CN113331059A

CN113331059A - 一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法

Info

Publication number: CN113331059A
Application number: CN202110824281.2A
Authority: CN
Inventors: 李岩; 陈雨露; 田维丽; 赵懿琛
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-07-21
Also published as: CN113331059B

Abstract

本发明公开了一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，包括以下步骤：采摘9~10月份中旬的种子，脱毒脱菌处理后，挑取种胚，接种至培养基进行萌发诱导培养；将幼苗的下胚轴切下，切成1 cm的小段外植体，接种至愈伤诱导及分化培养基上，待丛生芽长至2~3cm时，将丛生芽上切下，下端斜切，接种至壮苗培养基，选择比较健壮，且高度在4 cm的芽苗，将其下端斜切，用IBA无菌溶液浸泡斜切部位，接种，进行生根培养；选择植株较健壮的根长4 cm的植株整瓶移至温室炼苗5 d，用自来水洗净植株根部的培养基后移栽。本发明为珍稀茶树种质资源的离体保存提供无菌材料，也为后续茶树遗传转化和分子育种的开展提供技术参考。

Description

一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法。

背景技术

鸟王茶，拉丁学名为Camellia sinensis (L.)Kuntze var. niaowangensis Q.H.Chen，山茶科山茶属多年生异花授粉木本植物，又称鱼钩茶、云雾贡茶、仰望茶。是贵州山茶属中的新变种，其叶片较大、较薄；叶的侧脉下凹、并且呈皱纹状；花萼片被微毛、具有缘毛；叶柄长度在3~4 mm范围内。其花粉分为单粒和长球形，大粒花粉的极轴长度在50.23~52.41 μm范围内，并且其外壁光滑、萌发孔窄、内孔不明显。早春时节，茶树叶片颜色呈绿色、芽叶具有肥壮和持嫩性久的特点，用其制成的茶具有蜂蜜香、香气浓烈和汤色碧绿的优点。香气成分含有烃类、酯类、酸类、醇类等136种，而酯、酸、醇三类为主要成分。

近年来随着鸟王茶树在各地推广并广泛种植，市场上对规格一致、品质上乘的茶苗需求量大，然而茶树传统育种模式如种子繁殖在自然条件下种子萌发率较低，扦插育苗也存在育种周期长、扦插效率低且抗性资源少等不足。作为无性繁殖育苗手段，组织培养再生技术可实现优良品种工厂化培育和对种质资源进行改良，还能与其他生物技术如基因工程或原生质融合等手段相结合。因此对鸟王茶树建立再生体系成为目前迫切需要解决的关键技术。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，以鸟王茶种萌发的胚轴为材料，进行愈伤组织的诱导及植株再生，应用组培技术获得鸟王茶树完整再生植株并建立再生体系，为珍稀茶树种质资源的离体保存提供无菌材料，也为后续茶树遗传转化和分子育种的开展提供技术参考。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，包括以下步骤：

S1、预处理及消毒处理：采摘9~10月份中旬的种子，将种子进行脱毒脱菌处理；

S2、种胚萌发诱导：在超净工作台，挑取种子中的种胚，接种至萌发诱导培养基进行萌发诱导培养；

S3、丛生芽的诱导及培养：将萌发诱导培养基上的鸟王茶NW32幼苗的下胚轴切下，并切成1 cm左右的小段外植体，然后接种至愈伤诱导及分化培养基上进行愈伤组织及不定芽分化诱导培养；

S4、丛生芽壮芽培养：待丛生芽长至2~3cm左右时，从愈伤组织将丛生芽上切下，下端斜切，接种至壮苗培养基中进行壮苗培养；

S5、生根：选择壮苗培养基中比较健壮，且高度在4 cm左右的芽苗，将其下端斜切，用IBA无菌溶液浸泡斜切部位，接种至生根培养基中进行生根培养；

S6、移栽：选择生根培养基中，鸟王茶NW32植株较为健壮的根长4 cm左右的植株整瓶移至温室炼苗5 d，然后用自来水洗净植株根部的培养基，再移栽至基质配比为V_营养土:V_珍珠岩:V_蛭石=2:1:1中进行培养。

进一步地，所述步骤S1中，种子脱毒脱菌处理方法为：将采摘的种子置于添加有洗洁精的自来水中5 min，挑出漂浮在水面的种子，并搓掉种子表面的杂质，接着用5%多菌灵浸泡15 min,捞出，自来水冲洗干净，放入超净工作台，用75%的酒精消毒3 min，再用0.1%的升汞消毒15 min，用无菌水冲洗5次，无菌的吸水纸吸去表面水分。

进一步地，所述步骤S2中，萌发诱导培养基采用添加有1.5 mg.L^-1的GA3的MS基本培养基，pH=5.80，萌发培养基中培养45天。

进一步地，所述的步骤S3中，愈伤诱导及分化培养基为添加有4.0 mg.L^-1的6-BA和1.0 mg.L^-1的IBA 的MS基本培养基，pH=5.80，分化培养基中培养60天。

进一步地，所述的步骤S4中，壮苗培养基为添加有2.0 mg.L^-1的6-BA和0.8 mg.L^-1的IBA 的MS基本培养基，pH=5.80，壮苗培养基中培养45天。

进一步地，所述的步骤S5中，IBA无菌溶液的浓度为50.0 mg.L^-1，生根培养基为添加有1.5 mg.L^-1的IBA 的1/2 MS基本培养基，植株炼苗时间为5天。

进一步地，所述植物组织培养各个阶段，培养条件均为光照强度为2000 lx，每日光照12小时，培养温度(26±2)℃。

上述方案中，采用综合性状优良、全国推广茶树品种鸟王茶树胚轴为外植体，诱导丛生芽的再生，完善了鸟王茶树组培再生体系。通过上述研究，建立了高效的鸟王茶树组培再生体系，可为后续茶树遗传转化和分子育种的开展提供技术参考。

附图说明

图1为种胚萌发诱导在不同时间的长势；

图中：A. 种胚萌发诱导培养10 d长势；B. 种胚萌发诱导培养25 d长势；C. 种胚萌发诱导培养45 d长势；标尺均为1 cm。

图2为下胚轴诱导愈伤组织与芽分化培养不同时间的长势；

图中：A. 下胚轴诱导培养0 d长势；B. 下胚轴诱导培养60 d长势；C. 下胚轴诱导培养60 d的芽分化长势；除注释外，图中标尺均为1 cm。

图3下胚轴愈伤组织及不定芽生长培养的长势；

图中：A.鸟王茶NW32下胚轴外植体诱导的愈伤组织及不定芽；B.鸟王茶NW32愈伤组织及不定芽生长培养15 d；C. 鸟王茶NW32愈伤组织及不定芽生长培养30 d；图中标尺均为1 cm。

图4不定芽壮苗及生根与再生植株移栽培养长势；

图中：A.不定芽壮苗培养0 d长势；B. 不定芽壮苗培养45 d长势；C. 不定芽生根培养60 d长势；D. 不定芽生根培养60 d根的伸长情况；E. 再生植株移栽培养60 d长势；图中标尺均为1 cm。

图5鸟王茶NW32移栽及成活植株；

图中：A. 炼苗后清洗干净的生根植株；B. 移栽培养0 d长势；C. 移栽培养60 d长势；除注释外，图中标尺均为1 cm。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

材料

本实施例所使用的鸟王茶NW32茶树种植于贵州省贵定县云雾镇(东经107°6′35″,北纬26°12′56″)茶树资源圃内，以采自于3~4月份当年生新梢带腋芽茎段为外植体进行离体快繁体系建立。以9~10月份植株上的蒴果为材料，挑取种胚在无菌条件下萌发，再以种胚萌发幼苗的下胚轴和离体快繁体系中增殖诱导的无菌苗的茎段及叶片为外植体进行再生体系建立。该研究材料由贵州省农业科学院茶叶研究所惠赠。

方法

蒴果预处理及消毒处理

将新采摘的9~10月份鸟王茶NW32植株上的蒴果的果皮全部去除，然后取部分用于实验，其余部分保存备用。首先，将种子浸泡在添加有洗洁精的自来水中5 min，挑出漂浮在水面的种子，并搓掉种子表面的泥土等杂质。接着用浓度为0.50%多菌灵溶液浸泡15 min，然后置于自来水下细流冲洗1小时，最后置于超净台中，将75%消毒酒精处理1 min, 2 min,3 min和20%次氯酸钠处理10 min, 15 min, 20 min设计成正交试验，对种子进行消毒处理，各三水平，共九个处理组。培养20 d后，统计鸟王茶NW32种胚的存活数、污染数和死亡数，并计算出其存活率、污染率和死亡率，计算公式如下：

种胚存活率(%) = (种胚存活数/种胚接种数)×100%

种胚污染率(%) = (种胚污染数/种胚接种数)×100%

种胚死亡率(%) = (种胚死亡数/种胚接种数)×100%

种胚萌发诱导

在超净工作台中，将上述消毒处理好的种子置于无菌空皿中，用无菌吸水纸将其表面的水分吸干。在酒精灯附近，用无菌镊子与一次性手术刀片挑取鸟王茶NW32种子中的种胚，然后接种至添加有不同浓度GA₃的MS培养基中进行萌发诱导培养，培养45 d后，统计种胚的萌发数，并观察记录萌发幼苗的长势。最后计算出鸟王茶NW32种胚的萌发率，计算公式如下：

种胚萌发率(%) = (种胚萌发数/种胚接种数)×100%

愈伤组织及不定芽分化诱导

将萌发诱导培养基上的鸟王茶NW32幼苗的下胚轴切下，并切成1 cm左右的小段外植体，然后接种至添加有不同浓度的6-BA和IBA配比的MS培养基上进行愈伤组织及不定芽分化诱导培养。将离体快繁体系中增殖诱导的无菌苗的茎段和叶片为外植体接种至添加有不同浓度的6-BA、IBA或NAA配比的MS培养基上进行愈伤组织及不定芽分化诱导培养。先将外植体进行暗培养10 d后，再转移至光照培养。培养30 d后统计外植体的愈伤组织诱导数，继续培养至60 d后统计外植体的不定芽分化数。根据统计的数据计算出鸟王茶NW32外植体的愈伤组织诱导率和不定芽分化诱导率，计算公式如下：

外植体愈伤诱导率(%) = (外植体愈伤诱导数/外植体接种数)×100%

外植体不定芽分化诱导率(%) = (外植体芽分化诱导数/外植体接种数)×100%

愈伤组织及不定芽生长培养

将上述中诱导出不定芽的愈伤组织处理后，再接种至同样培养基中进行继续生长培养。培养30 d后观察记录不定芽的长势。

壮苗及生根诱导

将上述的不定芽从愈伤组织上切下，并且下端斜切。然后接种至含有不同浓度的6-BA和IBA的MS培养基中进行壮苗培养。壮苗培养45 d后，统计不定芽的株高，且观察记录植株的长势。计算出鸟王茶NW32不定芽的株高差，计算公式如下。

选择壮苗培养基中比较健壮，且高度在4 cm左右的芽苗，将其下端斜切。然后用50.00 mg/L IBA无菌溶液泡斜切部位5 min，最后接种至添加有不同浓度IBA的1/2MS培养基中进行生根培养。生根培养60 d后，统计不定芽的生根数，且观察记录植株的长势。计算出鸟王茶NW32不定芽的生根率，计算公式如下。

株高差(cm) = 培养45 d后不定芽的平均株高-接种时不定芽的平均株高

生根率(%) = (接种生根的总不定芽数/不定芽的总接种数)×100%

炼苗移栽

选择生根培养基中，鸟王茶NW32植株较为健壮的根长4 cm左右的植株整瓶移至温室炼苗5 d。然后用自来水洗净植株根部的培养基，再移栽至基质配比为V_营养土:V_珍珠岩:V_蛭石=2:1:1中进行培养。培养60 d后观察记录植株的长势。

培养条件

鸟王茶NW32外植体离体培养及再生体系建立培养的整个过程中，均以MS为基础培养基，其中MS粉为4.43 g/L、蔗糖为30.00 g/L、琼脂为8.00 g/L。其中生根诱导培养时，MS粉为2.22 g/L、植物凝胶为2.40 g/L。pH值在5.80~6.00之间，光照强度为2000 lx，温度为(24±2)℃，光照时间为12 h/d。

结果

Figure 5 The influence of the number of buds in differentinoculations of Bird King Tea NW32 on the induction of sub-generationproliferation

图5鸟王茶NW32不同接种芽数对诱导子代增殖的影响

FIG 5 birds inoculated Wang tea containing different numbers NW32 FIGbud proliferation induced by subculture on

图5接种含有不同数量NW32的旺茶的鸟类图。

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重试

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消毒时间对鸟王茶NW32种胚存活率的影响

不同组合消毒条件的处理时间的长短直接影响着外植体的存活率。结果表明：75%酒精与20%次氯酸钠组合的不同处理时间对鸟王茶NW32种胚的存活和污染率存在差异显著的影响(表1)。随着75%酒精和20%次氯酸钠处理时间的延长，鸟王茶NW32种胚的存活率先增加后降低，而污染率不断降低。当75%酒精浸泡处理3 min时，随着20%次氯酸钠处理时间的增加，鸟王茶NW32种胚的污染率变化不明显，最低为15.00%。但鸟王茶NW32种胚的存活率先增加后减小，最高为85.00%。死亡率共出现在四个处理组中，且没有什么变化规律，其中最高为1.33%，最低为0.26%。出现这样的原因有可能是操作不当以至于75%酒精与20%次氯酸钠对鸟王茶NW32种胚产生了伤害作用。因此，当75%酒精浸泡处理3 min，20%次氯酸钠处理15 min为最适的消毒组合处理条件。

表1 不同消毒时间对鸟王茶NW32种胚存活率的影响

注: 均值±标准偏差

表中的不同字母是在0.05水平下的显著性

不同浓度GA₃对鸟王茶NW32种胚萌发的影响

赤霉素是一类高效的植物生长调节剂，具有促进植物生长与发育的作用。GA₃是赤霉素中常用的一种调节剂，主要作用是促进细胞伸长，从而使植株茎干伸长及增高。结果表明：在MS培养基中附加不同浓度的GA₃均能有效的促进鸟王茶NW32种胚的萌发，缩短萌发时间，且存在差异显著的影响(表2)。当MS培养基中不添加 GA₃时，鸟王茶NW32种胚的萌发时间长，且萌发的时间不一致。当在MS培养基中附加不同浓度的GA₃时，鸟王茶NW32种胚的萌发时间均缩短。随着GA₃浓度的增加，鸟王茶NW32种胚的萌发率先增高后降低。同时，随着GA₃浓度的增加，种胚萌发后的长势也随之变差。根据鸟王茶NW32种胚的萌发率和培养过程中的长势得出：在MS培养基中添加1.50 mg/L GA₃时，种胚的萌发率较高为86.67%，长势好、下胚轴长，并且萌发过程中未见胚死亡(图1A-C)。因此，培养基MS+1.50 mg/L GA₃是鸟王茶NW32种胚萌发的最适萌发培养基。

表2 不同浓度GA₃对鸟王茶NW32种胚萌发的影响

注: 均值±标准偏差

表中不同字母是在0.05 水平下的显著性

不同生长调节剂配比对鸟王茶NW32胚轴愈伤及芽分化的影响

木本植物的愈伤组织及不定芽分化诱导培养一般是在同一个培养基中进行，在诱导愈伤组织的同时也在诱导不定芽的分化。因此选择合适的培养基是诱导不定芽的关键条件。选择长势较好的鸟王茶NW32萌发幼苗，将其下胚轴切下，再切成1 cm左右长的小段作为愈伤组织及不定芽分化诱导的外植体，然后将外植体接种至添加有不同浓度的6-BA与IBA的MS培养基中进行培养(图2A)。结果表明：不同浓度的6-BA与IBA对鸟王茶NW32愈伤组织的平均诱导率很高，并且存在差异不显著的影响；而对于不定芽的平均分化诱导率很低，且存在差异显著的影响(表3)。

表3同浓度6-BA与IBA配比对鸟王茶NW32下胚轴愈伤组织及不定芽分化的影响

注: 均值±标准偏差

表中的不同字母是在0.05水平下的显著性

当在基础培养基MS培养基中添加的6-BA浓度一定时，随着IBA浓度使用量的增加，外植体的愈伤组织诱导率先增加后减少。当6-BA的浓度为4.00 mg/L，IBA浓度为1.00 mg/L时，鸟王茶NW32下胚轴的愈伤组织诱导率最高为95.28%。因而获得以鸟王茶NW32下胚轴为外植体进行愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+4.00 mg/L 6-BA+1.00 mg/L IBA。同理，当在基础培养基MS培养基中添加的6-BA浓度一定时，随着IBA浓度使用量的增加，鸟王茶NW32下胚轴外植体的不定芽分化诱导率先不断增加后减少。6-BA浓度的使用量为4.00 mg/L，IBA浓度的使用量为1.00 mg/L时，鸟王茶NW32下胚轴的不定芽分化率最高为23.33%。当培养至45 d后，有的愈伤组织已开始分化出不定芽，继续培养至60 d时，没有分化的愈伤组织还是未分化，甚至部分愈伤组织产生了褐化现象(图2B)，分化出来的不定芽苗弱小，只有部分叶片，而无明显的茎段(图2C)，因此需要继续培养才有利于下一步实验。因此初步获得以鸟王茶NW32下胚轴为外植体进行不定芽分化的最佳培养基为MS+4.00 mg/L 6-BA+1.00 mg/LIBA。

不同生长调节剂配比对无菌苗茎段及叶片愈伤组织诱导的影响

选择鸟王茶NW32离体快繁体系中继代增殖培养的幼嫩芽苗，将其嫩茎段与叶片切下作为外植体，然后将其接种至添加有不同浓度的6-BA与IBA或NAA的MS培养基中进行培养。结果表明：不同浓度的6-BA与IBA对鸟王茶NW32茎段的愈伤组织诱导率存在差异显著的影响(表4)。当在基础培养基MS培养基中添加的6-BA浓度一定时，随着IBA浓度使用量的增加，外植体的愈伤组织诱导率先持续增加，当IBA浓度使用量增加至一定浓度后，外植体的愈伤组织诱导率先增加后减少。当6-BA的浓度为9.00 mg/L，IBA浓度为6.00 mg/L时，鸟王茶NW32茎段的愈伤组织诱导率最高为99.33%，且愈伤组织长势好。因而获得以鸟王茶NW32茎段为外植体进行愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+9.00 mg/L 6-BA+6.00 mg/L IBA。

鸟王茶NW32组培苗叶片外植体进行愈伤组织诱导时，不同浓度的6-BA与NAA对外植体的愈伤组织诱导率的影响差异明显不显著(表5)。当在基础培养基MS培养基中添加的6-BA浓度一定时，随着NAA浓度使用量的增加，鸟王茶NW32叶片外植体的愈伤组织诱导率先持续增加，当IBA浓度使用量的增加至一定浓度后，外植体的愈伤组织诱导率先增加后又减少。6-BA浓度的使用量为3.00 mg/L，NAA浓度的使用量为9.00 mg/L时，鸟王茶NW32叶片的愈伤组织诱导率最高为96.00%，并且其长势较好。当继续培养至60 d后，有的愈伤组织已开始产生褐色物质，且仍未见不定芽的分化。因而只获得以鸟王茶NW32叶片为外植体进行愈伤组织诱导的最适培养基为MS+3.00 mg/L 6-BA+9.00 mg/L NAA。

表4不同生长调节剂配比对茎段愈伤组织诱导率的影响

注: 均值±标准偏差

表中的不同字母是在0.05水平下的显著性

表5不同生长调节剂配比对叶片愈伤组织诱导率的影响

注: 均值±标准偏差

表中的不同字母是在0.05水平下的显著性

生长培养对不定芽长势的影响

鸟王茶NW32下胚轴外植体经过愈伤组织及不定芽分化诱导培养出不定芽非常弱小，并且只有大部分叶片，而几乎没有茎段。如果将其直接接种至壮苗培养基中进行壮苗培养，则再生出来的不定芽易死亡。如果将其置之不理继续在原来的培养基上进行培养，不定芽变化不大，且生长缓慢，可能是由于培养基中的营养成分和生长调节剂已消耗殆尽。因此，在营养成分和生长调节剂已消耗殆尽的培养基上挑取附着有不定芽的愈伤组织(图3A)，然后再接种至新配制的同样培养基进行生长培养。培养15 d后，不定芽明显长长，且长势好(图3B)。当培养至30 d时，不定芽长为1cm左右，长势好、且健壮(图3C)。经过愈伤组织及不定芽的生长培养，不定芽在壮苗培养时不易死亡，并且生长也迅速。因此，获得鸟王茶NW32下胚轴诱导的不定芽先进行生长培养有利于壮苗培养中不定芽苗的成活与生长。

不同生长调节剂配比对不定芽壮苗的影响

对于上述生长培养的不定芽先进行壮苗培养有利于促进生根培养，同时也有利于提高后期植株的移栽成活率。经过生长培养的不定芽的茎段明显，且容易从愈伤组织上切下用于下一步实验，芽苗还是较为弱小(图4A)，不能直接进行生根培养，否则会影响后期的移栽成活率。因此将鸟王茶NW32不定芽先接种至含有不同浓度的6-BA和IBA的MS基础培养基上进行壮苗培养。当6-BA浓度使用量不变的情况下，随着IBA浓度使用量的增加，不定芽的株高差差异不显著但每个处理组均对不定芽的生长有影响(表6)。培养45 d后，当6-BA浓度使用量为2.00 mg/L，IBA浓度使用量为0.80 mg/L时，鸟王茶NW32不定芽的株高差较高为1.57 cm，并且在其基部处又分化出丛生芽，植株长势好、叶片舒展、且生长健壮(图4B)。因此，在MS培养基中添加2.00 mg/L 6-BA和0.80 mg/L IBA较适合于鸟王茶NW32不定芽的壮苗培养。

表6不同生长调节剂配比对鸟王茶NW32不定芽壮苗的影响

注: 均值±标准偏差

表中的不同字母是在0.05水平下的显著性

不同浓度的IBA配比对不定芽生根的影响

生根培养是决定再生植株移栽至基质中能否成活的关键步骤。结果表明，不同浓度的IBA使用量对鸟王茶NW32不定芽的生根培养存在差异显著的影响(表7)。当培养60 d后，随着基础培养1/2MS中含有的IBA浓度的使用量不断增加，鸟王茶NW32不定芽的生根率先增加后降低，当IBA的浓度为1.50 mg/L时，不定芽生根率最高为87.78%，并且鸟王茶NW32不定芽的茎段开始木质化、叶片舒展、颜色变为深绿色，基部长出很多根，包括主根和侧根，其中部分侧根向培养基外伸长生长(图4C-D)。因此，较适合于鸟王茶NW32不定芽的生根培养的培养条件是先用50.00 mg/L IBA浸泡不定芽基部5 min，再在基础培养基1/2MS培养基中添加1.50 mg/L IBA。

表7不同浓度的IBA对鸟王茶NW32不定芽生根的影响

注: 均值±标准偏差

表中的不同字母是在0.05水平下的显著性

炼苗时间与移栽基质对再生植株培养的影响

鸟王茶NW32离体再生的不定芽较为弱小，经过壮苗及生根诱导培养后选择合适的炼苗时间与移栽基质是至关重要的。此外，由于再生芽苗不多，对于实验的次数有限，因而选择合适的炼苗时间和移栽基质是鸟王茶NW32不定芽存活的关键点。本研究在鸟王茶NW32离体快繁体系中获得较适的炼苗时间与移栽基质在移栽植株的成活率及长势方面均较好。因此直接采用其较适的条件对鸟王茶NW32再生的不定芽进行炼苗与移栽处理。炼苗5 d后，将鸟王茶NW32再生的不定芽再移栽至V_营养土: V_珍珠岩: V_蛭石＝2:1:1基质中进行培养。炼苗5 d后，鸟王茶NW32再生植株无杂菌污染，根部完好，且移栽至V_营养土:V_珍珠岩:V_蛭石＝2:1:1基质中培养60 d后植株的长势较好、且叶片舒展、5~6片(图4E)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S3、丛生芽的诱导及培养：将萌发诱导培养基上的鸟王茶NW32幼苗的下胚轴切下，并切成1 cm的小段外植体，然后接种至愈伤诱导及分化培养基上进行愈伤组织及不定芽分化诱导培养；

S4、丛生芽壮芽培养：待丛生芽长至2~3cm时，从愈伤组织将丛生芽上切下，下端斜切，接种至壮苗培养基中进行壮苗培养；

S5、生根：选择壮苗培养基中比较健壮，且高度在4 cm的芽苗，将其下端斜切，用IBA无菌溶液浸泡斜切部位，接种至生根培养基中进行生根培养；

2.如权利要求1所述的一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述步骤S1中，种子脱毒脱菌处理方法为：将采摘的种子置于添加有洗洁精的自来水中5 min，挑出漂浮在水面的种子，并搓掉种子表面的杂质，接着用5%多菌灵浸泡15 min,捞出，自来水冲洗干净，放入超净工作台，用75%的酒精消毒3 min，再用0.1%的升汞消毒15min，用无菌水冲洗5次，无菌的吸水纸吸去表面水分。

3.如权利要求1所述的一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述步骤S2中，萌发诱导培养基采用添加有1.5 mg.L^-1的GA3的MS基本培养基，pH=5.80，萌发培养基中培养45天。

4.如权利要求1所述的一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述的步骤S3中，愈伤诱导及分化培养基为添加有4.0 mg.L^-1的6-BA和1.0 mg.L^-1的IBA 的MS基本培养基，pH=5.80，分化培养基中培养60天。

5.如权利要求1所述的一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述的步骤S4中，壮苗培养基为添加有2.0 mg.L^-1的6-BA和0.8 mg.L^-1的IBA 的MS基本培养基，pH=5.80，壮苗培养基中培养45天。

6.如权利要求1所述的一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述的步骤S5中，IBA无菌溶液的浓度为50.0 mg.L^-1，生根培养基为添加有1.5mg.L^-1的IBA 的1/2 MS基本培养基，植株炼苗时间为5天。

7.如权利要求1所述的一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述植物组织培养各个阶段，培养条件均为光照强度为2000 lx，每日光照12小时，培养温度(26±2)℃。