CN112358529B - 多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗i型糖尿病药物中的应用 - Google Patents

多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗i型糖尿病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药及制药领域，本发明提供了一种多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用。本发明提供了一种多肽，所述多肽序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示，并提供了所述多肽的衍生物及其水凝胶。本发明提供的多肽及其衍生物和水凝胶制备工艺简单，产物化学结构明确，所用原料均为人体每天所必需的氨基酸，成本低、生物相容性好；所述多肽及其衍生物和水凝胶能够模拟胰岛素抗原表位，恢复对胰岛素抗原的免疫耐受性，对血糖的清除能力较高，保持血糖平稳在正常范围内，能够有效降低I型糖尿病的发病率。

Description

多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗I型糖 尿病药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药及制药领域，尤其涉及一种多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是21世纪全球最大的公共卫生事件之一。2015年最新统计数据显示，全球共有4.15亿成年人患有糖尿病，其中我国糖尿病患者人数超过1亿人，约占全国总人口的10％。在全球范围内，I型糖尿病的发病率逐年上升，每年约增加2～3％。有数据报道称中国过去的20年间，糖尿病的发病率呈现出年轻化的趋势，15岁以下的儿童青少年糖尿病发病率增长近4倍。由于I型糖尿病带来的严重的并发症及经济负担，国内病龄超过30年者仅有105例。由于糖尿病常伴有严重的并发症，I型糖尿病患者的平均预期寿命将减少10～15年。
I型糖尿病的免疫发病机制是由T细胞介导的对β细胞的攻击。异常活化的T细胞选择性地攻击自身具有胰岛素分泌功能的β细胞，随着这种自身免疫进程的进行，胰岛β细胞的数量大大减少，最终导致胰岛素分泌严重匮乏，从而出现葡萄糖代谢功能障碍。患者体内难以被利用的葡萄糖长期在血液中循环，随着时间的推移，血液中过高水平的葡萄糖造成身体中多种组织的损伤，引发累及心、肾、肝、神经、眼和其他重要器官的并发症。
目前治疗I型糖尿病的主流仍是补充外源性胰岛素。在过去的30年中，研究人员引入了多种胰岛素制剂，胰岛素类似物的发展、葡萄糖水平的自我监测、胰岛素泵和最近的用于葡萄糖监测的胰岛素传感器技术，使胰岛素的作用时间和效果都有了极大改善，进一步加强了对糖尿病患者的血糖控制。即便通过引入这些新式治疗理念，显著降低了继发性和慢性并发症的风险，但只有不到三分之一的患者最终能够达到预防继发性终末器官并发症(如视网膜、肾脏和神经***疾病)所需的临床护理目标。目前的胰岛素强化治疗方案根据已建立的算法注射或使用胰岛素泵，可建立持续皮下胰岛素输注(CSII)的模拟生理分泌模式，但在临床应用中仍然难以达到理想的效果。
I型糖尿病作为一种自身免疫性疾病，在过去的几十年里，其免疫疗法一直是基础和临床研究的焦点。β细胞的破坏机制作为免疫疗法的基础，亦得到了更深入的探讨。随着对糖尿病发病机制了解的加深，可以在人类I型糖尿病确诊之前，通过检测作为自身免疫发展的生物标志物的自身抗体预测糖尿病的发病风险，预防或逆转I型糖尿病自身免疫所需的胰岛素抗原表位被免疫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够模拟胰岛素抗原表位，恢复对胰岛素抗原免疫耐受性的多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多肽，所述多肽序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示；
所述如SEQ ID NO：1所示序列的结构式为：
Figure BDA0002775585680000021
所述如SEQ ID NO：2所示序列的结构式为：
Figure BDA0002775585680000022
所述如SEQ ID NO：3所示序列的结构式为：
Figure BDA0002775585680000031
本发明还提供了所述多肽的衍生物，所述衍生物是在所述多肽的N端连接封端基团。
优选的，所述封端基团为乙酰基。
优选的，所述封端基团是将含有芳环的化合物通过酰胺键连接到多肽的N端形成封端基团。
本发明还提供了一种所述衍生物的水凝胶，所述水凝胶的制备方法为：将所述衍生物置于缓冲液中，调节pH为6.0～8.0，加热溶解，冷却，即制得含有所述衍生物的水凝胶。
优选的，所述衍生物与缓冲液的质量体积比为1μg:0.8～1.2μL。
优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液，pH为5.0～9.0。
优选的，所述水凝胶为超分子水凝胶。
本发明还提供了所述的多肽、所述的衍生物或所述水凝胶在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用。
优选的，所述药物为注射剂或口服剂。
本发明提供的技术方案的有益效果至少包括：
1、本发明制备工艺简单，产物化学结构明确，所用原料均为人体每天所必需的氨基酸，可以通过固相合成的方法制得多肽衍生物；
2、所述多肽及其衍生物能够模拟胰岛素抗原表位，恢复对胰岛素抗原的免疫耐受性，通过腹膜内葡萄糖耐量实验，发现其对葡萄糖敏感性较好，对血糖的清除能力较高，胰岛功能没有受损，能够较好的应对血糖负荷，保持血糖平稳在正常范围内。
3、所述多肽及其衍生物形成的水凝胶有效降低I型糖尿病的发病率，维持血浆血糖值平稳。
附图说明
图1为NOD小鼠发病率曲线；
图2为NOD小鼠血糖值变化曲线；
图3为NOD小鼠的腹膜内葡萄糖耐量检测结果；
图4为NOD小鼠的脾脏中Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)的水平。
具体实施方式
本发明提供了一种多肽，所述多肽序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示；
所述如SEQ ID NO：1所示序列的结构式为：
Figure BDA0002775585680000041
所述如SEQ ID NO：2所示序列的结构式为：
Figure BDA0002775585680000042
所述如SEQ ID NO：3所示序列的结构式为：
Figure BDA0002775585680000043
在本发明中，如SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列是由Gly、Phe、Phe、Tyr四个氨基酸组成的多肽(GFFY)；如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列是由Phe、Phe两个氨基酸组成的二肽(FF)；如SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列是由Gly、Phe、Ala、Tyr四个氨基酸组成的多肽(GFAY)。其中GFFY和FF作为胰岛素B：9-23的特征肽段，可以模拟胰岛素抗原表位，恢复对胰岛素抗原的免疫耐受性。
本发明还提供了所述多肽的衍生物，所述衍生物优选在所述多肽的N端连接封端基团。
在本发明中，所述封端基团优选为乙酰基。
在本发明中，所述封端基团优选将含有芳环的化合物通过酰胺键连接到多肽的N端形成封端基团。
在本发明中，所述含有芳环的化合物优选为2-萘乙酸或2-(6-甲氧基-2-萘)丙酸，进一步优选为2-萘乙酸。
在本发明中，所述多肽或所述衍生物采用Fmoc-短肽固相合成方法合成。
本发明还提供了一种含有所述衍生物的水凝胶，所述水凝胶的制备方法为：将所述衍生物置于缓冲液中，调节pH为6.0～8.0，加热溶解，冷却，即制得含有所述衍生物的水凝胶。
在本发明中，所述衍生物与缓冲液的质量体积比优选为1μg:0.8～1.2μL，进一步优选为1μg:1μL。
在本发明中，所述缓冲液优选为PBS缓冲液，pH优选为5.0～9.0，进一步优选为6.0～8.0，再进一步优选为7.4。
在本发明中，将所述衍生物置于缓冲液中，优选将pH调节为6.0～8.0，进一步优选为7.4。
在本发明中，所述加热优选为加热至沸腾使所述衍生物完全溶解。
在本发明中，所述冷却优选为冷却至室温(25℃)。
在本发明中，所述水凝胶优选为超分子水凝胶。当溶液中所述多肽的衍生物的浓度达到毫摩尔级别时，可以形成超分子水凝胶。所谓超分子水凝胶由分子量小于2000的小分子化合物通过非共价键作用相互聚集，自组装得到网状结构并包裹水分子而形成的凝胶。本发明制备的水凝胶溶解性较好，均可以形成无色透明的水凝胶。
本发明还提供了所述多肽、所述多肽的衍生物或所述水凝胶在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用。
在本发明中，所述药物优选为注射剂或口服剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中所涉及制剂来源如下：
2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL；
N,N-二异丙基乙胺(以下用DIEPA表示)，购自阿达玛斯公司(Adamas)，纯度99％；
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度98％；
三氟乙酸(以下用TFA表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
三异丙基硅烷(以下用TIS表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，天津化学试剂公司；
N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)，天津化学试剂公司；
甲醇，天津康科德科技公司；
哌啶，天津化学试剂公司；
含体积百分比为20％的哌啶的DMF(20％哌啶+80％DMF)；
所有氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
萘乙酸购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
Insulin B:9-23，购自国肽生物，纯度99％；
NOD/ShiLtJNju小鼠，3周龄，雌性，购自南京大学-南京生物医药研究院。
实施例1
(1)多肽衍生物Nap-GDFDFDY的合成
本实施例提供了一种序列如SEQ ID NO：1所示多肽(Gly-D-Phe-D-Phe-D-Tyr，GDFDFDY)的衍生物，其结构式为：
Figure BDA0002775585680000071
该衍生物是在所述多肽的N端连接2-萘乙酸(Nap)作为封端基团，生成具有D构型的衍生物。为了方便描述，本发明中将该衍生物的D构型描述为Nap-GDFDFDY。
本实施例的多肽衍生物Nap-GDFDFDY采用Fmoc-短肽固相合成方法合成。具体步骤如下：
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
3)将0.75mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH)溶解在10mL的无水DCM里，加入0.75mmol的DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应1h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIEPA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应10min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-Phe-OH)1mmol、HBTU1.5mmol、DIEPA2mmol和10mL DMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH和封端基团(2-萘乙酸)；然后用DMF洗涤5遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
8)将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，制得Nap-GDFDFDY。
需要说明的是，步骤8)中“将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时”的步骤也可以通过将TFA与DCM的按照体积比1∶99配制成TFA体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min的操作来完成。
(2)本实施例多肽衍生物水凝胶的制备
取0.5mg的D构型短肽Nap-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，再分别加入500微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值均调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得Nap-GDFDFDY短肽水凝胶药物制剂。
实施例2
(1)多肽衍生物Nap-GFFY的合成
本实施例提供了一种序列如SEQ ID NO：1所示多肽(Gly-Phe-Phe-Tyr，GFFY)的衍生物，其结构式为：
Figure BDA0002775585680000081
该衍生物是在所述多肽的N端连接2-萘乙酸(Nap)作为封端基团，生成具有L构型的衍生物。为了方便描述，本发明中将该衍生物描述为Nap-GFFY或Nap-GLFLFLY。
本实施例的多肽衍生物Nap-GFFY采用Fmoc-短肽固相合成方法合成。具体步骤如下：
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
3)将0.75mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Tyr(OtBu)-OH)溶解在10mL的无水DCM里，加入0.75mmol的DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应1h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIEPA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应10min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Phe-OH)1mmol、HBTU1.5mmol、DIEPA2mmol和10mL DMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH和封端基团(2-萘乙酸)；然后用DMF洗涤5遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
8)将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，制得Nap-GFFY。
需要说明的是，步骤8)中“将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时”的步骤也可以通过将TFA与DCM的按照体积比1∶99配制成TFA体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min的操作来完成。
(2)本实施例多肽衍生物水凝胶的制备
取0.5mg的L构型短肽Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，再加入500微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值均调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得Nap-GFFY短肽水凝胶药物制剂。
实施例3
(1)多肽衍生物Nap-DFDF的合成
本实施例提供了一种序列如SEQ ID NO：2所示的多肽(D-Phe-D-Phe，DFDF)的衍生物，其结构式为：
Figure BDA0002775585680000101
并按照实施例1提供的Fmoc-固相合成方法制备得到短肽Nap-DFDF。
(2)取0.5mg Nap-DFDF置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入500微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得Nap-DFDF短肽水凝胶药物制剂。
实施例4
(1)多肽衍生物Ac-GDFDFDY的合成
本实施例提供了序列如SEQ ID NO：1所示多肽(Gly-D-Phe-D-Phe-D-Tyr，GDFDFDY)的衍生物，其结构式为：
Figure BDA0002775585680000111
该衍生物是在所述多肽的N端连接乙酸(Ac)作为封端基团，生成具有D构型的衍生物。为了方便描述，本发明中将该衍生物的D构型描述为Ac-GDFDFDY。并按照实施例1的Fmoc-固相合成方法合成Ac-GDFDFDY。
(2)取0.5mg的Ac-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入500微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得多肽溶液药物制剂。
实施例5
(1)多肽衍生物Nap-GDFDADY的合成
本实施例提供了一种序列如SEQ ID NO：1所示多肽(Gly-D-Phe-D-Ala-D-Tyr，GDFDADY)的衍生物，其结构式为：
Figure BDA0002775585680000112
该衍生物是在所述多肽的N端连接2-萘乙酸(Nap)作为封端基团，生成具有D构型的衍生物。为了方便描述，本发明中将该衍生物描述为Nap-GDFDADY。
本实施例的多肽衍生物Nap-GDFDADY采用Fmoc-短肽固相合成方法合成。具体步骤如下：
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
3)将0.75mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-Tyr(OtBu)-OH)溶解在10mL的无水DCM里，加入0.75mmol的DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应1h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIEPA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应10min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-D-Ala-OH)1mmol、HBTU1.5mmol、DIEPA2mmol和10mL DMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH和封端基团(2-萘乙酸)；然后用DMF洗涤5遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
8)将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯，制得Nap-GDFDADY。
需要说明的是，步骤8)中“将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时”的步骤也可以通过将TFA与DCM的按照体积比1∶99配制成TFA体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min的操作来完成。
(2)本实施例多肽衍生物水凝胶的制备
取Nap-GDFDADY置于1.5毫升的玻璃瓶中，再加入500微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值均调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得Nap-GDFDADY短肽溶液药物制剂。
对比例1
含铝佐剂的糖尿病疫苗Alum+InsulinB:9-23(即Alum+Ins29-23)的制备
(1)取1mg购自国肽生物的纯度为99％的Insulin B:9-23多肽置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，使其完全溶解，得到浓度为2.5mg/mL的Insulin B:9-23多肽溶液。
(2)取200mg/mL的铝佐剂62.5微升，用PBS溶液(pH＝7.4)定容至250微升，得到铝佐剂分散液。
(3)取2.5mg/mL的Insulin B:9-23多肽溶液200微升加入到(2)中制得的铝佐剂分散液，用PBS溶液(pH＝7.4)定容于500微升，进行物理混合，得到的混合物为含铝佐剂的糖尿病疫苗Alum+Insulin B:9-23。(最终铝佐剂的浓度为25mg/mL,Insulin B:9-23多肽的浓度为1mg/mL)。
对比例2
无菌1×PBS
称取8gNaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。用高压灭菌锅灭菌后，保存于室温(25℃)或4℃冰箱中。
实验例1免疫试验
3周龄的NOD小鼠在新的饲养环境下稳定一周后，从小鼠4周龄时随机分组，每组20只小鼠开始给予药物制剂，每次在腋窝部位皮下注射总体积为80μL 1mg/mL的Nap-GDFDFDY、Nap-GFFY、Nap-DFDF、Nap-GDFDADY、Ac-GDFDFDY、Alum+Insulin B:9-23，每周一次，Control组为注射80μL无菌1×PBS。连续给药5周后，从第11周开始，每周使用One
Figure BDA0002775585680000141
血糖仪(Lifescan，美国)测量一次血糖，血糖水平统计如图2。如果该值连续两天高于11.1mmol/L，则认为该动物患有糖尿病。并记录各组小鼠的发病情况、统计发病率，结果如图1。
从图1可以看出，截止到36周时Control组全部发病，且发病时间从第11周开始，而Nap-GDFDFDY组全程没有小鼠发病，Nap-GDFDADY、Nap-GFFY、Nap-DFDF、Ac-GDFDFDY、Alum+Insulin B:9-23组发病率分别为60％、60％、30％、30％、15％，且发病时间较Control组延后，最早是在第14周。结合图4小鼠脾脏中Treg细胞的水平，说明本发明提供的多肽及其衍生物和水凝能够降低小鼠Ⅰ型糖尿病的发病率，延迟小鼠Ⅰ型糖尿病发病时间。Nap-GDFDFDY组的发病率低于Nap-GDFDADY和Nap-DFDF表明GFFY氨基酸序列(如SEQ ID NO：1所示)的重要性。通过Nap-GDFDFDY、Nap-DFDF、Ac-GDFDFDY这三组的发病率明显低于Nap-GFFY可以看出，D构型多肽形成的水凝胶抑制发病率效果明显好于L构型多肽形成的水凝胶(本申请中虽然仅提供了Nap-GDFDFDY和Nap-GFFY组的D构型和L构型的实施例和实验例用以说明该问题，但是经过实验这样的现象在Nap-DFDF和Nap-FF、Ac-GDFDFDY和Ac-GFFY组中同样存在，因此得出D构型多肽在抑制发病率的效果上好于L构型多肽的结论)。Nap-GDFDFDY组的发病率低于Ac-GDFDFDY组可以看出，采用自组装形成的水凝胶好于未组装的多肽溶液。
从图2可以看出，从第11周开始Control组的血糖值开始逐渐缓慢上升，到第20周有所下降，然后从第25周开始血糖值快速上升，到第36周最终血糖值达到27mmol/L；而Nap-GDFDFDY组的血糖值始终平稳保持在7mmol/L；Nap-GDFDADY组的血糖值在第16周开始上升，从第20周开始下降，直至第26周后才保持平稳，到第36周最终血糖值达到12mmol/L；Ac-GDFDFDY组和Alum+Insulin B:9-23组的血糖值在第14周开始上升，从第24周开始下降，直至第25周后才保持平稳，到第36周最终血糖值达到7mmol/L；Nap-GFFY组的血糖值在第14周、第25周和第32周三次出现上升，有三次较大波动且36周最终血糖值为17mmol/L；Nap-DFDF在16周血糖值逐渐上升，在23周达到最高16mmol/L，随后下降，在第24周回归7mmol/L，并保持平稳。说明本发明提供的多肽及其衍生物和水凝胶能够较好的应对血糖负荷，对血糖具有较高的清除能力，维持血浆血糖平稳在一定水平，尤其是Nap-GDFDFDY多肽水凝胶始终保持血糖平稳在7mmol/L，具有较高的降血糖、维持血浆血糖平稳的能力。
实验例2葡萄糖耐量试验
3周龄的NOD小鼠在新的饲养环境下稳定一周后，从小鼠4周龄时随机分组，每组20只小鼠开始给予药物制剂，每次在腋窝部位皮下注射总体积为80μL 1mg/mL的Nap-GDFDFDY、Nap-GFFY、Nap-DFDF、Nap-GDFDADY、Ac-GDFDFDY、Alum+Insulin B:9-23，每周一次，Control组为注射80μL无菌1×PBS，连续给药5周。分别在小鼠14周龄时检测NOD小鼠的腹膜内葡萄糖耐量。在进行实验前，使小鼠过夜禁食8小时。预先称量小鼠体重，按照2g/kg的剂量腹腔注射无菌葡萄糖注射液(10％)。分别在注射后0、15、30、45、60、90、120分钟时使用
Figure BDA0002775585680000151
血糖仪(Lifescan，美国)检测尾静脉血糖浓度(葡萄糖氧化酶法)。从图3可以看出，所有组别均在15分钟时血糖值达到最高，Control组高达20mmol/L、Nap-GDFDFDY组不到15mmol/L，之后开始逐渐下降。在120分钟后Control组的血糖值仍然在15mmol/L左右，Nap-GFFY、和Nap-GDFDADY恢复到10mmol/L，Nap-DFDF和Ac-GDFDFDY恢复到7mmol/L左右，Nap-GDFDFDY和Alum+Insulin B:9-23组在30分钟后恢复到10mmol/L以下，90分钟后基本恢复到没注射葡萄糖之前的水平，大致为5mmol/L。说明本发明提供的多肽及其衍生物对葡萄糖敏感性较好，对血糖的清除能力较高，能够较好的应对血糖负荷，保持血糖平稳在正常范围内。
实验例3
3周龄的NOD小鼠在新的饲养环境下稳定一周后，从小鼠4周龄时随机分组，每组20只小鼠开始给予药物制剂，每次在腋窝部位皮下注射总体积为80μL 1mg/mL的Nap-GDFDFDY、Nap-GFFY、Nap-DFDF、Nap-GDFDADY、Ac-GDFDFDY、Alum+Insulin B:9-23，每周一次，Control组为注射80μL无菌1×PBS。连续给药5周。在小鼠周龄14周时，取各组小鼠的脾脏，研磨分散成单细胞，70μm滤网过滤，滤液进行梯度离心(800g/30分钟)。随后通过红细胞裂解液裂解去除红细胞。离心所得的淋巴细胞首先用anti-mouse CD4抗体和anti-mouse CD25抗体孵育过夜，再用Anti-mouse Foxp3抗体孵育30分钟后，进行流式分析。从图4可以看出，本发明提供的多肽水凝胶(Nap-GDFDFDY、Nap-GLFLFLY、Nap-DFDF)能够显著提高脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的水平，说明在多肽水凝胶的作用下，小鼠能够纠正小鼠自身的免疫，建立对自身抗原的免疫耐受性。此外，Alum+Insulin B:9-23组小鼠未能建立自身抗原的免疫耐受性，这也符合之前的报道和临床试验，铝佐剂治疗Ⅰ型糖尿病的作用机理是诱导T细胞由促炎的Th1转向抑炎的Th2，而不是引起免疫耐受。
由以上实施例可知，本发明提供的所述多肽及其衍生物和水凝胶能够有效降低Ⅰ型糖尿病的发病率，使NOD小鼠的糖尿病发作周期从11周延迟至14周，未发病比例提高到40％。并且能够很好的控制血糖水平；进一步通过腹膜内葡萄糖耐量实验，发现其对葡萄糖敏感性较好，对血糖的清除能力较高，能够较好的应对血糖负荷，保持血糖平稳在正常范围内。通过检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平，说明胰岛功能没有进一步受损，进一步表明本发明提供的多肽水凝胶能够纠正自身免疫，建立对自身抗原的免疫耐受性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> 多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Phe Tyr
1
<210> 2
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Phe
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Phe Ala Tyr
1

Claims (6)

1.一种多肽衍生物或所述多肽衍生物的水凝胶在制备预防和/或治疗I型糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述多肽衍生物为Nap-GDFDFDY、Nap-GFFY、Nap-DFDF或Nap-GDFDADY；
所述Nap-GDFDFDY的结构式为：
Figure FDA0003628999120000011
所述Nap-GFFY的结构式为：
Figure FDA0003628999120000012
所述Nap-DFDF的结构式为：
Figure FDA0003628999120000013
所述Nap-GDFDADY的结构式为：
Figure FDA0003628999120000014
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水凝胶的制备方法为：将所述多肽衍生物置于缓冲液中，调节pH为6.0～8.0，加热溶解，冷却，即制得含有所述多肽衍生物的水凝胶。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多肽衍生物与缓冲液的质量体积比为1μg:0.8～1.2μL。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液，pH为5.0～9.0。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水凝胶为超分子水凝胶。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂或口服剂。
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