CN107522772B - 短肽、其作为疫苗佐剂的应用及以所述短肽作为疫苗佐剂的疫苗 - Google Patents

短肽、其作为疫苗佐剂的应用及以所述短肽作为疫苗佐剂的疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种短肽、其作为疫苗佐剂的应用及以所述短肽作为疫苗佐剂的疫苗，所述短肽引入具有抗炎效果的封端基团，并且可以形成水凝胶，所述水凝胶简便地与抗原物理混合后不仅可有效增强抗原免疫应答的能力，并且用于预防性肿瘤疫苗中能完全抑制肿瘤的生长。所述短肽的序列为X‑GDFDFDY，其中X为Fbp或Car。

Description

短肽、其作为疫苗佐剂的应用及以所述短肽作为疫苗佐剂的 疫苗
技术领域
本发明涉及一种短肽、其作为疫苗佐剂的应用及以所述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。
背景技术
炎症微环境的建立对于肿瘤的发生和发展是必要的。在肿瘤发展的各个阶段，如发生，促进，恶变，入侵和转移中，炎症都扮演了重要的角色。最近的一些研究表明肿瘤相关的炎症能通过招募白细胞，表达促肿瘤细胞因子和趋化因子、诱导血管生成，明显地促进肿瘤发生和癌细胞存活。同时，这些肿瘤相关炎症也可以通过削弱免疫对肿瘤监视和免疫编辑来抑制针对肿瘤的免疫反应。因此，抑制肿瘤相关炎症对于激活抗肿瘤适应性免疫反应是十分重要的。最近Sousa课题组的一项研究表明：阿司匹林和免疫检查点治疗(anti-PD-1)的联合应用可以明显地加强免疫治疗的效果，因为阿司匹林能够抑制肿瘤炎症，使促肿瘤的微环境转变成抑制肿瘤的微环境，因此这提高了anti-PD-1的治疗功效。
短肽形成的水凝胶目前已经得到了极大的发展，它们在细胞的三维培养、药物释放、传感应用、癌细胞抑制、免疫调节方面显示出了极大的潜力。为了形成水凝胶，通常需要给短肽连接一个芳香族的封端基团。我们前期的研究发现芳香基团封端的四肽GDFDFDY形成的水凝胶是一种优良的疫苗佐剂，所述短肽水凝胶可以与抗原通过简单物理混合方法包裹抗原，大大提升抗体滴度。但是这些短肽水凝胶不具有抗炎效果，对于抗肿瘤预防及治疗作用并不明显。
阿司匹林结构中含有苯环，如果将阿司匹林结构作为封端基团引入短肽，所得短肽可以形成水凝胶，那么可能会具有抗炎效果，从而得到抗肿瘤的疫苗佐剂。然而，徐兵教授课题组的研究结果(Beilstein,J.Org.Chem.,2013,9,908-917)表明，以阿司匹林封端的短肽无法形成水凝胶，也就无法用于疫苗佐剂包裹各类抗原。
发明内容
发明目的
本发明的一个目的是提供一种短肽，引入具有抗炎效果的封端基团，并且可以形成水凝胶，所述水凝胶简便地与抗原物理混合后不仅可有效增强抗原免疫应答的能力，并且用于预防性肿瘤疫苗中能完全抑制肿瘤的生长。
本发明的另一个目的是提供所述短肽作为疫苗佐剂的应用。
本发明的另一个目的是提供以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。
发明概述
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种短肽，其序列为X-GDFDFDY，其中X为Fbp或Car。
“短肽”为本领域常用术语，指由3-9个氨基酸残基组成的短链肽。
具体的，X为Fbp时所述短肽的结构式如下：
Figure BDA0001372156800000021
X为Car时所述短肽的结构式如下：
Figure BDA0001372156800000022
所述短肽可采用公知的FMOC-固相合成方法合成。
根据本发明的第二方面，还提供了所述短肽作为疫苗佐剂的应用。
所述短肽作为疫苗佐剂应用时可选用多种物理形式，对其增强免疫应答的能力不会产生实质性影响，例如可以与水混合均匀后与抗原混合得到疫苗，或者，由于所述短肽具有良好的成胶性能，也可以以短肽水凝胶的形式进行应用，具体的，所述短肽的水混合物经加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。所述疫苗可以为蛋白疫苗。优选的，所述疫苗为抗肿瘤疫苗。作为本领域常识，所述短肽的水混合物应具备良好的生物相容性，因此，需要将短肽与具有良好生物相容性的水溶液混合得到所述短肽的水混合物。常见的，所述具有良好生物相容性的水溶液可以是生理盐水或PBS溶液。这种疫苗制备方法简单实用、成分可控。所述形成水凝胶的加热冷却方法为公知方法，具体为：使用电吹风或者油浴锅等加热装置加热短肽的水混合物至短肽完全溶解(一般需要加热到90℃以上)，冷却之后形成凝胶(一般冷却至20-40℃即可)。成胶与否通过倒置瓶子的方法判断，保留在瓶子底部为水凝胶，如果是流动的则为液体。
在本发明的第三方面，还提供了一种以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。所述短肽可以方便地与抗原物理混合得到疫苗。优选所述短肽与水混合后经加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。所述疫苗可以为蛋白疫苗。优选的，所述疫苗为抗肿瘤疫苗(如预防性肿瘤疫苗或治疗性肿瘤疫苗)。所述短肽的用量可以由本领域技术人员经简单实验确定，一般用于蛋白疫苗时，所述短肽与抗原的质量比为5:1-30:1，更优选为5:1-20:1。
发明人发现，上述短肽可以作为疫苗佐剂来增强抗原的免疫原性，使得主体发生强烈的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答，通过以Fbp和Car作为封端基团使多肽水凝胶具备了额外的抗炎效果，抗肿瘤效果在现有免疫治疗技术领域取得了令人惊讶的进展，尤其在预防性肿瘤疫苗中能完全抑制肿瘤的发生(这比我们前期发现的疫苗佐剂，即芳香基团封端的四肽GDFDFDY，在抗肿瘤疫苗效价更优越)。所述短肽易于制备、成份单一可控。
本发明增加了免疫佐剂的种类，为开发能应用于肿瘤的免疫佐剂以及抗肿瘤疫苗提供了有价值的信息。
附图说明
图1：蛋白疫苗OVA、Alum-OVA、vac-1、vac-2、vac-3引发免疫反应的抗体滴度；
图2：PBS,OVA,vac-1、vac-2、vac-3针对于B16-OVA肿瘤的预防性免疫效果；
图3：PBS,OVA,vac-1、vac-2、vac-3针对于EG7-OVA肿瘤的治疗性免疫效果。
具体实施方式
下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发明。
以下实施例中，通过本领域常用的倒置小瓶的方法检验水凝胶的形成与否。
以下实施例中所涉及制剂来源如下：
培养基，RMPI 1640，购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；
胎牛血清，购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；
2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL；
N,N-二异丙基乙胺(以下用DIEPA表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
三氟乙酸(以下用TFA表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
三异丙基硅烷(以下用TIS表示)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
D构型氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
无内毒素的鸡卵清蛋白(以下简称OVA蛋白)购自InvivoGen公司，纯度99％；
氢氧化铝佐剂(以下简称铝佐剂)购自赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific)，纯度99％；
萘乙酸购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
氟苯布洛芬、卡洛芬购自阿拉丁化学试剂有限公司(Aladdin)，纯度99％。
癌细胞B16-OVA，购自上海歌凡生物，并按以下步骤培养：
1)把水浴锅提前升温至37℃，将培养基、血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超净台紫外灯照射半小时；
2)从液氮罐中取出冻存的癌细胞B16-OVA，迅速放置在37℃的水浴锅中使细胞解冻，之后迅速转移到超净台里进行如下操作：把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中，离心5分钟，去上清，用含有10％胎牛血清的培养基重悬，转移到含有10％胎牛血清的培养基的培养皿中，然后放入37℃培养箱中培养；
3)第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后进行下面的实验；
4)收集细胞培养液，吸入到离心管中，1000rpm转速下离心4min，之后弃掉溶液，加入新鲜的培养基用枪吹打均匀，用细胞计数板计数为5×107个每毫升。
癌细胞EG7-OVA，购自上海歌凡生物，并按以下步骤培养：
1)把水浴锅提前升温至37℃，将培养基、血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超净台紫外灯照射半小时；
2)从液氮罐中取出冻存的癌细胞EG7-OVA，迅速放置在37℃的水浴锅中使细胞解冻，之后迅速转移到超净台里进行如下操作：把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中，离心5分钟，去上清，用含有10％胎牛血清和0.4mg/mL G418的培养基重悬，转移到含有10％胎牛血清和0.4mg/mL G418的培养基的培养皿中，然后放入37℃培养箱中培养；
3)第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后进行下面的实验；
4)收集细胞培养液，吸入到离心管中，1000rpm转速下离心4min，之后弃掉溶液，加入新鲜的培养基用枪吹打均匀，用细胞计数板计数为5×107个每毫升。
其余试剂均为市售分析纯试剂。
所述OVA蛋白溶液为自制，将OVA蛋白溶于PBS溶液(pH＝7.4)得到5mg/mL的OVA蛋白溶液。
制备实施例1
pH 7.4和室温20℃下短肽水凝胶负载OVA蛋白的疫苗vac-1的制备
(1)用FMOC-固相合成方法合成D构型短肽Fbp-GDFDFDY，结构式如下：
Figure BDA0001372156800000061
具体步骤如下：
1)称取0.5mmol 2-cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃5min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从装有2-Cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
3)将0.75mmol Fmoc保护的氨基酸溶解在10mL的无水DCM里，加入0.75mmol的DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应1h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，每次1min，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM∶DIEPA∶甲醇＝17∶1∶2的溶液20mL，在室温下反应10min；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间1min，共洗5次，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸1mmol、HBTU 1.5mmol、DIEPA 2mmol和10mlDMF，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入需要的氨基酸或封端基团(氟苯布洛芬)；然后用DMF洗涤5遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
8)按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应半小时(或者TFA与DCM的体积比为1∶99，配制成体积百分比浓度为1％的TFA溶液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为1min)，把产物从2-cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯。
它的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.22(s,1H),8.32–7.90(m,4H),7.25(ddd,J＝79.3,44.2,8.3Hz,19H),6.66(d,J＝6.8Hz,2H),4.61–4.33(m,3H),3.82–3.54(m,3H),3.05–2.63(m,6H),1.33(d,J＝6.3Hz,3H).
(2)取1mg D构型短肽Fbp-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
(3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到(2)中制得的水凝胶中，用PBS溶液(pH＝7.4)定容于500微升，进行物理混合，静置3分钟后成胶，得到蛋白疫苗vac-1(最终短肽的浓度为2mg/mL,OVA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
制备实施例2
pH 7.4和室温20℃下短肽水凝胶Car-GDFDFDY负载OVA蛋白的疫苗vac-2的制备
(1)用FMOC-固相合成方法合成D构型短肽Car-GDFDFDY，结构式如下：
Figure BDA0001372156800000071
具体步骤如制备实施例1所述，封端基团为卡洛芬。
它的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.32(s,1H),9.19(s,1H),8.56–8.30(m,2H),8.20–7.96(m,3H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.51–7.30(m,3H),7.26–7.01(m,11H),6.89(t,J＝6.3Hz,2H),6.65(d,J＝8.3Hz,2H),4.62–4.35(m,3H),3.83–3.41(m,4H),2.98(dd,J＝9.7,4.0Hz,1H),2.78–2.56(m,3H),2.33(t,J＝11.5Hz,1H),1.35(d,J＝5.8Hz,3H).
(2)取1mg Car-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
(3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到(2)中制得的水凝胶中，用PBS溶液(pH＝7.4)定容于500微升，进行物理混合，静置5分钟后成胶，得到蛋白疫苗vac-2(最终短肽的浓度为2mg/mL,OVA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
对比制备例1
取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升，用PBS溶液(pH＝7.4)定容至500微升，得到不含佐剂的蛋白疫苗OVA(最终OVA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
对比制备例2
(1)取40mg/mL的铝佐剂62.5微升，用PBS溶液(pH＝7.4)定容至250微升，得到铝佐剂分散液。
(2)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到(1)中制得的铝佐剂分散液，用PBS溶液(pH＝7.4)定容于500微升，进行物理混合，得到的混合物为含铝佐剂的蛋白疫苗Al-OVA。(最终铝佐剂的浓度为5mg/mL,OVA蛋白浓度为0.2mg/mL)
对比制备例3
pH 7.4和室温20℃下短肽水凝胶Nap-gel的制备
(1)用FMOC-固相合成方法合成短肽Nap-GDFDFDY，结构式如下：
Figure BDA0001372156800000091
(2)取1mg Nap-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH＝7.4)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
(3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到(2)中制得的水凝胶中，用PBS溶液(pH＝7.4)定容于500微升，进行物理混合，静置8分钟后成胶，得到蛋白疫苗vac-3(最终短肽的浓度为2mg/mL,OVA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
对比制备例4
无菌1×PBS
免疫实施例1
(1)小鼠第一次免疫
取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2和对比制备例3中制得的蛋白疫苗vac-1、vac-2、OVA、Al-OVA和vac-3以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
(2)小鼠第二次免疫
在第14天的时间点，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2和对比制备例3中制得的蛋白疫苗vac-1、vac-2、OVA、Al-OVA和vac-3以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
(3)抗体滴度的测量
在第21天的时候取小鼠血清，使用BioTek酶标仪，用ELISA的方法进行相应抗体滴度的测量。结果如图1所示。
(4)结果分析
从图1中的结果看出：其中IgG代表总的抗体滴度；IgG1是其中一个分型，表示体液免疫应答；IgG2a和IgG2b也是其中一个分型，表示细胞免疫水平。与不含佐剂的OVA蛋白对照组疫苗(对比制备例1)对比，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-1)可提高IgG抗体滴度1476倍，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-2)可提高929倍，而使用铝佐剂的对照组疫苗(Al-OVA)仅可提高125倍，使用水凝胶佐剂的对照组疫苗(vac-3)提高446倍；与不含佐剂的OVA蛋白对照组疫苗(对比制备例1)对比，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-1)可提高IgG1抗体滴度2844倍，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-2)可提高2844倍，而使用铝佐剂的对照组疫苗(Al-OVA)仅可提高133倍，使用水凝胶佐剂的对照组疫苗(vac-3)仅可提高867倍；与不含佐剂的OVA蛋白对照组疫苗(对比制备例1)对比，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-1)可提高IgG2a抗体滴度16倍，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-2)可提高13倍，而使用铝佐剂的对照组疫苗(Al-OVA)仅可提高3倍，使用水凝胶佐剂的对照组疫苗(vac-3)仅可提高9倍；与不含佐剂的OVA蛋白对照组疫苗(对比制备例1)对比，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-1)可提高IgG2b抗体滴度155倍，使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗(vac-2)可提高91倍，而使用铝佐剂的对照组疫苗(Al-OVA)仅可提高4倍，使用水凝胶佐剂的对照组疫苗(vac-3)仅可提高74倍。
免疫实施例2
针对于B16-OVA肿瘤的预防性免疫实验：
(1)小鼠第一次免疫：
取6-8周的C57BL/6J小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例3和对比制备例4中制得的疫苗vac-1、vac-2、OVA、vac-3、PBS，以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
(2)小鼠第二次免疫
在第14天的时间点，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例3、对比制备例4中制得的疫苗vac-1、vac-2、OVA、vac-3和PBS，以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
(3)肿瘤接种
在第21天向每只C57BL/6J小鼠的右背部皮下注射50μL包含5×105个B16-OVA细胞的无菌PBS，并以此时间点记录为接种肿瘤或肿瘤生长的第0天。随着肿瘤生长，在小鼠背部出现肉眼可见的肿瘤，从接种肿瘤的第6天，肿瘤体积到100mm3左右时，开始记录肿瘤大小，每3天测量肿瘤体积一次，直到接种肿瘤的第24天，以此评价肿瘤抑制效果。测试方法如下：用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长(最长径)和宽(垂直于最长径方向的宽度)，肿瘤体积按照公式【(长×宽×宽)/2】计算。结果如图2所示，其中横坐标是指接种肿瘤后的天数。
(4)结果分析
根据图2的结果，在本次针对B16-OVA肿瘤的实验中，相对于PBS组，未加佐剂的OVA蛋白组只是稍微抑制了肿瘤生长，使用无抗炎作用的水凝胶佐剂的对照组疫苗vac-3明显地抑制了肿瘤的生长，而使用本发明水凝胶佐剂的实验组疫苗vac-1和vac-2中的所有小鼠自始至终都没有肿瘤的发生。在这一肿瘤预防性实验中，本发明的水凝胶佐剂组疫苗展现了明显地抑制肿瘤发生的特点。运用这一策略，可以有效的消除肿瘤的发生。
免疫实施例3
针对于EG7-OVA肿瘤的治疗性免疫实验：
(1)肿瘤接种和免疫治疗：
在第0天给每只C57BL/6J的右背部皮下注射50μL包含5×105个EG7-OVA细胞的无菌PBS。在第8天，当肿瘤体积长到大约100mm3时，开始测量肿瘤大小，每2天测量肿瘤大小一次，直到接种肿瘤的第20天，以此评价肿瘤抑制效果。在第8天和第14天分别进行两次疫苗接种(每次取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例3、对比制备例4中制得的疫苗vac-1、vac-2、OVA、vac-3和PBS，以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射)。肿瘤记录肿瘤体积测试方法如下：用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长(最长径)和宽(垂直于最长径方向的宽度)，肿瘤体积按照公式【(长×宽×宽)/2】计算。结果如图3所示，其中横坐标是指接种肿瘤后的天数。
(2)结果分析
根据图3所示，在此以EG7-OVA肿瘤为模型的实验中，相对于PBS组，未加佐剂的OVA蛋白组对肿瘤基本没有抑制效果，使用水凝胶佐剂的对照组疫苗vac-3对肿瘤的抑制率大约为50％，而使用本发明水凝胶佐剂的实验组vac-1和vac-2对肿瘤抑制率大约为75％，并且其中个别小鼠的肿瘤达到完全的消除。在这一免疫治疗实验中，本发明水凝胶组比对照水凝胶组能够更有力地抑制肿瘤的生长。这种使用本发明水凝胶辅助免疫治疗的方法，比单纯的使用免疫佐剂的方法拥有更大的优势。而且利用本发明水凝胶佐剂的方法，可以同时起到降低肿瘤相关的炎症和刺激CD8+T细胞免疫反应的双重作用，使治疗更加简单高效。

Claims (7)

1.一种短肽，其序列为X-GDFDFDY，其中X为Fbp或Car。
2.权利要求1所述短肽作为疫苗佐剂的应用，所述疫苗为抗肿瘤疫苗。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述短肽的水混合物经加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗原为OVA。
5.以权利要求1所述短肽作为疫苗佐剂的疫苗，所述疫苗为抗肿瘤疫苗。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述短肽与水混合后经加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。
7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述抗原为OVA。
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