CN103109744A

CN103109744A - 一种葡萄试管内集成脱毒方法

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Publication number: CN103109744A
Application number: CN2013100744498A
Authority: CN
Inventors: 顾地周; 顾川岳; 陆爽; 姜云天; 朱俊义; 杨丽娟; 潘雨; 禚玲玲; 张学士; 王秋爽; 付航; 倪伟佳
Original assignee: Tonghua Normal University
Current assignee: Tonghua Normal University
Priority date: 2013-03-10
Filing date: 2013-03-10
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2033-03-10
Also published as: CN103109744B

Abstract

本发明涉及一种葡萄试管内集成脱毒方法，属于植物繁殖技术。其步骤如下：（1）将葡萄休眠枝条水培促使休眠芽萌发生长，处理后的茎尖作为外植体备。（2）将切取的葡萄茎尖接种至附加吲哚丁酸0.08～0.13mg·L^-1和赤霉素2.20～3.30mg·L^-1，添加食用白糖5g·L^-1，琼脂条8.0g·L^-1的基本培养基中进行脱除葡萄扇叶病毒和卷叶病毒培养；（3）培养温度控制在45～48℃，培养时间51～57d。（4）当茎尖生长至1.0cm时，即可切割0.03～0.05cm的茎尖进一步开展无毒苗培养。葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除率达100.0%；无毒苗成活率达97.0%以上。可直接应用于葡萄品种脱毒种苗的工厂化生产。

Description

一种葡萄试管内集成脱毒方法

技术领域　

本发明涉及一种葡萄试管内集成脱毒方法，属于植物繁殖技术。

背景技术

在现有技术中，葡萄（Vitis vinifera）为葡萄科葡萄属落叶藤本植物，是当今世界上人们喜食的第二大果品，在全世界的果品生产中，葡萄的产量及栽培面积一直居于首位。葡萄具有解除疲劳、抗毒杀菌、改善过敏症状、抗贫血、调养肠胃、利胆、利尿消肿、安胎、美容养颜、补益和兴奋大脑神经等功效。葡萄不仅在食用和药用方面价值高，而且在酿酒行业中具有极大的经济和社会效益。

由于栽培种葡萄苗都是通过无性繁殖获得，葡萄中的病毒会随同无性繁殖材料传播扩散，因此无性繁殖数量越大，病毒传播速度也越快。经过几年的栽培后，由于受病毒的影响，导致葡萄光合作用急剧下降，造成葡萄大幅度减产和葡萄果实质量降低，发病严重时可导致绝收。经调查发现，葡萄病毒病有几十种之多，其中葡萄扇叶病毒(Grapevine FanLeaf Virus，简称GFLV)和葡萄卷叶病毒(Grapevine Leafroll Associated Virus，简称GLRaV)导致的葡萄病毒病在栽培种葡萄和野葡萄发病率较高且具有普遍性。

目前，葡萄脱毒大多采用单一的茎尖组培脱毒、单一的热处理、单一微米型嫁接和分生组织培养等方法进行脱毒，尽管脱毒效果较好，但茎尖、微米型嫁接和分生组织培养脱毒需要材料微小，需在显微镜下完成部分工作；而热处理因葡萄植株在高温条件下，湿度和光照等不易控制会导致葡萄植株生长异常，活力下降且不适合大量生产，以上脱毒方法存在步骤繁琐、脱毒效果差、可操作性难等缺点。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种方法简单、操作方便、效果好的的葡萄试管内集成脱毒方法。

本发明的技术解决方案是：一种葡萄试管内集成脱毒方法，其步骤如下：

（1）将葡萄休眠枝条水培促使休眠芽萌发生长，处理后的茎尖作为外植体备。

（2）将切取的葡萄茎尖接种至附加吲哚丁酸0.08～0.13 mg·L^-1和赤霉素2.20～3.30 mg·L^-1，添加食用白糖5 g·L^-1，琼脂条8.0 g·L^-1的基本培养基中进行脱除葡萄扇叶病毒和卷叶病毒培养；所述的基本培养基成份及使用用量为：183 mg·L^-1NH₄NO₃，100 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，87 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，436 mg·L^-1KH₂PO₄；9.2mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，12.5 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；3.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，1.7 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，2.2 mg·L^-1H₃BO₃，0.025 mg·L^-1CuSO₄·5H₂O，0.15 mg·L^-1KI；0.5 mg·L^-1烟酸，5.8 mg·L^-1盐酸吡哆醇VB₆，37 mg·L^-1肌醇。优选吲哚丁酸0.08 mg·L^-1和赤霉素2.20 mg·L^-1。

（3）培养温度控制在45～48 ℃，培养51～57 d后，实现葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除。

（4）当茎尖生长至1.0 cm时，即可切割0.03～0.05 cm的茎尖进一步开展无毒苗培养。

步骤（1）中的处理是指待休眠芽长至5.0 cm时，将1.0 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡6 min，无菌水冲洗10次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后，将葡萄茎尖切取0.05～0.10 cm备用。

进行葡萄脱毒种苗快速繁殖；具体是在步骤（4）后待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留1叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述基本培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，实现成苗。

进行葡萄脱毒试管苗的炼苗和移栽；具体是待无毒茎段基部发出5～7条根且长至1.5 cm以上，苗高达3 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有质量百分比10%杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经二氯丙烷200 g/m²和溴甲烷75 g/m²消毒过的腐烂松针、田园土和细河砂＝2:2:1混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在20±2 ℃，每天自然光照12 h，每天中午适当揭开部分塑料薄膜进行通风换气20～30 min，7 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达97.0%以上。

本发明的优点是：1、本发明针对以上方法中的不足，在光照和保湿的葡萄正常生长条件下，通过筛选确定影响脱毒率的培养基、培养温度、培养时间及茎尖大小等因素的最佳范围后，在试管内利用相对较大的茎尖进行热处理的集成脱毒方法，避免了以往单一方法脱毒的种种不足、可操作性差、脱毒率低等难点。具有方法简单、操作方便的特点。本发明可直接应用于葡萄脱毒苗的工厂化生产。2、葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除率达100.0%；无毒苗成活率达97.0%以上。3、本发明可直接应用于威代尔葡萄或其它葡萄品种脱毒种苗的工厂化生产，为葡萄标准化和规模化无公害栽培生产提供优质脱毒种苗。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

具体实施方式

葡萄试管内集成脱毒方法：

1 材料与方法

1.1 葡萄品种、来源及处理

葡萄品种为威代尔（Vidal），属于白色葡萄品种类，是白玉霓（Ugni blanc）和白谢瓦尔（Seyval Blanc）的杂交后代，在法国称为Vidal Blanc或Vidal 256，在加拿大与美国东部有大量种植,是一耐寒品种是加拿大酿造典型冰葡萄酒的主要原料品种之一。该品种具有十分耐寒，果皮厚，不易腐烂，易保存，产量高，抗病强等特点，含糖量高（30～34%）。其休眠枝条采自吉林省葡萄种植区。将休眠枝条水培促使休眠芽萌发生长，待休眠芽长至5.0 cm时，将1.0 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡6 min，无菌水冲洗10次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后作为外植体备用。

1.2 威代尔葡萄病毒完全脱除的茎尖长度、培养温度和培养时间筛选

基本培养基成份及使用用量：183 mg·L^-1NH₄NO₃，100 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，87 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，436 mg·L^-1KH₂PO₄；9.2mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，12.5 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；3.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，1.7 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，2.2 mg·L^-1H₃BO₃，0.025 mg·L^-1CuSO₄·5H₂O，0.15 mg·L^-1KI；0.5 mg·L^-1烟酸，5.8 mg·L^-1盐酸吡哆醇VB₆，37 mg·L^-1肌醇。基本培养基中附加吲哚丁酸IBA0.08～0.13 mg·L^-1和赤霉素GA₃ 2.20～3.30 mg·L^-1，添加食用白糖5 g·L^-1，琼脂条8.0 g·L^-1，pH 6.0。将外植体材料嫩茎尖分别切割成0.30～0.50 cm的大小接种到培养基中，置于温度为30～42 ℃条件下，培养18～45 d过程中，每隔5天检测脱毒率。为了提高威代尔葡萄中葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒的脱除速度及脱毒率，采用均匀设计法设计实验，每个处理数接种茎尖数为10 个，重复3次取平均值，选用U₁₀(10³)均匀表，筛选威代尔葡萄中葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒全部脱除的最佳茎尖长度、培养温度和培养时间。

检测方法采用电子显微镜检测法(直观且速度快)，具体为利用负染色法(背景颜色采用苯胺黑)对脱毒处理的叶片进行染色，再将染色后的叶片制成40～60 nm的超薄切片，然后在电子显微镜下观察，观察被测叶片中是否有病毒颗粒子存在，以证明是否脱除病毒。脱毒率计算方法：脱毒率(%)=(无病毒茎尖数/接入茎尖总数)×100%。

1.3 威代尔葡萄脱毒苗的快繁和炼苗移栽

以全部脱毒的威代尔葡萄茎尖为材料，将无毒茎尖接种至附加吲哚丁酸IBA0.08～0.13 mg·L^-1和赤霉素GA₃ 2.20～3.30 mg·L^-1，添加食用白糖5 g·L^-1，琼脂条8.0 g·L^-1的基本培养基中，调节培养基pH至 6.0，在温度(26±2)℃，光照强度1400 lx，光照周期14 h·d^-1条件下培养。待茎尖生长至需要高度和茎尖基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留1叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养。培养一段时间后，待茎段生根和苗生长到一定高度时，统计计算出增殖周期和倍数。

待无毒茎段基部发出一定数量根且长至需要高度时，从培养瓶中取出试管苗，在含有杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经溴甲烷和二氯丙烷等消毒剂联合消毒过的腐烂松针、田园土和细河砂(2:2:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，每天注意自然光照，通风换气，待苗成活并开始生长后揭去薄膜，每天适当喷洒清水。注意防治线虫、长尾粉蚧、无花果粉蚧和橘粉蚧对葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒的传播。

2 结果与分析

2.1威代尔葡萄茎尖长度、培养温度和培养时间对葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒脱除的影响

表1 影响威代尔葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除主要因素的U₁₀(10³)试验设计与结果

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=75.5-104X ₁+0.707X ₂+0.453X ₃，样本容量Ｎ=10，显著性水平α=0.05，复相关系数Ｒ=0.9843，剩余标准差S＝2.5800，检验值F _t＝62.11﹥临界值F _(0.05,3,6)＝4.757，回归方程具有显著性。威代尔葡萄茎尖长度、培养温度和培养时间均对扇叶病毒和卷叶病毒脱除影响显著，说明威代尔葡萄茎尖长度、培养温度和培养时间均是影响扇叶病毒和卷叶病毒脱除不可缺少的主要因素。通过计算威代尔葡萄茎尖长度、培养温度和培养时间对扇叶病毒和卷叶病毒脱除的贡献值和贡献率可知，U ₁＝367，U ₁/U＝29.6%；U ₂＝67.4，U ₂/U＝5.44%；U ₃＝134，U ₃/U＝10.8%，说明3个因素对扇叶病毒和卷叶病毒脱除的贡献顺序为：威代尔葡萄茎尖长度>培养时间>培养温度，又因威代尔葡萄茎尖长度与脱毒率呈负相关，而培养温度和培养时间均与脱毒率呈正相关。所以，猜测威代尔葡萄茎尖长度低于0.30 cm，培养温度和培养时间分别超过42 ℃和45 d时，威代尔葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除率可能更高。为验证推测，又以威代尔葡萄茎尖长度为0.30、0.25、0.20、0.15、0.10和0.05 cm，培养温度为42、45、48、51、54、57和60 ℃，培养时间为45、48、51、54、57和60 d开展14个水平的验证试验，重复3次。结果发现，威代尔葡萄茎尖长度为(0.05～0.10 cm)、培养温度为(45～48 ℃)和培养时间为(51～57 d)时，威代尔葡萄中葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒脱除率最高，脱毒率达100.0%，均比表1所列10个处理的脱毒率高。

因此，将威代尔葡萄休眠枝条水培促使休眠芽萌发生长，待休眠芽长至5.0 cm时，将1.0 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡6 min，无菌水冲洗10次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后，将威代尔葡萄茎尖切取0.05～0.10 cm的，接种至附加吲哚丁酸IBA0.08～0.13 mg·L^-1和赤霉素GA₃ 2.20～3.30 mg·L^-1，添加食用白糖5 g·L^-1，琼脂条8.0 g·L^-1的基本培养基中进行脱除葡萄扇叶病毒和卷叶病毒培养，培养温度控制在45～48 ℃，培养51～57 d后，威代尔葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除率达100.0%。当茎尖生长至1.0 cm时，即可切割0.03～0.05 cm的茎尖进一步开展无毒苗培养。

2.2 威代尔葡萄脱毒种苗快速繁殖

根据1.3中方法，待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留1叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，成苗率可达99.8%。经过35 d的培养，每个小植株可切成7段，每瓶可接种10个茎段，每年可进行11次切割。

2.3 威代尔葡萄脱毒试管苗的炼苗和移栽

根据1.3中方法，待无毒茎段基部发出5～7条根且长至1.5 cm以上，苗高达3 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有10%杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经二氯丙烷（200 g/m²）和溴甲烷（75 g/m²）消毒过的腐烂松针、田园土和细河砂(2:2:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在(20±2) ℃，每天自然光照12 h，每天中午适当揭开部分塑料薄膜进行通风换气20～30 min，7 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达97.0%以上。平时注意防治线虫、长尾粉蚧、无花果粉蚧和橘粉蚧对葡萄扇叶病毒和葡萄卷叶病毒的传播。

那么，年生产威代尔葡萄脱毒苗数为：∑年产脱毒种苗=(8×5¹²×99.8%×97.0%)株，可见本发明可直接应用于威代尔葡萄或其它葡萄品种脱毒种苗的工厂化生产，为葡萄标准化和规模化无公害栽培生产提供优质脱毒种苗。

Claims

1.一种葡萄试管内集成脱毒方法，其特征在于步骤如下：

（1）将葡萄休眠枝条水培促使休眠芽萌发生长，处理后的茎尖作为外植体备；

（2）将切取的葡萄茎尖接种至附加吲哚丁酸0.08～0.13 mg·L^-1和赤霉素2.20～3.30 mg·L^-1，添加食用白糖5 g·L^-1，琼脂条8.0 g·L^-1的基本培养基中进行脱除葡萄扇叶病毒和卷叶病毒培养；所述的基本培养基成份及使用用量为：183 mg·L^-1NH₄NO₃，100 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，87 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，436 mg·L^-1KH₂PO₄；9.2mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，12.5 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；3.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，1.7 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，2.2 mg·L^-1H₃BO₃，0.025 mg·L^-1CuSO₄·5H₂O，0.15 mg·L^-1KI；0.5 mg·L^-1烟酸，5.8 mg·L^-1盐酸吡哆醇VB₆，37 mg·L^-1肌醇；

（3）培养温度控制在45～48 ℃，培养51～57 d后，实现葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱除；

2.按照权利要求1所述的一种葡萄试管内集成脱毒方法，其特征在于步骤（1）中的处理是指待休眠芽长至5.0 cm时，将1.0 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡6 min，无菌水冲洗10次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后，将葡萄茎尖切取0.05～0.10 cm。

3.按照权利要求1或2所述的一种葡萄试管内集成脱毒方法，其特征在于进行葡萄脱毒种苗快速繁殖；具体是在步骤（4）后待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留1叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述基本培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，实现成苗。

4.按照权利要求3所述的一种葡萄试管内集成脱毒方法，其特征在于进行葡萄脱毒试管苗的炼苗和移栽；具体是待无毒茎段基部发出5～7条根且长至1.5 cm以上，苗高达3 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有10%杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经二氯丙烷200 g/m²和溴甲烷75 g/m²消毒过的腐烂松针、田园土和细河砂＝2:2:1混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在20±2 ℃，每天自然光照12 h，每天中午揭开部分塑料薄膜进行通风换气20～30 min，7 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达97.0%以上。

5.按照权利要求1所述的一种葡萄试管内集成脱毒方法，其特征在于步骤（2）中：吲哚丁酸0.08 mg·L^-1和赤霉素2.20 mg·L^-1。