱全的完整植株。

炼苗(plantlet hardening)：无菌组培苗从培养室内移至室外近自然环境中培养，提高苗木的木质化程度以及对外部环境(自然光照和温湿度变化)适应能力的过程。

驯化(aclimatization)：组培苗改变自身生长状态，以适应外部环境(自然光照和温湿度变化)，使之成活的过程。

移栽(transplanting)：驯化后的组培苗种植至基质中，在温室或其他保护设施条件，逐渐适应自然条件下的过程。

MS培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐(硝酸盐)和离子浓度较高，广泛应用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养。

WPM(woody plant medium)培养基是低盐培养基，1981年由Lloyd和McCown为山月桂(Kalmia latifolia)茎尖培养而设计的，广泛应用于木本植物培养。与MS培养基相比，WPM大量元素的使用浓度低，降低了NH4⁺、NO3^-浓度，用硫酸钾代替硝酸钾，硝酸铵浓度相当于1/4MS的浓度。减少了微量元素的种类。

植物生长调节物质是人工合成的植物激素类物质，如生长素类的IAA、IBA、NAA、2,4-D，赤霉素类的GA3，细胞***素类的KT、6-BA、TDZ、ZT等。

霍格兰德(Hoagland)营养液由Hoagland和Arnon 1938年研发，1950年完成改良，适宜大多数植物的水培。各类元素的使用浓度为N 210ppm(mg/L)、K 235ppm、Ca 200ppm、P31ppm、S 64ppm、Mg 48ppm、B 0.5ppm、Fe 1～5ppm、Mn 0.5ppm、Zn 0.05ppm、Cu 0.02ppm和Mo 0.01ppm。在此基础上，可对不同作物进行培养液配方改良。下表为本发明使用的改良营养液成分。

表1改良Hoagland全营养液成分和用量

本发明提供的鲜食葡萄的组织快繁方法中所用培养基、材料、基质均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

(1)外植体采集

采集无病毒鲜食葡萄‘夏黑’的健壮休眠枝条，将休眠枝条剪成单芽茎段，芽上端为平口，距芽2～3cm，下端为斜口，距芽3～4cm。经45℃恒温水浴处理90min打破生理休眠，利用泡沫板将单芽茎段漂浮在清水中培养，3～4d换一次水，培养30～40d后萌芽。培养环境为光强30～40μmol·m^-2·s^-1(或2000Lx～3000Lx)、光照时间14～16h，温度为25±2℃。待新梢长度至10～20cm时采样，剪切为5cm的茎段作为外植体材料。

(2)外植体表面消毒

将茎段先放入容器中用洗洁精浸泡5～10min，然后流水冲洗2～3h，最后用蒸馏水冲洗，再转至超净工作台内。在超净工作台内，用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗2～3次；再用低浓度次氯酸钠(0.3％～0.5％)溶液长时间(15～20min)消毒，无菌水冲洗4～5次，最后用灭菌的滤纸吸除茎段表面多余水分，接种备用。

(3)外植体接种

在无菌的接种器皿中，剪切外植体的新梢顶端和基部伤口，减轻消毒剂对伤口和幼嫩梢尖的影响，并接种于启始培养基上，培养3d后，将无污染、无褐化的外植体重新剪切成单芽茎段，转接在启始培养基上。每100ml培养瓶内均匀接种小芽或单芽3～4株。

(4)启始培养

启始培养基为MS+IBA 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L+腺嘌呤4.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.2g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min后使用。启始培养环境为光强30～40μmol·m^-2·s^-1(或2000Lx～3000Lx)、光照时间14～16h，温度为25±2℃。

接种后的10～15d茎段腋芽萌发，当新梢长至5～6cm(约30d)时可以进行继代增殖培养。

(5)增殖培养

将初代培养诱导形成的新梢或丛生芽，接种到增殖培养基上培养，每40～50d继代一次。增殖培养基为WPM+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min后使用，具有萌芽和生根的双重作用，可以使新梢或丛生芽一步成苗。培养环境同启始培养。‘夏黑’的二代增殖系数为2.4，同时萌芽生根，且植株生长旺盛，叶片嫩绿，茎部粗壮，生长迅速，根系发达且主根密度较大，叶片和根系无褐化情况。

(6)水培炼苗

组培苗每代培养35～40d，继代培养3～4代后，选取培养到株高≧5cm、根系长度≧3cm、不定根≧3的组培苗，水洗清除根部培养基后，使其固定在泡沫漂浮育苗穴盘上(育苗穴盘使用前需先用0.1％高锰酸钾溶液浸泡4h，再用清水清洗干净后使用)。在温室自然散射光条件下，将组培苗穴盘放在透明的塑料箱中，用改良的Hoagland半营养液(大量元素减半)覆膜培养1周，再用改良Hoagland全营养液培养1周，之后揭膜炼苗1～2周。去膜时注意观察组培苗是否萎蔫，若2h后仍不萎蔫则去膜培养。每周需更换营养液。‘夏黑’水培成活率为87.1％。

(7)驯化移栽

水培炼苗后，将组培苗移栽在营养钵中，立竹签并绑缚幼苗。营养钵(12×12)中加入体积按园土：泥炭基质：蛭石＝1：1：1的比例混匀的培养基质。在营养钵周围搭建简易棚膜，移栽初期需保持100％相对湿度，不定时通风换气；1～2周后棚膜四周掀开，浮动覆盖，既保湿又通气；当第一片新叶完全张开后，逐渐打开薄膜以降低湿度。培养期间适当浇水保持土壤湿度，后期控水，防止烂根。光照强度控制在90μmol·m^-2·s^-1～180μmol·m^-2·s^-1(5000Lx～10000Lx)，温度控制在20℃～28℃。移栽后第4周去掉覆盖物，将组培苗定植于田间。‘夏黑’移栽成活率为92.9％。。

对比例1

除增殖培养基配方不同外，其它步骤同实施例1。该对比例增殖培养基：WPM+IBA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L，增殖系数为2.3，且植株生长势弱，几乎无根系产生。

实施例2：

采集无病毒鲜食葡萄‘红宝石’的休眠枝条，水培处理休眠枝条、外植体表面消毒、外植体接种及启始增殖培养条件同实例一。增殖培养中，培养基条件为WPM+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L时‘红宝石’的二代增殖系数为4.7，同时萌芽生根，根系发达且主根密度较大，叶片和根系无褐化情况；水培炼苗、驯化移栽步骤同实例一，红宝石’的水培成活率为92.0％，移栽成活率为92.9％。

对比例2

除增殖培养基配方不同外，其它步骤同实施例2。该对比例增殖培养基为WPM+IBA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L时，增殖系数为1.9。

实施例3：

采集无病毒鲜食葡萄‘红地球’的休眠枝条，水培处理休眠枝条、外植体表面消毒、外植体接种及启始增殖培养条件同实例一。增殖培养中，培养基条件为WPM+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L时‘红地球’的二代增殖系数为3.3，同时萌芽生根，根系发达且主根密度较大，叶片和根系无褐化情况；水培炼苗、驯化移栽步骤同实例一，‘红地球’的水培成活率为93.3％，移栽成活率为96.5％。

对比例3

除增殖培养基配方不同外，其它步骤同实施例3。该对比例增殖培养基为WPM+IBA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L时，增殖系数为2.0。

实施例4：

采集无病毒鲜食葡萄‘美人指’的休眠枝条，水培处理休眠枝条、外植体表面消毒、外植体接种及启始增殖培养条件同实例一。增殖培养中，培养基条件为WPM+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L时‘美人指’的二代增殖系数为2.9，同时萌芽生根，根系发达且主根密度较大，叶片和根系无褐化情况；水培炼苗、驯化移栽步骤同实例一，‘美人指’的水培成活率为80.0％，移栽成活率为85.4％。

对比例4

除增殖培养基配方不同外，其它步骤同实施例4。该对比例增殖培养基为WPM+IBA0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5～7g/L时，增殖系数为3.0，但植株生长势弱，几乎无根系产生。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种鲜食葡萄的组织快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述单芽茎段的芽上端为平口，距芽2～3cm，下端为斜口，距芽3～4cm。

3.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述打破生理休眠的条件为：经44～46℃水浴处理85～95min。

4.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述水培为：利用泡沫板将单芽茎段漂浮在水中培养，3～4d换一次水，培养30～40d；水培的光强为30～40μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14～16h，温度为25±2℃。

5.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述启始培养基为含有IBA0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、KT 0.5mg/L、腺嘌呤4.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8.2g/L的MS培养基。

6.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述增殖培养基为含有IBA0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5～7g/L的WPM培养基。

7.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述启始培养的条件为光强30～40μmol·m^-2·s^-1、光照时间14～16h，温度为25±2℃；

所述增殖培养的条件为光强30～40μmol·m^-2·s^-1、光照时间14～16h，温度为25±2℃。

8.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述炼苗为：在温室条件下，将组培苗置于Hoagland半营养液中，覆膜培养6～8d，再用Hoagland全营养液培养6～8d，之后揭膜炼苗1～2周。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组培快繁方法，其特征在于，所述移栽为：炼苗后，将组培苗移栽在覆盖有棚膜的营养基质中，营养基质由园土、泥炭基质、蛭石组成，园土、泥炭基质、蛭石的体积比为1：1：1；逐步掀开棚膜，光照强度控制在90～180μmol·m^-2·s^-1，温度控制在20℃～28℃；移栽后第4周去掉棚膜，将组培苗定植于田间。