CN109566417B

CN109566417B - 一种虫草参的组织培养方法

Info

Publication number: CN109566417B
Application number: CN201910072635.5A
Authority: CN
Inventors: 陶佩琳; 汪希强; 张旭东
Original assignee: Xuzhou Vocational College of Bioengineering
Current assignee: Xuzhou Vocational College of Bioengineering
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109566417A

Abstract

本发明的虫草参的组织培养方法建立了虫草参幼嫩茎段在离体条件下，通过诱导、扩繁、壮苗、生根等步骤得到商品试管苗的繁殖体系，缩短了繁殖周期，提高了增殖倍数，并使小苗生长状态一致、品质优良，不受季节限制，实现周年生产，实现了通过组织培养途径繁育优质虫草参商品种苗的方法。

Description

一种虫草参的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种虫草参的组织培养方法。

背景技术

虫草参，又叫地参，唇形科多年生草本植物。株高50-70cm，地下匍匐茎长5-6cm，形似虫草，粗如手指，洁白脆嫩，营养丰富，浑身是宝，不但能作为蔬菜食用，晒干后还能入药，保健作用和药用价值与冬虫夏草相当，具有良好的药食功能及市场效益。

近年来，随着人们对环境自然资源的疯狂索取，导致生态环境日益恶化以及农药的大量使用，传统虫草参几乎面临绝迹。虫草参在产业化生产上主要以无性繁殖方法——根茎繁殖为主，极易受到各种病毒等微生物侵害；生产中随着栽培时间的推移，病害加重，会导致植株减产，种质退化，严重的直接导致植株死亡。植物组织培养技术以其繁殖周期短、效率高、品质保存、管理可控等优势，已被广泛应用于国内外各种植物的繁殖研究。目前有关唇形科虫草参的组织培养研究还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术之不足，提供一种便于操作、效果良好的虫草参的组织培养方法。

本发明是以如下技术方案实现的：一种虫草参的组织培养方法，包括如下步骤：

（1）外植体的选择及预处理：选用虫草参健壮植株的幼嫩茎段作外植体，将叶片剪去后清洗除去表面污垢，再用流水冲洗30 min-1h后转移至超净工作台上备用；

（2）外植体表面消毒与诱导：将虫草参茎段用75％的乙醇处理10-20 s，再用0.1％氯化汞处理4-6 min，用无菌水冲洗5-7次，将茎段剪成1-2 cm的单芽茎段，接种于诱导培养基中；

（3）培养条件：将接种好的单芽茎段置于光照培养架上进行培养，控制温度为23-27℃，湿度为75％-85％，光照强度为2000-3000 lx，每日光照14 h；

（4）不定芽的分化与增殖：步骤（2）中的单芽茎段在步骤（3）的培养条件下，7-10天观察到不定芽的分化，待新生芽长到3-4cm时，将新生的不定芽剪下，转接至增殖培养基上继代；

（5）壮苗培养：增殖培养初步阶段，大量激素被用于促进不定芽的萌发。但同时，植株的生长发育和顶端优势也受到了一定影响。因此，壮苗培养十分必要。待新生丛芽长至3-4 cm高后，将其切下，接种至壮苗培养基中；

（6）生根培养：选取高3-4 cm，带2-3轮真叶的芽，接种至生根培养基上进行培养，一周后生根率达100%；

（7）炼苗移栽：待组培苗生根后时进行炼苗，在温度为20-25°C、光照强度2000lx，每日光照12 h的条件下，将培养瓶盖打开炼苗 3天；将炼苗后的组培苗小心去除根部培养基，并用质量分数为0. 125%多菌灵溶液清洗根部，种植于育苗钵内，成活率达90%以上。

其进一步是：上诉步骤（1）中外植体的采集在持续三天以上的晴朗天气进行。

上诉步骤（1）中采用洗衣粉水振荡的方法将外植体表面污垢清洗除去。

上诉步骤（2）中的诱导培养基和步骤（4）中增殖培养基的成分包括MS基本培养基、6-BA、NAA、活性炭，同时添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH为5.8。

6-BA的浓度为 0.5 mg/L、1.0 mg/L或2.0 mg/L中的一种， NAA的浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L或0.5 mg/L中的一种，活性炭的浓度为0或1.5 g/L。

步骤（5）壮苗培养基包括MS基本培养基、活性炭、NAA、蔗糖，琼脂7g/L，pH为5.8。

活性炭浓度为0、1.5 g/L或3.0 g/L中的一种，NAA的浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L或0.5 mg/L中的一种，蔗糖浓度为20 g/L、30 g/L或40 g/L中的一种。

步骤（6）生根培养基以MS或1/2MS作为基本培养基，附加浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L或0.5 mg/L的NAA，蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH为5.8。

步骤（7）中的育苗基质包括草炭、蛭石和珍珠岩，草炭、蛭石和珍珠岩以体积比2:1:1进行混合，放置于温室大棚内，控制温度为20-25°C，在自然光照下生长不低于10 天。

本发明具有以下优点：本发明的虫草参的组织培养方法实现了通过组织培养途径繁育优质虫草参商品种苗的方法，建立了虫草参幼嫩茎段在离体条件下，通过诱导、扩繁、壮苗、生根等步骤得到商品试管苗的繁殖体系，缩短了繁殖周期，提高了增殖倍数，使小苗生长状态一致、品质优良，且不受季节限制，实现周年生产。

附图说明

图1是本发明组培成功的虫草参试管苗的图片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的试验材料均为市售；各培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混合后，调节pH制成。

实施例1：

（1）外植体的取材及处理：以在学校基地引种成功的优质虫草参种苗为材料，于2018年4月12日，剪取生长旺盛、健康无病虫害的植株上的幼嫩茎段，将叶片部分修剪去除后带回实验室，用洗衣粉水振荡清洗10 min除去表面污垢，再用流水冲洗30 min后转移至超净工作台上备用。

（2）外植体表面消毒与诱导：将清洗后的幼嫩茎段用75％乙醇处理10 s，0.1％氯化汞消毒6 min后，用无菌水冲洗5-7次，将茎段剪成1-2 cm的单芽茎段，接种于诱导培养基中。培养基成分为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L，同时添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH为5.8。接种数量为30瓶，每瓶1个外植体。将接种好的材料置于光照培养架上培养，温度为(25士2)℃，湿度为75％-85％，光照强度为2000-3000 lx，每日光照14 h。

（3）不定芽分化与增殖：于2018年4月18日观察到侧芽有萌动迹象，4月20日双侧侧芽萌出，平均诱导率为68.91%。待新生芽长至5月10日，高约4 cm左右时，将其剪下，转接至增殖培养基上继代。培养基成分为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L，同时添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH为5.8。接种数量为30瓶，每瓶5个小芽。于接种后1个月即6月10日统计增殖率为72.16%，新生不定芽数量多，矮小，节间较短。

（4）壮苗培养：增殖培养初步阶段，大量激素被用于促进不定芽的萌发。但同时，植株的生长发育和顶端优势也受到了一定影响。因此，壮苗培养十分必要。将新生芽剪成单芽茎段，接种至壮苗培养基中。培养基成分为MS+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20g/L，琼脂含量7g/L，pH为5.8。10 d后观察发现芽的高度、茎粗均有增加。

（5）生根培养：将壮苗后的芽（高3-4 cm，带2-3轮真叶）接种至生根培养基上进行培养。生根培养基为MS+NAA 0.1 mg/L，添加蔗糖30 g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。约10 d后开始生根，根数较多，平均根数11.9，但多细弱，生根率达100%。

（6）炼苗移栽：待组培苗高度达到3-4 cm时，将其放在温度为20-25°C、光照强度2000 lx，每日光照12 h的条件下进行炼苗。之后将组培苗小心取出，去除根部培养基，并用质量分数为0. 125%多菌灵溶液清洗根部，种植于育苗钵内。所用基质为草炭：蛭石：珍珠岩的体积比为2:1:1的混合基质，放置于温室大棚内，控制温度为20-25°C，在自然光照下生长10 d左右，成活率达94.3%。

实施例2：

（1）外植体的取材及处理：于2018年7月4日，在学校基地引种的生长旺盛、健康无病虫害的虫草参植株上剪去幼嫩茎段，预处理方式同实施例1。

（2）外植体表面消毒与诱导：将清洗后的幼嫩茎段用75％乙醇处理10 s，0.1％氯化汞消毒4 min后，用无菌水冲洗5-7次，将茎段剪成1-2 cm的单芽茎段，接种于诱导培养基中。培养基成分为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+活性炭1.5 g/L，同时添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH为5.8。接种数量及培养条件同实施例1，不再赘述。

（3）不定芽分化与增殖：7月12日观察到大量侧芽萌出，平均诱导率为86.37%。待新生芽长至约4 cm高时，剪下接至增殖培养基上继代。培养基成分为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+活性炭1.5 g/L，其他成分及培养条件同实施例1。8月20日统计增殖率达84.16%，芽数量较多，细高，节间短。

（4）壮苗培养：将新生芽剪成单芽茎段，接种至壮苗培养基中。培养基成分为MS+NAA 0.2 mg/L+活性炭1.5 g/L +蔗糖30g/L。10 d后观察发现1.5 g/L活性炭的添加对平均芽高有明显的促进作用，芽的健壮度明显增加。

（5）生根培养：将壮苗后的芽（高3-4 cm，带2-3轮真叶）接种至生根培养基上进行培养。生根培养基为1/2MS+NAA 0.1 mg/L，添加蔗糖30 g/L，琼脂7g/L，pH为5.8。约7 d后开始生根，生根速度提高；数量多，平均根数达13.7，白色，较细弱，生根率达100%。

（6）炼苗移栽：炼苗及移栽方法同实施例1, 移栽后10 d统计成活率为91.8%。

实施例3：

（1）外植体的取材及处理：于2018年9月1日在学校基地剪去虫草生幼嫩茎段作外植体，预处理方式同实施例1。

（2）外植体表面消毒与诱导：将清洗后的幼嫩茎段用75％乙醇处理20 s，0.1％氯化汞消毒4 min后，用无菌水冲洗5-7次，将茎段剪成1-2 cm的单芽茎段，接种于诱导培养基中。诱导培养基成分、接种数量及培养条件同实施例2，不再赘述。

（3）不定芽分化与增殖：诱导一周后观察有侧芽萌出，平均诱导率为88.54%。将新生不定芽剪下继续进行增殖培养。培养基成分为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+活性炭1.5 g/L，其他成分及培养条件同实施例1。10月13日统计增殖率达90.37%，芽萌动快，数量多，叶大，粗高，节间短。

（4）壮苗培养：实施方法同实施例2。

（5）生根培养：将壮苗后的芽（高3-4cm，带2-3轮真叶）接种至生根培养基上进行培养。生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L，蔗糖、琼脂及pH同实施例2。约7 d后开始生根；数量较多，平均根数为9.6，白色，粗壮，生根率达100%。

（6）炼苗移栽：炼苗及移栽方法同实施例1, 移栽后10 d统计成活率为96.4%。

Claims

1.一种虫草参的组织培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

（5）壮苗培养：待新生丛芽长至3-4 cm高后，将其切下，接种至壮苗培养基中；

（6）生根培养：选取高3-4 cm，带2-3轮真叶的芽，接种至生根培养基上进行培养；

（7）炼苗移栽：待组培苗生根后进行炼苗，在温度为20-25°C、光照强度2000 lx，每日光照12 h的条件下，将培养瓶盖打开炼苗 3天；将炼苗后的组培苗小心去除根部培养基，并用质量分数为0. 125%多菌灵溶液清洗根部，种植于育苗钵内；

其中，上述步骤（2）中的诱导培养基和的成分为MS基本培养基+1.0mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0或1.5 g/L活性炭，同时添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH为5.8；

步骤（4）中增殖培养基的成分为MS基本培养基+1.0mg/L或2.0mg/L 6-BA+0.1 mg/L或0.2 mg/L NAA+0或1.5 g/L活性炭，同时添加蔗糖30g/L、琼脂7g/L，pH为5.8；

步骤（5）壮苗培养基为MS基本培养基+0或1.5 g/L活性炭+0.2 mg/L NAA+蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.8；蔗糖浓度为20 g/L、30 g/L或40 g/L中的一种；

步骤（6）生根培养基以MS或1/2MS作为基本培养基，附加浓度为0.1 mg/L、0.2 mg/L的NAA，蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH为5.8；

步骤（7）中的育苗基质为草炭、蛭石和珍珠岩，草炭、蛭石和珍珠岩以体积比2:1:1进行混合，放置于温室大棚内，控制温度为20-25°C，在自然光照下生长不低于10 天。

2.如权利要求1所述的一种虫草参的组织培养方法，其特征在于：上述步骤（1）中外植体的采集在持续三天以上的晴朗天气进行。

3.如权利要求1所述的一种虫草参的组织培养方法，其特征在于：上述步骤（1）中采用洗衣粉水振荡的方法将外植体表面污垢清洗除去。